专利名称：壳聚糖载辣椒素微球的制备方法及微球和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种壳聚糖载辣椒素微球(CTS-CAP-MP)的制备方法及微球和应用。
背景技术：
壳聚糖(Chitosan，CTS)是一种天然聚阳离子多糖衍生物，大量存在于海洋节肢动物(虾、蟹等)的甲壳中，也存在于低等动物菌类、昆虫、藻类细胞膜中，资源十分丰富，目前CTS通常都是作为制备其他药物微粒的壁材或者辅料。辣椒素(Capsaicin，CAP)是一种天然的植物碱，是由茄科植物辣椒的成熟果实中提取得到的有效成分，主要用于镇痛、止痒，其镇痛作用与吗啡等同，但较吗啡作用持久。目前对辣椒碱的应用研究均为直接应用，但是CAP的强烈刺激性影响了其应用， 未见利用CTS作为负载CAP的壁材或者辅料技术报道，也未见采用CTS载CAP达到相关协同作用的技术报道。
发明内容
本发明的一个目的是填补现有技术的不足，提供一种CTS-CAP-MP的制备方法，成功实现CTS载CAP，制备得到包封率和载药量俱佳的微球。本发明的另一个目的是提供所述方法制备得到的载辣椒碱壳聚糖微球，采用适宜的制备技术方案和工艺条件，制备得到的所述微球成功利用了 CTS的载体作用，实现对CAP 的二次包覆，很好地掩盖CAP的刺激性，并克服单一物质效果有限、使用剂量大的局限性。本发明还有一个目的是提供所述微球的应用，发挥CTS和CAP协同作用。本发明的目的通过以下技术方案予以实现提供一种CTS-CAP-MP的制备方法，通过离子交联法联合喷雾干燥法制备得到，包括以下步骤(1)采用醋酸溶液充分溶解CTS，配制成1. Omg/ml的CTS溶液；采用吐温-80 (Tween-80)溶液溶解CAP，配制成1. 5mg/ml的CAP溶液；(2)将步骤(1)所述CTS溶液和CAP溶液按照10 1的体积比混勻得混合溶液；(3)将三聚磷酸钠(TPP)水溶液加入步骤( 所述混合溶液中得CTS-CAP-MP混悬溶液；所述TPP水溶液的用量按照CTS和TPP的质量比为4 1确定；(4)将步骤( 所述CTS-CAP-MP混悬溶液，放置至无气泡，用喷雾干燥机进行喷雾干燥。优选地，本发明方法包括以下步骤(1)采用1 % (体积比浓度)的醋酸溶液充分溶解CTS，配制成1. Omg/ml的CTS溶液；采用0. 5 %的吐温-80 (Tween-80)溶液(Tween-80与水的质量体积比为 0. 5g/100ml)溶解 CAP (CAP)，配制成 1. 5mg/ml 的 CAP 溶液；
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(2)将步骤(1)所述CTS溶液和CAP溶液按照10 1的体积比混勻得混合溶液； 调节混合溶液PH值为4.5;(3)搅拌下，将浓度为的三聚磷酸钠(TPP)水溶液(TPP和水的质量体积比为Ig 100ml)恒速滴入步骤(2)所述混合溶液中，至蓝色乳光出现，继续搅拌即得 CTS-CAP-MP混悬溶液；所述TPP水溶液的用量按照CTS和TPP的质量比为4 1确定(指的是CTS溶液和TPP中的化合物CTS和化合物TPP的质量比为4 1，下同)；(4)将步骤( 所述CTS-CAP-MP混悬溶液，放置至无气泡，用喷雾干燥机进行喷雾干燥；步骤(4)所述喷雾干燥的工艺条件优选为热风量32m3/h，进样速率400ml/h，压缩空气压力101/min，进风口的温度为160°C，进样速率为600ml/h。本发明经过长期大量的实验结合创造性的分析和总结，综合考虑多种因素及因素之间的相互影响，对离子交联法和喷雾干燥工艺条件进行优化，通过确定CTS溶液和CAP溶液浓度、二者混合溶液的体积比和酸碱度、喷雾干燥的工艺条件等，成功实现CTS载CAP，制备得到包封率和载药量俱佳的微球。本发明提供采用上述方法制备得到的CTS-CAP-MP，所述微球外观呈球形，粒径分布在0. 8 μ m 4. 5 μ m，平均包封率和载药量分别为85. 17%和8. 87%，技术效果稳定。本发明创造性地采用高效液相色谱法测定CTS-CAP-MP中的CAP包载量，具有较好的重复性、稳定性和良好的进样精密度，为CTS-CAP-MP的制备提供了针对性的检测技术方案，控制稳定的产品质量。本方法CAP的检测限(S/N > 3)为0. 08 μ g，定量限(S/N ^ 10) 为 0. 24 μ g0所述检测方法包括以下步骤(A)制备CTS-CAP-MP混悬溶液(参见前述步骤(1) 步骤(3))；(B)将步骤㈧所述混悬溶液离心取上清液，调pH值至7. 0后沉淀未被包载的 CTS ；离心取上清液水浴蒸干，加入甲醇复溶后采用0. 22 μ m滤膜过滤，滤液进行高效液相色谱法测定。其中，所述高效液相色谱法的条件是色谱柱为DiamonsilC18 (250mmX4. 6mm，5 μ m)，流动相为体积比 68 32 的甲醇-水，紫外检测波长为281nm，流速为1. Oml/min，柱温为30°C，进样量为20 μ 1。本发明提供了所述微球以下相关应用所述微球具有优良的缓释性能，在pH值为7. 4的中性介质中，CTS-CAP-MP的药物释放较慢，且在24h基本释放完全，可很好地应用于制备缓释制剂方面。本发明制备得到的微球，CTS不仅仅作为CAP的有效载体，而且与CAP共同发挥协同增效作用，在制备抗炎抑菌方面的药物方面具有很好的应用。本发明的有益效果是(1)现有技术未见采用CTS作为CAP载体制备CAP微球的技术报道。本发明克服了技术难题，应用CTS作为载体，成功负载CAP，实现对CAP的二次包裹，使得CTS和TPP 通过化学键牢固的结合并通过二次包裹作用将CAP包载其中，平均包封率和载药量分别为 85. 17%和8. 87%。显著减小CAP刺激性，提供了其顺应性。(2)本发明在成功应用CTS作为CAP的载体的基础上，在成功完成负载并实现二次包覆的同时，进一步对CTS溶液和CAP溶液浓度、二者混合溶液的体积比和酸碱度、具体的工艺条件等进行探索和优化，实现了微球良好的缓释机制和两种药物的协同增效作用，所述微球在制备缓释制剂、消炎抑菌药物方面具有良好的应用前景。(3)现有的载药微球的制备，存在着制备过程中使用有机溶剂且制备产出量太少， 包封率和载药量不佳等缺陷，不具有实际应用意义。本发明寻找适宜的制备方法和工艺条件，克服传统制备载药微球的技术不足，尤其是产量不足和制备过程中使用有机溶剂、包封率和载药量不佳等不足，通过针对性改进离子交联法联合喷雾干燥技术，对CAP实现离子交联和喷雾干燥过程中的二次包裹作用，实现大量生产，解决了 CTS和CAP实际应用的技术难题。(4)本发明创造性地采用高效液相色谱法测定CTS-CAP-MP中的CAP包载量，具有较好的重复性、稳定性和良好的进样精密度，CAP的检测限(S/N > 3)为0. 08 μ g，定量限 (S/N彡10)为O.Myg。本方法为微球的制备提供了一种可行的检测方法，并有望成为有效的微球制备的质量控制方法，保证了本发明技术方案的完整和科学性，填补了本技术领域的空白，为微球制备技术的发展提供技术基础。(5)本发明的制备方法简单有效，工艺条件确定，具有很好的工业推广实用性和价值。
图1 CAP、CTS和TPP的紫外全波长扫描图；图2 CAP标准品HPLC色谱图；图3 CAP样品HPLC色谱图；图4专属性HPLC色谱图(1.阴性对照、2. CAP样品、3. CAP标准品)；图5 CAP的标准曲线；图6 CTS浓度对包封率的影响；图7 TPP浓度对包封率的影响；图8 CAP浓度对包封率的影响；图9 CTS/TPP质量比对包封率的影响；图10 pH值对药物包封率的影响；图 11 TPP、CTS、CAP、CTS+CAP+TPP 物理混合物、CTS_MP(壳聚糖微球)和 CTS-CAP-MP 的 DTA 分析图；图12 CTS-CAP-MP的粒径分布图；图 13 CTS-CAP-MP 的 Zata 电位分布图；图 14 CTS-CAP-MP 的 SEM 图(1000 倍)；图15 CAP在不同介质中的累积释放率。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明，本发明实施例中使用以下试剂和仪器，常规的物质或仪器的简单替代也不能在此一一赘述，不能将本发明长期所做的大量实验全部在此一一列举，但并不因此限定本发明范围。
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JB-3型定时磁力搅拌器(上海智光仪器仪表有限公司)，十万分之一电子分析天平(BT125D，德国赛多利斯)，ZetasizerNarK^S90粒度分析仪(英国马尔文公司)，高效液相色谱仪(Ultimate 3000，美国戴安公司)，Cw色谱柱(Diamonsil，北京迪马科技有限公司)，保护预柱(KJ0-4^2，广州菲罗门科学仪器有限公司)，ELGA超纯水机(法国威立雅水处理技术有限公司)，钨丝灯扫描电镜(S3700N，日本日立公司)，差热分析仪(ZR-2CR，南京多助科技有限公司)，高速离心机(TGL-16C，上海安亭科学仪器厂)，紫外可见分光光度计 (SPECORD S600，德国耶拿分析仪器股份公司)，pH计(MarterfC，美国奥豪斯仪器公司)， 0. 22有机相滤膜(天津津腾实验设备有限公司)，0. 22水相滤膜(天津津腾实验设备有限公司)，双频数控超声波清洗器(KQ-500VDE，昆山市超声仪器有限公司)，Thermo超低温冰箱(702，美国赛默飞世尔科技公司)，喷雾干燥机(L-117，北京来亨科贸有限责任公司)，低速离心机(SC-3160，科大创新股份有限公司中佳分公司)，旋转蒸发器(RE-5205，上海亚荣生化仪器厂)，电热恒温水槽(DK-8D，上海一恒科技有限公司)，鼓风干燥箱(DHG-9M6A，上海精密实验设备有限公司)。辣椒素原料药(纯度> 95%，批号20100820，武汉圣天宇科技有限公司)，辣椒素对照品(纯度> 98. 0%，批号10031121，上海同田生物技术有限公司)，吐温_80(批号 20090201，广州试剂厂)，色谱甲醇(美国霍尼韦尔公司)，甲醇(AR，天津百世化工有限公司)，壳聚糖(批号090320A，山东奥康生物科技有限公司)，多聚磷酸钠(批号20100302， 天津福晨化学试剂厂)，冰醋酸(批号20090820，天津福晨化学试剂厂)。实施例1 CTS-CAP-MP的制备和检测实验1. CAP最大吸收波长的确定在190 800nm波长范围内对CAP、CTS和TPP进行全波长扫描，选择测定CAP的最佳吸收波长以减小辅料的干扰。附图1为CAP、CTS和TPP的紫外全波长扫描图，其中曲线1、2和3分别代表CAP、TPP和CTS的紫外全波长扫描图。从附图1中发现CAP在239nm 和^lnm具有较强的紫外吸收且CTS和TPP在该波长处紫外吸收很小，经过分析和总结，同时为了避免末端吸收的影响，故选择CAP的紫外吸收测定波长为^lnm。2.离子交联法制备CTS-CAP-MP称取CTS 0. IOg用体积比浓度为1 %的醋酸溶液充分溶解，配制成1. Omg/ml的 CTS 溶液。称取 CAP 0.15g 用 0.5% (Tween-80 水=0. 5g 100ml)的 Tween-80 水溶液超声8min增溶CAP，配制成1. 5mg/ml的CAP溶液。量取IOml CTS溶液于烧杯中，加入Iml CAP溶液，磁力搅拌15min混勻，加入4mol/l的NaOH调节混合溶液的pH值为4. 5 ；用注射器吸取浓度为1 %的TPP溶液，在不断搅拌(600r/min)的情况下，用4号针头、以2ml/min 的恒速滴入CTS和CAP的混合溶液中，直至蓝色乳光，继续搅拌30min，即得CTS-CAP-MP混悬液。将上述CTS-CAP-MP混悬液在15000r/min的条件下离心20min，取上清液A用 4mol/l的NaOH调pH值至7. 0，使未形成MP的CTS沉淀；然后在15000rpm/min条件下离心 5min得上清液B，取5ml上清液B置于蒸发皿中，55°C水浴蒸干。加入适量甲醇复溶后定容于2ml容量瓶中，0. 22 μ m滤膜过滤后，用高效液相色谱法测定未被CTS-MP包载的游离CAP含量。3.色谱条件与系统适应性实验
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色谱柱为DiamonsilC18 (250mmX 4. 6mm，5 μ m)，流动相为甲醇-水(68 32，体积比)，紫外检测波长为^lnm,流速为l.Oml/min，柱温为30°C，进样量为20μ 1。CAP和样品中相邻色谱峰的分离度大于1. 5 ；CAP保留时间为16. 55min，理论塔板数以CAP峰计算不低于6000，拖尾因子1. 01，峰形对称，色谱图见附图2和附图3所示。4.专属性考察实验分别制备标准品溶液、CTS-CAP-MP供试品溶液和不含CAP的CTS-MP阴性样品溶液，在选定的色谱条件下测定，考察辅料对CAP含量测定的干扰情况。实验结果见附图4所示的专属性HPLC色谱图，其中1为阴性对照，2为CAP样品，3为CAP标准品。由附图4可见，通过对空白辅料阴性对照溶液、CAP对照品溶液和CAP样品溶液在相同色谱条件下分析发现，辅料对CAP的测定无干扰，专属性良好。5.标准曲线精密称取CAP标准品15. 75mg (五氧化二磷干燥)，适量甲醇溶解，定容于IOOml 容量瓶中，制成标准品储备液。分别量取不同体积标准储备液，定容于IOml容量瓶中配制成浓度分别为 10. 50 μ g/ml、21. OO μ g/ml、42. OO μ g/ml、63. OO μ g/ml、84. OO μ g/ml、 131. 25 μ g/ml、157. 50 μ g/ml的标准溶液。在所述的色谱条件下，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。CAP的标准曲线见附图5所示，按外标一点法以峰面积对浓度进行线性回归，得回归方程y = 0. 1770X+0. 0027，R2 = 0. 9999。结果表明CAP的检测浓度在10. 5 157. 5 μ g/ml范围内与峰面积呈良好线性关系。6.精密度试验选取高中低三个不同浓度的标准品溶液，进样20 μ 1，按照选定色谱条件每个标准品溶液测定6次，统计峰面积并计算相对标准偏差(RSD)。精密度实验结果见表1，表中数据显示在21. OO μ g/ml、63. OO μ g/ml和131. 25 μ g/ml高中低三个浓度下RSD分别为0. 23%, 0. 33%和0. 19%，且均小于0. 5%，表明本方法具有较好的进样精密度。表1精密度试验结果(n = 6)
权利要求
1.一种壳聚糖载辣椒素微球的制备方法，其特征在于通过离子交联法联合喷雾干燥法制备得到，包括以下步骤(1)采用醋酸溶液充分溶解壳聚糖，配制成ι.O mg/ml的壳聚糖溶液；采用吐温_80溶液溶解辣椒素，配制成1. 5mg/ml的辣椒素溶液；(2)将步骤(1)所述壳聚糖溶液和辣椒素溶液按照10:1的体积比混勻得混合溶液；(3)将三聚磷酸钠水溶液加入步骤(2)所述混合溶液中得载辣椒素的壳聚糖微球混悬溶液；(4)将步骤(3)所述载辣椒素的壳聚糖微球混悬溶液，放置至无气泡，用喷雾干燥机进行喷雾干燥。
2.根据权利要求1所述壳聚糖载辣椒素微球的制备方法，其特征在于步骤(1)所述醋酸溶液的浓度为1% ；所述吐温-80溶液浓度为0. 5%。
3.根据权利要求1所述壳聚糖载辣椒素微球的制备方法，其特征在于步骤(2)所述混合溶液的PH值调节为4.5。
4.根据权利要求1所述壳聚糖载辣椒素微球的制备方法，其特征在于步骤(3)是在搅拌条件下，将浓度为1%的三聚磷酸钠水溶液恒速滴入步骤(2)所述混合溶液中，至蓝色乳光出现，继续搅拌即得载辣椒素的壳聚糖微球混悬溶液；步骤(4)所述喷雾干燥的工艺条件为热风量32 m3/h，进样速率400 ml/h，压缩空气压力10 Ι/min，进风口的温度为160 °C， 进样速率为600 ml/h。
5.一种权利要求1、2、3或4所述壳聚糖载辣椒素微球的制备方法制备得到的壳聚糖载辣椒素微球。
6.一种权利要求5所述壳聚糖载辣椒素微球在制备缓释制剂方面的应用。
7.—种权利要求5所述壳聚糖载辣椒素微球在制备消炎抑菌药物方面的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于应用于制备抑制白色念球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌或枯草芽抱杆菌药物方面的应用。
9.一种权利要求5所述壳聚糖载辣椒素微球的检测方法，其特征在于应用高效液相色谱法测定壳聚糖载辣椒素微球中的辣椒素包载量。
10.根据权利要求9所述的壳聚糖载辣椒素微球的检测方法，其特征在于包括以下步骤(A)制备载辣椒素的壳聚糖微球混悬溶液；(B)将步骤(A)所述混悬溶液离心取上清液，调pH值至7.0后沉淀未被包载的壳聚糖； 离心取上清液水浴蒸干，加入甲醇复溶后采用0. 22 μ m滤膜过滤，滤液利用高效液相色谱法测定；其中，所述高效液相色谱法的条件是色谱柱为DiamonsilC18 (250mmX 4. 6mm，5 μ m)；流动相为体积比68 32的甲醇-水；紫外检测波长为nm ；流速为1. 0 ml/min ；柱温为30°C ；进样量为20 μ 1。
全文摘要
本发明公开了壳聚糖载辣椒素微球的制备方法及微球和应用。以壳聚糖溶液和辣椒素溶液为主要原料，通过离子交联法联合喷雾干燥法制备得到，并且壳聚糖和三聚磷酸钠通过化学键牢固的结合并通过二次包覆将辣椒素包载其中。所述微球粒径分布在0.8μm～4.5μm。本发明确定壳聚糖和辣椒素的包载比例、提供优选的制备工艺条件，对辣椒素实现离子交联和喷雾干燥过程中的二次包裹作用。所述微球具有良好的缓释性能，实现了壳聚糖和辣椒素协同增效的消炎抑菌作用，成功的二次包覆显著减小辣椒素刺激性；克服了传统制备载药微球产量不足、使用有机溶剂、包封率和载药量不佳等缺陷，具有良好的工业应用意义。
文档编号A61K9/16GK102389398SQ201110247679
公开日2012年3月28日 申请日期2011年8月26日 优先权日2011年8月26日
发明者苏政权, 谭思荣, 陶毅, 高冰 申请人:广东药学院