专利名称：肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及融合蛋白，具体涉及编码包含肝细胞生长因子受体(cMet)活性基团和 Fc片段的融合蛋白及其编码DNA。
背景技术：
肝细胞生长因子(h印atocyte growth factor，HGF)，又称扩散因子(scatter factor，SF)，是由一条α重链(相对分子量为69kDa)和一条β轻链(相对分子量为34kDa) 组成的异二聚体。HGF是一种刺激肝细胞增生的有丝分裂原，对肝切除或化学损伤后的肝细胞再生起重要作用。HGF能刺激多种类型细胞分化、增殖、再生、运动及形态的改变，是一种多功能的细胞因子。HGF的受体即肝细胞生长因子受体(cMet)，是1984年Cooper等从NIH3T3细胞中克隆出的一种原癌基因(Proto-Oncogen)，突变可成为一个致癌基因，引发癌症；cMet是由相对分子质量为50kDa的α亚单位和相对分子质量为145kDa的β亚单位通过二硫键连接而形成的一个相对分子质量为190kDa的异二聚体，其中β亚单位C-末端具有酪氨酸激酶功能和若干调节其受体活性的自身磷酸化功能；当cMet与HGF结合后，可快速转移到细胞核，通过钙离子通道传递信息，激活细胞功能，促进细胞组织增长，重生和正常组织结构的重组；并能参与癌症细胞侵润性生长，导致肿瘤细胞侵入周围组织内生长，穿透脏器， 组织层，最终扩展到全身。肝细胞生长因子(HGF)及其受体酪氨酸激酶肝细胞生长因子受体(cMet)已成为肿瘤生长和血管生成的关键因素，肝细胞生长因子(HGF)的表达和在肿瘤细胞的分泌会激活cMet，诱导肿瘤细胞的增殖，迁移，侵袭，减少人体对肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞抑制； 肝细胞生长因子受体(cMet)会激活肿瘤血管内皮细胞，诱导细胞外基质降解、小血管形成及体内血管新生；在动物实验肿瘤模型中，cMet和肝细胞生长因子可导致动物的肿瘤细胞生长和血管新生。肝细胞生长因子(HGF)和肝细胞生长因子受体(cMet)在肿瘤中的表达经常与肿瘤的分级程度、肿瘤血管密度密切相联，但是其预后差。肺癌在西方国家是排第一位引起人类死亡的肿瘤，80%新诊断的肺癌是非小细胞型(NSCLC)。多数非小细胞型肺癌病人发现时为癌症后期或转移性肿瘤，无法手术切除；其五年成活率很低，化疗是对非小细胞型肺癌后期和转移型的主要的治疗方法。临床对2714 个肺癌病人的研究发现，在开始的12个月内，化疗只对9%的病人有明显的效果。因此，化疗对多数肺癌病人无明显的改善。研究发现肝细胞生长因子受体(cMet)大量表达在非小细胞型肺癌细胞中，对其的药物可能可用于非小细胞型肺癌的治疗。近年来，通过对肿瘤分子生物学和肿瘤发病机理的进一步研究和了解，从而发现了多个潜在的肿瘤分子靶点目标，其可用于新颖的肿瘤靶向定点(Targeted)治疗。这些治疗可抑制肿瘤发展过程的信息传递通道，这些通道只在肿瘤细胞中可激活，但正常细胞将不会被激活。利用肿瘤特定靶点目标(Targeted)治疗法治疗肿瘤比常规的细胞毒类药物的治疗对正常细胞的毒性小，更易被人体接受。表皮生长因子(EGF)受体抑制剂，表皮生长因子受体(EGFR)单克隆抗体，酪氨酸激酶抑制剂和抗血管增生类制剂最近在肿瘤治疗中显示明显的优势，利用肿瘤细胞特定的单克隆抗体(如EGFR)进行肿瘤的靶向治疗，取得了较好的效果。对HGF的抑制使得肿瘤生长和肿瘤血管的生成受到抑制。目前已经开发出了许多 HGF调节剂(包括抗体)来治疗涉及HGF活性的多种紊乱，如某些HGF响应的癌症。中国专利文献 CN101460521A(申请号 200780020154. 5，申请日 2007.6. 1)公开了肝细胞生长因子(HGF)的结合蛋白质，该结合蛋白质包含结构⑶RLl-⑶RL2-⑶RL3D的免疫球蛋白轻链可变区及3个互补性决定区的免疫球蛋白重链可变区；所述结合蛋白质抑制 HGF与其同源受体结合，由此中和了 HGF的活性；当施用至哺乳动物时，所述的结合蛋白质能够抑制或减少哺乳动物中肿瘤的生长。当然，我们还需要其他类型的抑制剂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可高效、特异地与肝细胞生长因子(HGF) 结合的肝细胞生长因子受体(cMet)的融合蛋白。实现本发明目的的技术方案是一种肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白，由来自肝细胞生长因子受体的直接作为功能基团的活性基团与人免疫球蛋白Fc片段构成， 或者由来自肝细胞生长因子受体的活性基团经组合后的功能基团与人免疫球蛋白Fc片段构成，其中肝细胞生长因子受体的功能基团在氮端，人免疫球蛋白Fc片段在碳端；所述肝细胞生长因子受体的活性基团包括kma蛋白活性基团、MRS蛋白活性基团和IPT蛋白活性基团；所述活性基团经组合后的功能基团包括复数个相同的活性基团组合而成的功能基团以及其中2 3种活性基团单个或复数个任意组合而成的功能基团；
所述肝细胞生长因子受体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 14所述，肝细胞生长因子受体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 15所述；
肝细胞生长因子受体的义脆蛋白活性基团的核苷酸序列如上述序列表中SEQ ID NO. 14中1-1546核苷酸序列所述，肝细胞生长因子受体的kma蛋白活性基团的氨基酸序列如上述序列表中SEQ ID NO. 15中1-516氨基酸序列所述；
肝细胞生长因子受体的MRS蛋白活性基团的核苷酸序列如上述序列表中SEQ ID NO. 14 中1M7-1686核苷酸序列所述，肝细胞生长因子受体的MRS蛋白活性基团的氨基酸序列如上述序列表中SEQ ID N0. 15中517-772氨基酸序列所述；
肝细胞生长因子受体的IPT蛋白活性基团的核苷酸序列如上述序列表中SEQ ID N0. 14 中1687-2796核苷酸序列所述，肝细胞生长因子受体的IPT蛋白活性基团的氨基酸序列如上述序列表中SEQ ID N0. 15中773-932氨基酸序列所述。上述肝细胞生长因子受体的活性基团经组合后的功能基团为由kma蛋白活性基团、MRS蛋白活性基团和IPT蛋白活性基团依次首尾相连而构成的功能基团，或者为MRS蛋白活性基团和IPT蛋白活性基团首尾相连而构成的功能基团，或者为义脆蛋白活性基团和 MRS蛋白活性基团首尾相连而构成的功能基团，或者为2 3组kma蛋白活性基团和MRS 蛋白活性基团依次首尾相连而构成的功能基团。上述人免疫球蛋白为hlgGl，其Fc片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 11所述，其Fc片段的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 12所述。上述功能基团由kma蛋白活性基团、MRS蛋白活性基团与IPT蛋白活性基团组合而成时，功能基团与人免疫球蛋白Fc片段构成的融合蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO. 1所述，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2所述。上述功能基团由义脆蛋白活性基团与MRS蛋白活性基团组合而成时，功能基团与人免疫球蛋白Fc片段构成的融合蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID N0.3所述，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 4所述。上述功能基团由两组kma蛋白活性基团与MRS蛋白活性基团组合而成时，功能基团与人免疫球蛋白Fc片段构成的融合蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID N0.5所述，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 6所述。上述功能基团由MRS蛋白活性基团与IPT蛋白活性基团组合而成时，功能基团与人免疫球蛋白Fc片段构成的融合蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID N0. 7所述，氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0. 8所述。上所述功能基团为IPT蛋白活性基团时，功能基团与人免疫球蛋白Fc片段构成的融合蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID N0. 9所述，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 10所述。上述的肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白与肝细胞生长因子结合。上述的肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明具有积极的效果(1)本发明的肝细胞生长因子受体的融合蛋白具有与肝细胞生长因子结合的能力；所述融合蛋白质可高效、特异地与肝细胞生长因子结合，从而阻止肝细胞生长因子与肿瘤细胞的受体结合。(2)由于肝细胞生长因子受体活性基团的多样性，因此通过单个或多个受体活性基团的组合，而得到具有不同亲和力和药物代谢动力学的融合蛋白。(3)由于本发明的肝细胞生长因子受体的融合蛋白的组成是来源于人体本身的蛋白质，因此使用时可减少自身免疫反应。
图1为肝细胞生长因子受体的结构模式图，其中N-氨基端，SEMA-kma蛋白活性基团(斯玛域)，MRS-MRS蛋白活性基团(原癌基因)，IPT-IPT蛋白活性基团(免疫球蛋白类地区plexins和转录因子)，TM-跨膜蛋白域，KD-激酶域，CT-羧基端尾部，C-羧基端。图2为本发明的融合蛋白的结构示意图，其中(a)是实施例1的SMI-Fc融合蛋白的结构示意图；(b)是实施例2的SM-Fc融合蛋白的结构示意图；(c)是实施例3的SM2-Fc 融合蛋白的结构示意图；(d)是实施例4的MI-Fc融合蛋白的结构示意图；(e)是实施例5 的IPT-Fc融合蛋白的结构示意图。图3为实施例7肝细胞生长因子与本发明融合蛋白结合的反应过程示意图。图4为实施例7分子表达的肝细胞生长因子受体融合蛋白的活性检测结果。
具体实施例方式本发明设计并构建了一种由肝细胞生长因子受体(cMet)的功能基团与人免疫球蛋白Fc片段构成的融合蛋白，肝细胞生长因子受体(cMet)的功能基团为肝细胞生长因子受体的活性基团或者为由各活性基团经任意组合后得到的功能基团。肝细胞生长因子受体(cMet)的结构模式图如图1所示，cMet的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 14所述，肝细胞生长因子受体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 15所述。所述肝细胞生长因子受体(cMet)的活性基团包括kma蛋白活性基团、MRS蛋白活性基团和IPT蛋白活性基团。cMetWkma蛋白活性基团的核苷酸序列如上述序列表中SEQ ID NO. 14中1-1546 核苷酸序列所述，肝细胞生长因子受体的^ma蛋白活性基团的氨基酸序列如上述序列表中SEQ ID NO. 15中1-516氨基酸序列所述。cMet的MRS蛋白活性基团的核苷酸序列如上述序列表中SEQ ID NO. 14中 1547-1686核苷酸序列所述，肝细胞生长因子受体的MRS蛋白活性基团的氨基酸序列如上述序列表中SEQ ID N0. 15中517-772氨基酸序列所述。cMet的IPT蛋白活性基团的核苷酸序列如上述序列表中SEQ ID N0. 14中 1687-2796核苷酸序列所述，肝细胞生长因子受体的IPT蛋白活性基团的氨基酸序列如上述序列表中SEQ ID N0. 15中773-932氨基酸序列所述。融合蛋白中的Fc来自人免疫球蛋白IgGl，也可以是亚型IgG2、IgG3、IgG4，或者人免疫球蛋白IgE、IgM和IgA。人类免疫球蛋白Fc片断可改善cMet活性基团融合蛋白在体内的降解速度，延长融合蛋白质在体内的存活时间(PK T1/2，半衰期)和改进免疫原性。本发明的融合蛋白是由不同长度的cMet功能基团的cDNA序列和人免疫球蛋白 IgGFc的cDNA序列通过PCR扩增，并将其相互连接后，分别克隆到载体中，构建成表达受体-IgG融合蛋白，所用载体可以是分子生物学常用的质粒、病毒或其他载体。本发明融合蛋白的N -端蛋白序列含有不同长度的cMet功能基团，而C -端蛋白序列含有IgG-Fc片段。本发明描述的cMet功能基团与人免疫球蛋白Fc的融合蛋白及其编码的DNA可以通过常规的基因重组技术所构建，具体实验步骤如《分子克隆》第三版(Joseph Sambrook, 科学出版社)及类似的实验手册所记载。(实施例1、SMI-Fc融合蛋白的基因序列及其制备)
本实施例所构建的SMI-Fc融合蛋白的结构见图2(a)。SMI-Fc融合蛋白由kma蛋白活性基团、MRS蛋白活性基团和IPT蛋白活性基团依次首尾相连而构成的功能基团和人免疫球蛋白hlgGl-Fc融合而成。SMI-Fc融合蛋白基因是由上述kma蛋白活性基团、MRS蛋白活性基团、IPT蛋白活性基团和hlgGl-Fc的基因片段通过聚合酶链式反应(PCR)扩增而得。进行PCR扩增时，PCR引物cMetlF和cMet2RL以及cMet核酸模板(核苷酸序列见SEQ ID N0. 14)，PCR引物cMet2FL和hlgGFcRevl以及人免疫球蛋白重链核酸模板(核苷酸序列见SEQ ID N0. 11)先分别进行第一次PCR扩增而获得两个PCR产物；然后PCR引物cMetlF和hlgGFcRevl以第一次扩增获得的两个PCR产物为模板进行第二次PCR扩增， 使两个PCR产物相互连接成一个PCR产物，扩增产物克隆在pcDNA3. 1表达载体质粒上；其中 PCR 引物 cMetlF 的核苷酸序列为 5' -caccatgaaggcccccgctgt,PCR 引物 cMet2RL 的核苷酸序列为 5' -ggaagaggaagactgacggtgtgaaattctgatctgggtgaa,PCR 弓 |物 cMet2FL 的核苷酸序列为 S'-ttcaaccagatcagaatttcacaccgtcagtcttcctcttcchPCR 引物 hlgGFcRevl 的
5' _Cg￡UattC￡lttt￡lCCCgggg￡lC￡lggg￡lg￡lggCt0上述各聚合酶链式反应在96孔PCR板上进行，反应总体积为50 μ L。在反应孔中加入25 μ L含Taq酶、dNTP、Taq酶缓冲液及氯化镁等的PCR反应混合液(Promega，USA), 2 μ L的浓度为10 μ M的对应模板DNA，0. 5 μ L的浓度为50 μ M的对应正向和反向引物；然后加无菌去离子水至50 μ L0聚合酶链反应条件94 ！下2分钟一次，94°C下1分钟、55°C 下1分30秒、70°C下3分钟，循环30次，最后延伸72°C下10分钟；反应板保存在4°C下直至结果分析。PCR反应产物运行凝胶，检查PCR产物的大小和浓度；将正确的PCR产物用刀切下产物斑纯化，以用于后继的PCR反应或分子克隆。将纯化后的PCR产物克隆在pcDNA3. lD/V5-His-T0P0表达载体质粒上 (Invitrogen公司，加利福尼亚州)将3 μ L PCR产物与1 μ L盐溶液，加无菌水至终体积为 5 μ L，加入1 μ L pcDNA3. 1D/V5-His载体混合物，轻轻混勻，在室温下孵育30分钟；将2 μ L 克隆连接后的载体质粒与50 μ L化学处理后的Τ0Ρ10大肠杆菌混合，轻轻混勻，在冰上孵化30分钟，在42°C条件下热休克细胞30秒后立即将试管放在冰上；加入250 μ L的室温 S.O.C.培养液，在37°C颤抖孵育1小时；接种事先预热的50-200 μ L细菌混合液，具有选择性抗菌素的细菌培养板在37°C培养过夜。对单个克隆的细菌用PCR检测是否含有正确的DNA产物，并进行核苷酸序列分析； 对含有正确的核苷酸序列的细菌克隆增殖、扩增，克隆纯化后的表达载体质粒受体-IgG融合蛋白质DNA将用于感染中国仓鼠卵巢细胞(CH0)，通过抗菌素的筛选，用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清液是否有表达的蛋白质基因产物，寻找可持续稳定，高浓度表达cMet 融合蛋白的单个细胞株用于蛋白质的表达和生产。SMI-Fc融合蛋白的核苷酸序列见SEQ ID NO. 1。SMI-Fc融合蛋白核酸由3似9个核苷酸组成，其中前1-2796个核苷酸来源于cMet的kma蛋白活性基团、MRS蛋白活性基团和IPT蛋白活性基团，2797-34 是人免疫球蛋白IgG Fc的核苷酸序列。SMI-Fc融合蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO. 2。SMI-Fc融合蛋白含有1142个氨基酸，其中前1-932氨基酸来源于cMet的kma蛋白活性基团、MRS蛋白活性基团和IPT蛋白活性基团，933-1142是人免疫球蛋白IgG Fc的氨基酸序列(含210氨基酸)。(实施例2、SM-Fc融合蛋白的基因序列及其制备)
本实施例所构建的SM-Fc融合蛋白的结构见图2(b)。SM-Fc融合蛋白由cMet的kma 蛋白活性基团和MRS蛋白活性基团首尾相连而构成的功能基团和人免疫球蛋白hlgGl-Fc 融合而成。SM-Fc融合蛋白基因是由上述kma蛋白活性基团、MRS蛋白活性基团和hlgGl-Fc 的基因片段通过聚合酶链式反应(PCR)扩增而得。进行PCR扩增时，PCR引物cMetlF和cMet3RL以及cMet核酸模板(核苷酸序列见 SEQ ID NO. 14)，PCR引物cMet3FL和hlgGFcRevl以及人免疫球蛋白重链核酸模板(核苷酸序列见SEQ ID NO. 11)先分别进行第一次PCR扩增而获得两个PCR产物；然后PCR引物 cMetlF和hlgGFcRevl以第一次扩增获得的两个PCR产物为模板进行第二次PCR扩增，使两个PCR产物相互连接成一个PCR产物，扩增产物克隆在pcDNA3. 1表达载体质粒上；其中PCR弓丨物 cMet3RL 的核苷酸序歹[J为 5，-ggaagaggaagactgacggcagacagatctgttgagtcc,PCR 弓丨物 cMet3FL 的核苷酸序歹[J为 5，-ggactcaacagatctgtctgccgtcagtcttcctcttcc。PCR 扩增的具体操作步骤以及其后处理同实施例1。SM-Fc融合蛋白的核苷酸序列见SEQ ID NO. 3。SM-Fc融合蛋白核酸共有2319个核苷酸，其中前1-1686核苷酸序列来源于cMet的义脆蛋白活性基团和MRS蛋白活性基团， 1687-2319是人免疫球蛋白IgGFc的核苷酸序列。SM-Fc融合蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO. 4。SM-Fc融合蛋白含有772个氨基酸，前1-562个氨基酸序列来源于cMet的kma蛋白活性基团和MRS蛋白活性基团，563-772 是人免疫球蛋白IgG Fc的氨基酸序列(含210氨基酸)。(实施例3、SM2-Fc融合蛋白的制备)
本实施例所构建的SM2-Fc融合蛋白的结构见图2 (c)。SM2-Fc融合蛋白由cMet的两组kma蛋白活性基团和MRS蛋白活性基团依次首尾相连而构成的功能基团和人免疫球蛋白hlgGl-Fc融合而成。 SM2-Fc融合蛋白基因是由上述kma蛋白活性基团、MRS蛋白活性基团和hlgGl-Fc 的基因片段通过聚合酶链式反应(PCR)扩增而得。进行PCR扩增时，PCR引物cMetlF和cMet4RL以及cMet核酸模板(核苷酸序列见 SEQ ID NO. 14)，PCR引物cMet4FL禾口 cMet3RL以及cMet核酸模板(核苷酸序列见SEQ ID NO. 14),PCR引物cMet3FL和hlgGFcRevl以及人免疫球蛋白重链核酸模板(核苷酸序列见 SEQ ID NO. 11)先分别进行第一次PCR扩增而获得三个PCR产物；然后PCR引物cMetlF 和hlgGFcRevl核酸小片段以第一次扩增获得的三个PCR产物为模板进行第二次PCR扩增， 使三个PCR产物相互连接成一个PCR产物，扩增产物克隆在pcDNA3. 1表达载体质粒上；其中 PCR 弓丨物 cMet4RL 的核苷酸序歹[J为 5，_tgctagtgcctctttacactccagacagatctgttgagtcc, PCR 弓 I 物 cMet4FL 的核苷酸序列为 5 ‘ -ggactcaacagatctgtctggagtgtaaagaggcactagca。PCR 扩增的具体操作步骤以及其后处理同实施例1。SM2-Fc融合蛋白的核苷酸序列见SEQ ID N0. 5。SM2-Fc融合蛋白核酸共有3933个核苷酸，其中1-1686核苷酸序列来源于cMet的kma蛋白活性基团和MRS蛋白活性基团， 1687-3300核苷酸序列与前1-1686核苷酸相同，3301-3933是人免疫球蛋白IgG Fc的核苷酸序列。SM2-Fc融合蛋白的氨基酸序列见SEQ ID N0. 6。SM2-Fc融合蛋白含有1310个氨基酸，1-562氨基酸序列来源于cMet的kma蛋白活性基团和MRS蛋白活性基团，563-1100氨基酸序列与前1-562氨基酸序列相同，1101-1310是人免疫球蛋白IgG Fc的氨基酸序列。(实施例4、MI-Fc融合蛋白的制备)
本实施例所构建的MI-Fc融合蛋白的结构见图2 (d)。MI-Fc融合蛋白由cMet的MRS 蛋白活性基团和IPT蛋白活性基团首尾相连而构成的功能基团和人免疫球蛋白hlgGl-Fc 融合而成。MI-Fc融合蛋白基因是由上述MRS蛋白活性基团、IPT蛋白活性基团和hlgGl-Fc 的基因片段通过聚合酶链式反应(PCR)扩增而得。进行PCR扩增时，PCR引物cMetlF和cMet5RL以及cMet核苷酸模板(SEQ ID N0. 14)，PCR 引物 cMet5FL 和 cMet2RL 以及 cMet 核苷酸模板(SEQ ID N0. 14)，PCR 引物cMet2FL和hlgGFcRevl及人免疫球蛋白重链核酸模板(SEQ ID NO. 11)先分别进行第一次 PCR扩增而获得三个PCR产物；然后PCR引物cMetlF和hlgGFcRevl以第一次扩增获得的三个PCR产物为模板进行第二次PCR扩增，使三个PCR产物相互连接成为一个PCR产物，扩增的PCR产物克隆在pcDNA3. 1表达载体质粒上；其中PCR引物cMet5RL的核苷酸序列为5 ，-tgcagcccaagccattcccattgctcctctgcac,PCR 弓丨物 cMet5FL 的核苷酸序列为 5，-gtgcagag gagcaatgggaatggcttgggctgca。PCR扩增的具体操作步骤以及其后处理同实施例1。MI-Fc融合蛋白的核苷酸序列见SEQ ID NO. 7。MI-Fc融合蛋白核酸共有1956个核苷酸，1-72核苷酸序列为cMet前导序列(见SEQ ID NO. 13)，73-1323核苷酸序列为cMet 的MRS蛋白活性基团和IPT蛋白活性基团的核苷酸序列，1324-1956是人免疫球蛋白IgG Fc 的核苷酸序列。MI-Fc融合蛋白的核苷酸序列见SEQ ID NO. 8。MI-Fc融合蛋白含有651个氨基酸，1-24氨基酸序列为cMet前导序列蛋白质，25-441氨基酸序列为cMet的MRS蛋白活性基团和IPT蛋白活性基团的氨基酸序列，442-651氨基酸序列为人免疫球蛋白IgG Fc的氨基酸序列。(实施例5、IPT-Fc融合蛋白的制备)
本实施例所构建的IPT-Fc融合蛋白的结构见图2 (e)。IPT-Fc融合蛋白由cMet的直接作为功能基团的IPT蛋白活性基团和人免疫球蛋白hlgGl-Fc融合而成。IPT-Fc融合蛋白基因是由上述IPT蛋白活性基团和hlgGl-Fc的基因片段通过聚合酶链式反应(PCR)扩增而得。进行PCR扩增时，PCR引物cMetlF和cMet6RL以及cMet核苷酸模板(SEQ ID NO. 14)，PCR 引物 cMet6FL 和 cMet2RL 以及 cMet 核苷酸模板(SEQ ID N0. 14)，PCR 引物 cMet2FL和hlgGFcRevl以及人免疫球蛋白重链核酸模板(SEQ ID N0. 11)先分别进行第一次PCR扩增而获得三个PCR产物；然后PCR引物cMetlF和hlgGFcRevl以第一次扩增获得的三个PCR产物为模板进行第二次PCR扩增，使三个PCR产物相互连接成为一个PCR产物， 扩增的PCR产物克隆在pcDNA3. 1表达载体质粒上；其中PCR引物cMet6RL的核苷酸序列为 5，-aaccttgtagattgcaggcccattgctcctctgcac,PCR 弓丨物 cMet6FL 的核苷酸序歹[J为 5，-gtgc agaggagcaatgggcctgcaatctacaaggtt。PCR扩增的具体操作步骤以及其后处理同实施例1。IPT-Fc融合蛋白的核苷酸序列见SEQ ID N0. 9。IPT-Fc融合蛋白核酸共有1815个核苷酸组成，1-72核酸序列为cMet前导序列(见SEQ ID N0. 13)，73-1182核酸序列为cMet 的IPT蛋白活性基团的核苷酸序列，1183-1815为人免疫球蛋白IgG Fc的核苷酸序列。IPT-Fc融合蛋白的氨基序列见SEQ ID N0. 10。IPT-Fc融合蛋白含有604个氨基酸，1-24氨基酸序列为cMet前导序列蛋白质，25-394为cMet的IPT蛋白活性基团的氨基酸序列，395-604氨基酸序列为人免疫球蛋白IgG Fc的氨基酸序列。(实施例6、肝细胞生长因子受体活性基团融合蛋白的纯化) 肝细胞生长因子受体活性基团融合蛋白的纯化过程如下
融合蛋白稳定细胞株用无血清的细胞培养液在37°C，5% CO2培养箱培养，经过15-25天的培养，培养液在4°C下、lOOOOr/m离心30分钟；收集上清液，用0.2微米过滤器过滤。过滤液用蛋白A层析柱进行纯化，层析柱用10倍柱容量的PBS清洗，然后用pH值3. 5，25mM 的醋酸缓冲液洗脱融合蛋白，用收集器收集洗脱液，并用1.5M Tris缓冲液调整pH值至pH7. 0，浓缩后，用PBS在4°C透析过夜。纯化的蛋白质可用紫外^Onm测试蛋白质含量，用受体融合蛋白与肝细胞生长因子结合试验检测融合蛋白的生物结合活性。纯化蛋白质样品，采用SDS-PAGE电泳和微流控芯片自动化电泳系统分析其纯度和分子量。(实施例7、cMet活性基团的融合蛋白与肝细胞生长因子的结合)
见图3，检测时，将融合蛋白(以cMethFc融合蛋白表示各种肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白)与肝细胞生长因子结合后，加入碱性磷酸酶标记的羊抗人免疫球蛋白Fc 抗体，然后加入碱性磷酸酶底物pNPP，cMet活性基团的融合蛋白与肝细胞生长因子的结合越强，则碱性磷酸酶底物PNPP与标记碱性磷酸酶的显色反应越强，反应后所得溶液的颜色越深，以吸光度值定量地表示颜色深浅。具体操作步骤如下在96孔酶标板中加入碳酸盐缓冲液稀释(pH值9. 6)的 5 μ g/mL的肝细胞生长因子，100 μ L/孔，酶标板放在4°C过夜；然后每孔加入300 μ Ll % BSA-TBST，室温下放置2小时后分别加入实施例1、2、4、5制备的融合蛋白上清液，100微升 / ？L，室温反应1小时，用TBST洗4次以洗去未结合的蛋白质，接着每孔加入100 μ L 1% BSA-TBST (1:2500)稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗人免疫球蛋白Fc抗体，室温反应1小时， 用TBST洗板4次，洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶底物pNPP后，反应30分钟，终止反应，用酶标仪检测在405 nm处的吸光度值；阴性对照例中是无受体核苷酸的表达载体质粒细胞上清液。检验结果见图4，与没有融合蛋白上清液(阴性对照，Mock)的对照例相比，试验例的吸光度值均高于对照例，因此结果表明本发明的融合蛋白可有效地与肝细胞生长因子结合。由于肝细胞生长因子(HGF)的表达和在肿瘤细胞的分泌会激活cMet，诱导肿瘤细胞的增殖，迁移，侵袭，减少人体对肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞抑制，而cMet活性基团的融合蛋白可高效、特异地与生长因子结合，因此阻止了生长因子与肿瘤细胞的结合，从而可以抑制肿瘤细胞的生长和转移。以上各实施例是对本发明的具体实施方式
的说明，而非对本发明的限制，有关技术领域的技术人员在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以作出各种变换和变化而得到相对应的等同的技术方案，因此所有等同的技术方案均应该归入本发明的专利保护范围。
权利要求
1.一种肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白，其特征在于由来自肝细胞生长因子受体的直接作为功能基团的活性基团与人免疫球蛋白Fc片段构成，或者由来自肝细胞生长因子受体的活性基团经组合后的功能基团与人免疫球蛋白Fc片段构成，其中肝细胞生长因子受体的功能基团在氮端，人免疫球蛋白Fc片段在碳端；所述肝细胞生长因子受体的活性基团包括kma蛋白活性基团、MRS蛋白活性基团和IPT蛋白活性基团；所述活性基团经组合后的功能基团包括复数个相同的活性基团组合而成的功能基团以及其中2 3种活性基团单个或复数个任意组合而成的功能基团；所述肝细胞生长因子受体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 14所述，肝细胞生长因子受体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 15所述；肝细胞生长因子受体的义脆蛋白活性基团的核苷酸序列如上述序列表中SEQ ID NO. 14中1-1546核苷酸序列所述，肝细胞生长因子受体的kma蛋白活性基团的氨基酸序列如上述序列表中SEQ ID NO. 15中1-516氨基酸序列所述；肝细胞生长因子受体的MRS蛋白活性基团的核苷酸序列如上述序列表中SEQ ID NO. 14 中1M7-1686核苷酸序列所述，肝细胞生长因子受体的MRS蛋白活性基团的氨基酸序列如上述序列表中SEQ ID NO. 15中517-772氨基酸序列所述；肝细胞生长因子受体的IPT蛋白活性基团的核苷酸序列如上述序列表中SEQ ID NO. 14 中1687-2796核苷酸序列所述，肝细胞生长因子受体的IPT蛋白活性基团的氨基酸序列如上述序列表中SEQ ID NO. 15中773-932氨基酸序列所述。
2.根据权利要求1所述的肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白，其特征在于所述肝细胞生长因子受体的活性基团经组合后的功能基团为由kma蛋白活性基团、MRS蛋白活性基团和IPT蛋白活性基团依次首尾相连而构成的功能基团，或者为MRS蛋白活性基团和IPT蛋白活性基团首尾相连而构成的功能基团，或者为kma蛋白活性基团和MRS蛋白活性基团首尾相连而构成的功能基团，或者为2 3组kma蛋白活性基团和MRS蛋白活性基团依次首尾相连而构成的功能基团。
3.根据权利要求2所述的肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白，其特征在于所述人免疫球蛋白为hlgGl，其Fc片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 11所述，其Fc片段的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 12所述。
4.根据权利要求3所述的肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白，其特征在于所述功能基团由kma蛋白活性基团、MRS蛋白活性基团与IPT蛋白活性基团组合而成时，功能基团与人免疫球蛋白Fc片段构成的融合蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO. 1所述，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2所述。
5.根据权利要求3所述的肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白，其特征在于所述功能基团由义脆蛋白活性基团与MRS蛋白活性基团组合而成时，功能基团与人免疫球蛋白Fc片段构成的融合蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO. 3所述，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 4所述。
6.根据权利要求3所述的肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白，其特征在于所述功能基团由两组义脆蛋白活性基团与MRS蛋白活性基团组合而成时，功能基团与人免疫球蛋白Fc片段构成的融合蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID N0.5所述，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 6所述。
7.根据权利要求3所述的肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白，其特征在于所述功能基团由MRS蛋白活性基团与IPT蛋白活性基团组合而成时，功能基团与人免疫球蛋白Fc片段构成的融合蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO. 7所述，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 8所述。
8.根据权利要求3所述的肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白，其特征在于所述功能基团为IPT蛋白活性基团时，功能基团与人免疫球蛋白Fc片段构成的融合蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO. 9所述，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 10所述。
9.根据权利要求1至8之一所述的肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白，其特征在于其与肝细胞生长因子结合。
10.权利要求9所述的肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白，利用分子生物学技术，表达多种不同组合的单个或多个肝细胞生长因子受体活性基团与人免疫球蛋白Fc片段的融合蛋白质。肝细胞生长因子受体活性基团的融合蛋白质可高效、特异地与生长因子结合，阻止生长因子与肿瘤细胞的结合，抑制肿瘤细胞的生长和转移，靶向定点治疗肿瘤；由于肝细胞生长因子受体活性基团的多样性，因此通过单个或多个受体活性基团的组合，可得到具有不同亲和力和药物代谢动力学的融合蛋白质。
文档编号A61P35/00GK102276726SQ20111021569
公开日2011年12月14日 申请日期2011年7月29日 优先权日2011年3月16日
发明者周斌 申请人:常州新泉生物医药科技有限公司