专利名称：针对hpv16 e7基因的小干扰rna及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及双链核糖核酸(dsRNA)，并涉及其通过RNA干扰(RNAi)作用来预防及治疗人乳头瘤病毒16亚型(HPV16)感染所引起的相关疾病的用途，其中所述疾病例如宫颈癌、外阴癌、食管癌、乳腺癌、肺癌等癌症，以及由HPV16所引起的癌前病变和生殖器疣等疾病。
背景技术：
1998年，Andrew Ζ. Fire和Craig C. Mello共同发现了体内RNA干扰的作用机制， 并于2006年共同获得了诺贝尔生理医学奖。从而为抵抗病毒、癌症等严重疾病的新一代药物(RNA干扰类药物)的研发开启了一扇大门。此RNA干扰类药物具有作用方式新颖、作用机制明确、靶向性强和副作用小等优点。人类乳突病毒(Human Papillomavirus,简称HPV)，属于乳多空病毒科乳头瘤病毒属，是一种小型无包膜的病毒颗粒，呈球形，二十面体对称，直径约45-55nm，病毒的核心为双链DNA ；病毒衣壳由两种结构蛋白构成的72个壳微粒组成。病毒DNA包含约8000碱基对，其中包括8个早期开放读码框架(E1-E8)、2个晚期读码框架(Li和L2)和1个非编码长控区(LCR)。在早期开放读码框架中，E6和E7基因对细胞生长刺激最为重要，单独E7编码的E7蛋白就可以引起宫颈上皮细胞永生化。而晚期读码框Ll和L2基因分别编码HPV 的主要和次要衣壳蛋白，组装成HPV的衣壳。HPV是世界上最流行的性传染疾病源之一，同时也是一类重要的人类肿瘤病毒。目前已经鉴定超过100种HPV病毒的亚型。HPV各型之间有共同抗原，存在于Ll蛋白保守区域，这些抗原具有属特异。依其感染的上皮所在部位分为皮肤上皮型HPV和粘膜上皮型 HPV。最早确定以及最重要的HPV相关肿瘤是宫颈癌，其发病率仅次于乳腺癌，是严重威胁女性健康的杀手。据统计每年世界范围内约有490，000例左右的新发病例，其中约 130，000发生在中国，每年约有270，000人死于该疾病，约50，000是中国人。随后，更发现外阴癌、食管癌、乳腺癌甚至肺癌等恶性肿瘤的发生、发展都与HPV感染相关。迄今发现的 100多种HPV亚型中，高致癌的HPV亚型(即高危型HPV)有10多种，包括HPV16、18、31、58 等。目前认为，HPV感染对宫颈癌的发生是必要但非充分的。据研究显示，99. 7%宫颈癌患者存在HPV感染。已感染HPV的女性初期症状不明显。通过基于对异常宫颈细胞组织学评估的Pap 测试以及基于核酸的PCR及杂交技术可以确定HPV的存在并确定HPV亚型。异常宫颈细胞分级为低度鳞状上皮内病变(LSIL)和高度鳞状上皮内病变(HSIL)。其中LSIL包括宫颈上皮内瘤变一级(CIN I)的细胞；HSIL包括宫颈上皮内瘤变二级(CIN II)和三级(CIN III) 的细胞。目前用于治疗HPV感染的药物及疗法主要有1、鬼臼树脂(podophyllin) ；2、 鬼臼毒素 podophyllotoxin(podofilox) ；3、三氯乙酸(TCA)/二氯乙酸(BCA) ；4、冷冻疗法；5、手术切除；6、干扰素(IFN) ;7、咪喹莫特1111191^1110(1[1-0-1^让71 1~0 71)-1!1-imidazo(4，5-quinolin-4-amine)] ；8、5_氟尿嘧啶/肾上腺素；9、无环核苷酸类似物 Cidofovir (HPMPC [5]-1-[3-hydroxy-2-phosphonylmethoxy-propyl]-cytosine)等等。 然而，临床上应用的这些抗病毒以及其它抗肿瘤类药物的不但特异性不强，而且副作用大。 目前世界上没有一种特异、高效的抑制HPV的药物来降低甚至抑制其相关癌症的发生和发展。
发明内容
本发明包含以下按顺序排列的段落所述的内容1、小干扰核酸分子在制备用于抑制HPV16E7基因在细胞中表达的制剂中的应用， 所述小干扰核酸分子指导所述细胞中存在的HPV16E7mRNA序列的剪切，从而实现所述的抑制。2、根据段落1所述的应用，其中所述的小干扰核酸分子包含正义核酸片段和反义核酸片段，所述正义核酸片段和所述反义核酸片段含有互补区域，互补区域能形成双链核酸结构，该双链核酸能够抑制HPV16E7基因在细胞中的表达。3、根据段落2所述的应用，其中所述的小干扰核酸分子包含正义核酸片段和反义核酸片段，所述正义核酸片段和反义核酸片段存在于两条不同的核酸链上。4、根据段落2所述的应用，其中所述小干扰核酸分子包含正义核酸片段和反义核酸片段，所述正义核酸片段和反义核酸片段存在于同一条核酸链上，为发夹型单链核酸分子，其中正义核酸片段和反义核酸片段的互补区域形成双链核酸结构。5、根据段落3所述的应用，其中所述的小干扰核酸分子包含2条链，正义核酸片段和反义核酸片段分别位于两条链上，且所述小干扰核酸分子的至少一条链具有长度为O至 6个核苷酸的3’突出端。6、根据段落5所述的应用，其中所述小干扰核酸分子的两条链都具有长度为2-3 个核苷酸的3’突出端。7、根据段落2-6任一项所述的应用，其中正义核酸片段和反义核酸片段的长度为 19至四个核苷酸。8、根据段落1所述的应用，其中所述的小干扰核酸分子被直接导入所述细胞中。9、根据段落1所述的应用，其中所述的小干扰核酸分子是在编码该小干扰核酸分子的核苷酸序列导入所述细胞后在细胞内产生的。10、根据段落1所述的应用，其中所述的细胞是哺乳动物细胞。11、根据段落10所述的应用，其中所述的细胞是人类细胞。12、根据段落11所述的应用，其中所述的细胞存在于人体中。13、根据段落12所述的应用，其中所述的人体是患有HPV感染症状的患者，并且所述小干扰核酸分子被施用足够的量以实现对所述症状的治疗。14、根据段落13所述的应用，其中所述HPV感染症状为子宫颈癌或者尖锐湿疣。15、一种分离的HPV16E7基因小分子干扰核酸靶序列，其中所述靶序列为HPV16E7 的mRNA(cDNA)上任意连续19-30个核苷酸序列。16、根据段落15所述的靶序列，其中所述靶序列为表1中SEQ ID NO =201-270中
4任意一条序列。17、一种小干扰核酸分子，其指导细胞中存在的HPV16E7mRNA序列的剪切，从而实现对HPV16E7表达的抑制，该小干扰核酸分子包含与选自表1中SEQ ID NO =201-270中任意一条序列互补的序列。18、根据段落17所述的小干扰核酸分子，其中至少一个核苷酸为化学修饰的核苷酸。19、根据段落18所述的小干扰核酸分子，其中所述化学修饰为如下修饰中的至少一种(1)对所述小干扰核酸分子的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；(2)对所述小干扰核酸分子的核苷酸序列中的核糖的2’ -OH的修饰；(3)对所述小干扰核酸分子的核苷酸序列中的碱基的修饰。20、一种包含段落17-19任一项所述的小干扰核酸分子和药学上可接受的载体的组合物。21、段落20所述的组合物，其特征在用于药学上可接受的载体为脂质体或高分子聚合物。为解决上述问题，本发明提供了通过小干扰核酸分子抑制引起细胞良性和恶性增生的HPV E7基因表达，来预防和治疗HPV16感染相关疾病的解决方案。在本发明的第一方面，提供了小干扰核酸分子在制备用于抑制HPV16E7基因在细胞中表达的制剂中的应用，所述小干扰核酸分子指导所述细胞中存在的HPV16E7mRNA序列的剪切，从而实现所述的抑制。在本发明中，所述小干扰核酸分子包含正义核酸片段和反义核酸片段，所述正义核酸片段和所述反义核酸片段含有互补区域，互补区域能形成双链核酸结构，该双链核酸能够抑制HPV16E7基因在细胞中的表达。小干扰核酸的正义核酸片段和反义核酸片段可以存在于两条不同的核酸链上，也可以存在于同一条核酸链上。当正义核酸片段和反义核酸片段分别位于两条链上时，小干扰核酸的至少一条链具有长度为0至 6个核苷酸的3’突出端，优选情况下两条链都具有长度为2-3个核苷酸的3’突出端。当正义核酸片段和反义核酸片段存在于同一条核酸链上时，优选情况下该小干扰核酸为发夹型单链核酸分子，其中正义核酸片段和反义核酸片段的互补区域形成双链核酸结构。上述小干扰核酸分子中，正义核酸片段和反义核酸片段的长度为19至四个核苷酸，可以为19、20、 21、23、25、27和四个，优选为19、21、25、27个核苷酸。上述小干扰核酸分子可以被直接导入所述细胞中，也可以是将编码该小干扰核酸分子的核苷酸序列导入所述细胞后在细胞内产生；所述细胞优选为哺乳动物细胞，更优选为人类细胞。上述细胞可以是离体的，如细胞系，也可以存在于哺乳动物体中，如人体中。该人体是患有HPV感染症状的患者，并且所述小干扰核酸分子被施用足够的量以实现对所述症状的治疗，所述HPV感染症状为子宫颈癌或者尖锐湿疣。本发明第二方面提供了一种分离的HPV16E7基因小分子干扰核酸靶序列，其中所述靶序列为HPV16E7 WmRNA(CDNA)上任意连续19-30个核苷酸序列，优选的，所述靶序列为表1中SEQ ID NO =201-270中任意一条序列。在本发明的第三方面，提供了一种小干扰核酸分子，其指导细胞中存在的 HPV16E7mRNA序列的剪切，从而实现对HPV16E7表达的抑制，优选情况下该小干扰核酸分子包含与表1中SEQ ID NO =201-270中任意一条序列互补的序列。上述小干扰核酸分子中所有的核苷酸都可以为天然的未经化学修饰的核苷酸，也可以至少有一个核苷酸是化学修饰的核苷酸，化学修饰方式选自如下修饰中的至少一种(1)对所述小干扰核酸分子的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；(2)对所述小干扰核酸分子的核苷酸序列中的核糖的2’ -OH的修饰；(3)对所述小干扰核酸分子的核苷酸序列中的碱基的修饰。本发明所述的小干扰核酸与表达HPV16E7mRNA的细胞接触后可有效降低 HPV16E7mRNA的表达量本发明最后还提供了一种包含上述任一项所述的小干扰核酸分子和药学上可接受的载体的组合物，优选情况下，药学上可接受的载体为脂质体或高分子聚合物。本发明的有益效果本发明提供的针对HPV16E7基因表达的小干扰核酸分子，能够高效、特异地抑制 HPV16E7基因的表达，同时具有较低的毒副作用，可用于制备抑制HPV16E7基因表达的药物。
具体实施例方式本发明通过RNA干扰方式沉默能够引起细胞良性和恶性增生的HPV16E7基因表达，来预防和治疗HPV16感染相关疾病这一问题。本发明中HPV16E7基因有时也称为HPV
靶基因。本发明提供的小干扰核酸分子包括具有长度低于30个核苷酸并且基本互补于至少部分HPV靶mRNA转录物的区域的核酸片段(反义片段)。这些小干扰核酸分子的使用可以通过被称为RNA干扰(RNAi)的过程导致HPV靶基因mRNA被剪切。本发明提供的小干扰核酸分子可以天然的未经修饰的核酸分子，也可以对其中至少一个核苷酸进行化学修饰。 根据本发明，所述化学修饰为如下修饰中的至少一种(1)对所述siRNA的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；(2)对所述siRNA的核苷酸序列中核糖的2’ -OH的修饰；(3)对所述siRNA的核苷酸序列中碱基的修饰。所述化学修饰为本领域技术人员所公知，所述磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯键中的氧进行修饰，包括硫代磷酸修饰，如式1所示；和硼烷化磷酸盐修饰，如式2所示。 两种修饰都能稳定siRNA结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。
权利要求
1.小干扰核酸分子在制备用于抑制HPV16E7基因在细胞中表达的制剂中的应用，所述小干扰核酸分子指导所述细胞中存在的HPV16E7mRNA序列的剪切，从而实现所述的抑制。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述的小干扰核酸分子包含正义核酸片段和反义核酸片段，所述正义核酸片段和所述反义核酸片段含有互补区域，互补区域能形成双链核酸结构，该双链核酸能够抑制HPV16E7基因在细胞中的表达。
3.根据权利要求2所述的应用，其中所述的小干扰核酸分子包含正义核酸片段和反义核酸片段，所述正义核酸片段和反义核酸片段存在于两条不同的核酸链上。
4.根据权利要求2所述的应用，其中所述小干扰核酸分子包含正义核酸片段和反义核酸片段，所述正义核酸片段和反义核酸片段存在于同一条核酸链上，为发夹型单链核酸分子，其中正义核酸片段和反义核酸片段的互补区域形成双链核酸结构。
5.根据权利要求3所述的应用，其中所述的小干扰核酸分子包含2条链，正义核酸片段和反义核酸片段分别位于两条链上，且所述小干扰核酸分子的至少一条链具有长度为0至 6个核苷酸的3’突出端。
6.根据权利要求5所述的应用，其中所述小干扰核酸分子的两条链都具有长度为2-3 个核苷酸的3’突出端。
7.根据权利要求2-6任一项所述的应用，其中正义核酸片段和反义核酸片段的长度为 19至四个核苷酸。
8.根据权利要求1所述的应用，其中所述的小干扰核酸分子被直接导入所述细胞中。
9.根据权利要求1所述的应用，其中所述的小干扰核酸分子是在编码该小干扰核酸分子的核苷酸序列导入所述细胞后在细胞内产生的。
10.根据权利要求1所述的应用，其中所述的细胞是哺乳动物细胞。
全文摘要
本发明涉及用于预防和治疗人乳头瘤病毒16亚型(HPV16)感染的双链核糖核酸(dsRNA)。所述dsRNA包含具有长度为19-25个核苷酸，并且基本互补于选自HPV16E7基因的至少一部分。本发明也涉及包含所述dsRNA和可药用载体的药物组合物；使用所述dsRNA以及使用所述药物组合物预防及治疗HPV16感染和由HPV16感染引起的疾病的方法；以及应用所述dsRNA以及使用所述药物组合物用于抑制HPV16E7基因在细胞中表达的方法。
文档编号A61P31/20GK102399820SQ20111028858
公开日2012年4月4日 申请日期2011年9月27日 优先权日2011年9月27日
发明者万力, 东硕, 曹宇, 李珺, 毕宏伟, 汤涛 申请人:天津佰思普生物科技有限公司