专利名称：一种高载药量高包封率多肽/蛋白类药物纳米粒的制备方法
技术领域：
本发明属于药品、生物制品及保健品领域，具体地说，本发明涉及ー种高载药量、 高包封率的多肽/蛋白类药物納米粒的制备方法。
背景技术：
近年来，随着基因工程学与生物工程学的发展，大量多肽与蛋白类药物开始应用于临床。由于这类药物具有用量小、稳定性差、在体内易失活等特点，因此，将药物包裹在纳米颗粒中，既可以增加药物在体内的稳定性，又可以维持长时间的血药浓度；如将纳米粒进行修饰，还可达到靶向给药的目的。考虑到生物安全性，制备以生物相容性高的高分子材料为载体的蛋白多肽类药物納米粒一直为近年来的研究热点及难点之一。本发明所述的纳米粒，系采用国际上药剂学定义平均粒径在I-IOOOnm范围，优选平均粒径在50-500nm的微粒。根据近年科研文献，制备此种纳米粒的方法主要有两亲性聚合物水中自组装法、机械分散法、超声乳化法等；这些方法或多或少存在着包封率低、药物易渗漏、药物在制备过程中易变性失活等问题，同吋，制备方法复杂，耗能耗吋，不易进行 エ业化生产。Wang Ting等提出利用乳化-共冻干法制备胰岛素纳米粒，此方法具有方法简单、高包封率的特点，但制备过程中使用了大量的ニ氯甲烷与乙醚，对操作人员和使用者的健康都会有不利影响；同吋，ニ氯甲烷与乙醚的凝固点很低，冻干除去有机溶剂要消耗大量的能量。本发明克服了以上缺点，井能保留高包封率、高载药量、制备简单的特质，同时采用全新的冻干保护剂加入方法，使冻干品易于重分散。天然高分子具有来源广泛、生物可降解、生物相容及低成本的特点。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺陷，提供ー种新的多肽/蛋白药物纳米粒的制备方法，该方法可提供ー种制备简单、高包封率、高载药量、易于重分散的多肽/蛋白纳米粒，同时尽量避免使用毒性大的有机溶剂，尽可能保持蛋白药物活性。为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案—种高载药量高包封率多肽/蛋白类药物納米粒的制备方法，包括以下步骤(1)配制纳米乳液将水溶性多肽/蛋白类药物、生理相容性高分子材料、交联剂、亲水性表面活性剂溶解于水中作为水相；亲油性表面活性剂溶解于非极性溶剂中作为油相；将水相加入到油相中，机械分散形成纳米乳液；其中，所述水溶性多肽/蛋白类药物在水相中的浓度为0. 5mg/ml-10mg/ml (w/v)； 所述亲水性表面活性剂在水相中的浓度为0.5%-2.0% (w/v)；所述亲油性表面活性剂在油相中的浓度为0.5%-2.0% (w/v)；所述水相与油相的体积比为1 :3-1:5;(2)配制冻干保护剂乳液
将饱和浓度的冻干保护剂溶液、亲水性表面活性剂作为水相；亲油性表面活性剂溶解于非极性溶剂中作为油相；将水相加入到油相中，机械分散形成冻干保护剂乳液；其中，所述冻干保护剂溶液的饱和浓度为当温度为25°C _37°C时的冻干保护剂水溶液的饱和浓度；所述亲水性表面活性剂在水相中的浓度为0.5%-2.0% (w/v)；所述亲油性表面活性剂在油相中的浓度为0.5%-2.0% (w/v)；所述水相与油相的体积比为 1:3-1:5;(3)配制混合乳液将冻干保护剂纳米乳液加入到多肽/蛋白纳米乳液中，搅拌混勻，得到混合乳液；其中，冻干保护剂纳米乳液与多肽/蛋白纳米乳液的体积比为1 :1-2:1;(4)制备多肽/蛋白类药物納米粒将混合乳液急速冷冻，再冷冻干燥除去水与非极性溶剤，得到含有多肽/蛋白类药物的纳米粒。优选地，所述生理相容性高分子材料是选自壳聚糖、透明质酸、海藻酸、葡聚糖、 聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚丙烯酸的ー种或两种以上的組合。优选地，所述冻干保护剂是选自蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、聚乙ニ醇、 明胶、甘氨酸的ー种或两种以上的組合。优选地，所述亲水性表面活性剂是HLB值可以是14-16的非离子表面活性剤，例如，吐温80、吐温60、PEG400单月桂酸酷、Atlas-G1441 (聚氧乙烯山梨醇羊毛脂衍生物)、 Ameroxol (聚氧乙烯油醇醚)、Solulan 25 (聚氧乙烯(25E0)羊毛醇醚)、Emulphor (聚氧乙烯脂肪醇)、Myrj 49(聚氧乙烯单硬脂酸酷)的ー种或两种以上的組合。优选地所述亲油性表面活性剂是HLB值可以是3-6的非离子表面活性剤，例如，司盘80、司盘60、Arlacel 80 (失水山梨醇单油酸酷)、Emcol D0-50 ( ニ乙ニ醇脂肪酸酷)、 Ameroxol (聚氧乙烯(2E0)油醇醚)的ー种或两种以上的組合；所述亲油性表面活性剂是 HLB值也可以是磷脂类。以上表面活性剂可以単独使用，亦可使用混合表面活性剤。根据本发明所述的多肽/蛋白类药物納米粒的制备方法的进ー步特征，步骤(4) 中所述急速冷冻是指浸入液氮或干冰或放入超低温冰箱中短时间内凝固为固体；所述冷冻干燥的參数为冷阱温度-55士2. 5°C，真空度0. 22-0. 25mBar，干燥时间12小时以上。本发明还提供了根据前述方法制备而得的多肽/蛋白类药物納米粒。采用本发明的制备方法制备得到的多肽/蛋白纳米粒为球形或近似球形，平均粒径200nm左右，多分散系数0. 10-0. 25，包封率均大于90 %，载药量接近20 % (载药量=药物重量X 100 %バ载体材料重量+药物重量))。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果(1)本发明通过利用水/非极性溶剂作为水相和油相，非极性溶剂毒性为低毒，避免了使用ニ氯甲烷、乙醚等中高毒性有机溶剂。(2)本发明可利用天然和商品化高分子材料作为纳米粒载体。天然聚多糖具有来源广泛、生物可降解、生理相容及低成本的特点，对材料的电荷、分子量无严苛要求，一般药用辅料即可满足需要。(3)本发明采用全新的冻干保护剂加入方法，避免了冻干保护剂直接加入纳米粒可能对药物突释造成的影响，具有临床应用前景。(4)本发明制备エ艺简单，易于エ业化生产放大，利用现行纳米乳和冻干粉制备生产线即可制备。
图1为本发明所制备的药物納米粒透射电镜图(TEM)。图2为本发明所制备的药物納米粒的典型平均粒径和粒径分布图(Z-average = 232. 3nm, PDI = 0. 105)。图3为胰岛素纳米粒的体外释药图，其中，0-120min为模拟人工胃液中(pH = 1. 2) ； 120-360min 为模拟人工肠液(pH = 6. 8)。
具体实施例方式以下结合实施事例对本发明做进ー步说明。实施例1 胰岛素透明质酸纳米粒的制备配方如下
胰岛素透明质酸钠己ニ酸ニ酰胼甘露醇(冻干保护剂) 超纯水吐温80 司盘80
环己烷制备方法(1)配制油相和水相溶液称取胰岛素、透明质酸钠放入西林瓶中，加入超纯水溶解后加入吐温8 0作为水相；称取司盘80放入50ml离心管溶解于环己烷中作为油相；将水相在机械搅拌 (10000rpm,3min)作用下缓慢滴入油相中，得到药物纳米乳液。(2)配制冻干保护剂乳液称取甘露醇溶解于超纯水中，加入吐温80作为水相；称取司盘80放入50ml离心管，溶解于环己烷中作为油相。机械分散后得到乳液。(3)配制蛋白纳米乳与冻干保护剂纳米乳混合液将冻干保护剂乳液加入到蛋白纳米乳液中，搅拌混勻。冻干保护剂乳液与蛋白纳米乳液的体积比为1 1。(4)冷冻干燥混合液将混合液放入超低温冰箱(-80°C )中速冻成固体。放入冷冻干燥机，冷阱温度
5mg 20mg Img 0.5g 4.0ml 80mg 320mg 16.0ml为_50°C，真空度0. 22-0. 25mBar，冻干程序为冻干机自带的“ main-drying”程序，冻干24h 去除水、环己烷得到含有纳米粒的冻干粉。实施例2 牛血清白蛋白透明质酸/海藻酸纳米粒的制备配方如下
牛血清白蛋白5mg透明质·浚钠5mg海藻酸5mg氯化钙(1% w/v)1.0ml甘露醇(冻干保护剂)0.40g超纯水4ml卵磷脂(表面活性剤)200mg吐温80IOOmg环己烷16.0ml制备方法(1)配制油相和水相溶液称取牛血清白蛋白、透明质酸钠、海藻酸放入西林瓶中，加入超纯水溶解后加入吐温80作为水相；称取卵磷脂放入50ml离心管，溶解于环己烷中作为油相；将水相在机械搅拌(10000rpm，3min)作用下缓慢滴入油相中，得到药物纳米乳液。(2)配制冻干保护剂乳液称取甘露醇溶解于超纯水中，加入吐温80作为水相；称取卵磷脂放入50ml离心管，溶解于环己烷中作为油相。机械分散后得到W/0乳液。(3)配制蛋白纳米乳与冻干保护剂乳液混合液将冻干保护剂乳液加入到蛋白纳米乳液中，搅拌混勻。冻干保护剂乳液与蛋白纳米乳液的体积比为2 1。(4)冷冻干燥混合液将混合液放入超低温冰箱(-80°C )中速冻成固体。放入冷冻干燥机，冷阱温度为_50°C，真空度0. 22-0. 25mBar，冻干程序为冻干机自带的“ main-drying”程序，冻干24h 去除水、环己烷得到含有纳米粒的冻干粉。实施例3 胰岛素透明质酸纳米粒的制备配方如下胰岛素5mg透明质酸钠20mg1-乙基-3-(3-ニ甲基氨丙基)-碳化ニ亚胺9mgN-羟基琥珀酰亚胺5.2mg己ニ胺2.Omg山梨醇(冻干保护剂)0.3g超纯水4.0mlPEG400单月桂酸酷50mg司盘80320mg环己烷16.0ml制备方法(1)配制油相和水相溶液称取胰岛素、透明质酸钠放入西林瓶中，加入超纯水溶解后加入PEG400单月桂酸酯作为水相；称取司盘80放入50ml离心管溶解于环己烷中作为油相；将水相在机械搅拌 (10000rpm,3min)作用下缓慢滴入油相中，得到药物纳米乳液。(2)配制冻干保护剂乳液称取山梨醇溶解于超纯水中，加入PEG400单月桂酸酯作为水相；称取司盘80放入 50ml离心管，溶解于环己烷中作为油相。机械分散后得到W/0乳液。(3)配制蛋白纳米乳与冻干保护剂乳液混合液将冻干保护剂乳液加入到蛋白纳米乳液中，搅拌混勻。冻干保护剂乳液与蛋白纳米乳液的体积比为1 1。(4)冷冻干燥混合液将混合液放入超低温冰箱(-80°C )中速冻成固体。放入冷冻干燥机，冷阱温度为_50°C，真空度0. 22-0. 25mBar，冻干程序为冻干机自带的“ main-drying”程序，冻干24h 去除水、环己烷得到含有纳米粒的冻干粉。实施例4 牛血清白蛋白聚谷氨酸纳米粒的制备配方如下牛血清白蛋白IOmg聚谷氨酸20mg1-乙基-3-(3-ニ甲基氨丙基)-碳化ニ亚胺9mgN-羟基琥珀酰亚胺5.2mg己ニ胺2.Omg甘露醇(冻干保护剂)0.25g甘氨酸(冻干保护剂)0.15g超纯水4.0ml聚氧乙烯脂肪醇80mg聚氧乙烯(2E0)油醇醚320mg环己烷15.0ml制备方法(1)配制油相和水相溶液称取牛血清白蛋白、聚谷氨酸放入西林瓶中，加入超纯水溶解后加入聚氧乙烯脂肪醇作为水相；称取聚氧乙烯(2E0)油醇醚放入50ml离心管溶解于环己烷中作为油相；将水相在机械搅拌(lOOOOrpmJmin)作用下缓慢滴入油相中，得到药物纳米乳液。(2)配制冻干保护剂乳液称取甘露醇、甘氨酸溶解于超纯水中，加入聚氧乙烯脂肪醇作为水相；称取聚氧乙烯(2E0)油醇醚放入50ml离心管，溶解于环己烷中作为油相。机械分散后得到W/0乳液。(3)配制蛋白纳米乳与冻干保护剂乳液混合液将冻干保护剂乳液加入到蛋白纳米乳液中，搅拌混勻。冻干保护剂乳液与蛋白纳米乳液的体积比为1 1。(4)冷冻干燥混合液将混合液放入超低温冰箱(-80°C )中速冻成固体。放入冷冻干燥机，冷阱温度为_50°C，真空度0. 22-0. 25mBar，冻干程序为冻干机自带的“ main-drying”程序，冻干24h 去除水、环己烷得到含有纳米粒的冻干粉。实施例5 牛血清白蛋白壳聚糖/葡聚糖纳米粒的制备配方如下牛血清白蛋白5mg壳聚糖7.Img硫酸葡聚糖2.9mg蔗糖(冻干保护剂)0.5g超纯水4.0ml聚氧乙烯(25EO)羊毛醇醚80mg司盘60320mg环己烷16.0ml制备方法(1)配制油相和水相溶液称取牛血清白蛋白、壳聚糖、硫酸葡聚糖放入西林瓶中，加入超纯水溶解后加入聚氧乙烯O5E0)羊毛醇醚作为水相；称取司盘60放入50ml离心管溶解于环己烷中作为油相；将水相在机械搅拌(lOOOOrpmJmin)作用下缓慢滴入油相中，得到药物纳米乳液。(2)配制冻干保护剂乳液称取蔗糖溶解于超纯水中，加入聚氧乙烯O5E0)羊毛醇醚作为水相；称取司盘60 放入50ml离心管，溶解于环己烷中作为油相。机械分散后得到W/0乳液。(3)配制蛋白纳米乳与冻干保护剂乳液混合液将冻干保护剂乳液加入到蛋白纳米乳液中，搅拌混勻。冻干保护剂乳液与蛋白纳米乳液的体积比为2 1。(4)冷冻干燥混合液将混合液放入超低温冰箱(-80°C )中速冻成固体。放入冷冻干燥机，冷阱温度为_50°C，真空度0. 22-0. 25mBar，冻干程序为冻干机自带的“ main-drying”程序，冻干24h 去除水、环己烷得到含有纳米粒的冻干粉。实施例6 胰岛素纳米粒透明质酸/壳聚糖的制备配方如下
胰岛素5mg透明质酸钠IOmg壳聚糖IOmg乳糖(冻干保护剂)0.5g超纯水4.0ml聚氧乙烯单硬脂酸酯80mgニ乙ニ醇脂肪酸酷200mg环己烷16.0ml 制备方法
(1)配制油相和水相溶液称取胰岛素、透明质酸钠、壳聚糖放入西林瓶中，加入超纯水溶解后加入聚氧乙烯单硬脂酸酯作为水相；称取ニ乙ニ醇脂肪酸酯放入50ml离心管溶解于环己烷中作为油相； 将水相在机械搅拌(lOOOOrpmJmin)作用下缓慢滴入油相中，得到药物纳米乳液。(2)配制冻干保护剂乳液称取乳糖溶解于超纯水中，加入聚氧乙烯单硬脂酸酯作为水相；称取ニ乙ニ醇脂肪酸酯放入50ml离心管，溶解于环己烷中作为油相。机械分散后得到W/0乳液。(3)配制蛋白纳米乳与冻干保护剂乳液混合液将冻干保护剂乳液加入到蛋白纳米乳液中，搅拌混勻。冻干保护剂乳液与蛋白纳米乳液的体积比为2 1。(4)冷冻干燥混合液将混合液放入超低温冰箱(-80°C )中速冻成固体。放入冷冻干燥机，冷阱温度为_50°C，真空度0. 22-0. 25mBar，冻干程序为冻干机自带的“ main-drying”程序，冻干24h 去除水、环己烷得到含有纳米粒的冻干粉。上述实施例1至6仅仅是优选的实施例，基于相同的原理，其中的生理相容性高分子材料可选自壳聚糖、透明质酸、海藻酸、葡聚糖、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚丙烯酸的一种或两种以上的組合；冻干保护剂是选自蔴糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、聚乙ニ醇、 明胶、甘氨酸的ー种或两种以上的組合；亲水性表面活性剂是HLB值可以是14-16的非离子表面活性剤，例如，吐温80、吐温60、PEG400单月桂酸酷、Atlas-G1441 (聚氧乙烯山梨醇羊毛脂衍生物)、Ameroxol (聚氧乙烯油醇醚)、Solulan 25 (聚氧乙烯Q5E0)羊毛醇醚)、Emulphor (聚氧乙烯脂肪醇)、Myrj 49 (聚氧乙烯单硬脂酸酷)的ー种或两种以上的組合；亲油性表面活性剂是HLB值可以是3-6的非离子表面活性剤，例如，司盘80、司盘60、 Arlacel 80 (失水山梨醇单油酸酷)、Emcol D0-50 ( ニ乙ニ醇脂肪酸酷)、Ameroxol (聚氧乙烯(2E0)油醇醚)的ー种或两种以上的組合；所述亲油性表面活性剂是HLB值也可以是磷脂类。以上表面活性剂可以単独使用，亦可使用混合表面活性剤。试验例1 药物纳米粒形态的观察取冻干后重分散的纳米粒，混悬分散，取一滴混悬液滴在300目铜载网上，平衡三分钟。用滤纸吸干溶液。用2%的磷钨酸溶液染色，空气中干燥。JEM-1400(日本JEOL公司)透射电镜下观察。取出实施例1-6中制备得到的胰岛素纳米粒和牛血清白蛋白纳米粒，进行形态学观察，初测粒径。典型胰岛素纳米粒的透射电镜图，见图1。由图可见，载药纳米粒形态为球形或近似球形，粒径范围在100nm-200nm之间，表面圆整光洁，无粘连，分散性良好。试验例2 药物纳米粒的粒径及其分布測定纳米粒径采用光子相关谱法(又称为动态光散射)进行測定。仪器为Marlvern Zetasizer Nano ZS90 (英国马尔文公司)。所測量粒径为粒子流体动力学粒径(表示为 Z-average)，采用国际标准对粒径以及多分散系数(PDI)进行累积分析。首先，纳米粒均勻分散于超纯水中，并通过0. 22μπι滤膜。调节样品浓度，使其在动态光散射中有足够的分析计数率(kcps)。正式測量之前对样品有两分钟的平衡时间，每个样品測定三次。取实施例1-6的胰岛素、牛血清白蛋白纳米粒，进行粒径測定，粒径分布图，见图2。由图可见，纳米粒的水力学半径在100nm-400nm之间，粒径分布强度最大值在200nm左右。粒径分布为单峰，峰型窄，且无颗粒聚集峰。表明纳米粒粒径大小均勻，且分布集中。蛋白纳米粒的測定结果见表1。表1 实施例1-6制备的纳米粒的粒径和分散系数的測定
权利要求
1.一种多肽/蛋白类药物納米粒的制备方法，其特征在干，包括以下步骤(1)配制纳米乳液将水溶性多肽/蛋白类药物、生理相容性高分子材料、交联剂、亲水性表面活性剂溶解于水中作为水相；亲油性表面活性剂溶解于非极性溶剂中作为油相；将水相加入到油相中，机械分散形成纳米乳液；其中，所述水溶性多肽/蛋白类药物在水相中的浓度为0. 5mg/ml-10mg/ml (w/v)；所述亲水性表面活性剂在水相中的浓度为0.5%-2.0% (w/v)；所述亲油性表面活性剂在油相中的浓度为0.5%-2.0% (w/v)；所述水相与油相的体积比为1 :3-1:5;(2)配制冻干保护剂乳液将饱和浓度的冻干保护剂溶液、亲水性表面活性剂作为水相；亲油性表面活性剂溶解于非极性溶剂中作为油相；将水相加入到油相中，机械分散形成冻干保护剂乳液；其中，所述冻干保护剂溶液的饱和浓度为当温度为25で_37°C时的冻干保护剂水溶液的饱和浓度；所述亲水性表面活性剂在水相中的浓度为0.5%-2.0% (w/v)；所述亲油性表面活性剂在油相中的浓度为0.5%-2.0% (w/v)；所述水相与油相的体积比为 1:3-1:5;(3)配制混合乳液将冻干保护剂纳米乳液加入到多肽/蛋白纳米乳液中，搅拌混勻，得到混合乳液；其中，冻干保护剂纳米乳液与多肽/蛋白纳米乳液的体积比为1 :1-2:1;(4)制备多肽/蛋白类药物納米粒将混合乳液急速冷冻，再冷冻干燥除去水与非极性溶剤，得到含有多肽/蛋白类药物的纳米粒。
2.根据权利要求1所述的多肽/蛋白类药物納米粒的制备方法，其特征在干，所述生理相容性高分子材料是选自壳聚糖、透明质酸、海藻酸、葡聚糖、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚丙烯酸的ー种或两种以上的組合。
3.根据权利要求1所述的多肽/蛋白类药物納米粒的制备方法，其特征在干，所述冻干保护剂是选自蔴糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、聚乙ニ醇、明胶、甘氨酸的ー种或两种以上的組合。
4.根据权利要求1所述的多肽/蛋白类药物納米粒的制备方法，其特征在于所述亲水性表面活性剂是HLB值为14-16的非离子表面活性剂；所述亲油性表面活性剂是HLB值为3-6的非离子表面活性剂或磷脂类。
5.根据权利要求4所述的多肽/蛋白类药物納米粒的制备方法，其特征在干，所述HLB值为14-16的非离子表面活性剂是选自吐温80、吐温60、PEG400单月桂酸酷、 Atlas-G1441 (聚氧乙烯山梨醇羊毛脂衍生物)、Ameroxol (聚氧乙烯油醇醚)、Solulan 25 (聚氧乙烯Q5E0)羊毛醇醚)、Emulphor (聚氧乙烯脂肪醇)、Myrj 49(聚氧乙烯单硬脂酸酷)的ー种或两种以上的組合。
6.根据权利要求4所述的多肽/蛋白类药物納米粒的制备方法，其特征在干，所述HLB 值为3-6的非离子表面活性剂是选自司盘80、司盘60、ArlaCel80(失水山梨醇单油酸酷)、Emcol D0-50( ニ乙ニ醇脂肪酸酷)、Ameroxol (聚氧乙烯(2E0)油醇醚)的一种或两种以上的組合。
7.根据权利要求1所述的多肽/蛋白类药物納米粒的制备方法，其特征在干，步骤⑷ 中所述急速冷冻是指浸入液氮或干冰或放入超低温冰箱中短时间内凝固为固体；所述冷冻干燥的參数为冷阱温度-55士2. 5°C，真空度0. 22-0. 25mBar，干燥时间12小时以上。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法制备而得的多肽/蛋白类药物納米粒。
全文摘要
本发明公开了一种高载药量高包封率多肽/蛋白类药物纳米粒的制备方法。本发明所述的方法是将药物、生理相容性高分子材料、交联剂、表面活性剂溶于水相，将亲油性表面活性剂溶于非极性溶剂作为油相，将水相加入油相中，通过机械分散形成为纳米乳液；在上述乳液中加入冻干保护剂乳液；超低温急速冷冻后冷冻干燥除去水和非极性溶剂，即得多肽/蛋白类药物纳米粒。本方法使用毒性较低的非极性溶剂，具有高凝固点、低沸点，易于除去的特点；无加热过程，多肽或蛋白产品不易失活；制备工艺简单，易于生产放大；产品为高包封率、高载药量、重分散性能良好的多肽/蛋白纳米粒，适合作为药物载体或中间体。
文档编号A61K38/00GK102552174SQ20111037045
公开日2012年7月11日 申请日期2011年11月18日 优先权日2011年11月18日
发明者冯敏, 尹丽芳, 韩丽娜 申请人:中山大学