专利名称：一种用于基因靶向传递的siRNA载体复合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种非病毒阳离子载体的基因治疗组合物，更具体的说，涉及一种磁小体与阳离子载体SiRNA载体复合的基因治疗复合物，属于纳米材料生物医学领域。
背景技术：
RNA干扰(RNA interference，RNAi)利用具有同源性的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)降解与其序列互补配对的mRNA，沉默相应靶位基因的表达。随着人们对RNAi 分子机制理解的进一步深入，小干扰RNA (Small interfering RNA, siRNA)作为一种新型基因治疗药物，为癌症等绝症的治疗带来了希望。有效输运是开发RNAi作为广泛的治疗平台最具挑战性的障碍。如何选择合适的载体提高目标基因携带进入相关目标组织细胞的效率，并使其不被降解，是实现siRNA治疗的难题。目前，非病毒阳离子载体成为替代病毒载体作为基因载体的研究热点。由于阳离子载体表面带正电荷，细胞膜表面带负电荷，两者很容易结合，通过细胞的内吞作用形成内涵体被摄入到细胞内，阳离子载体的氨基可以结合质子，起PH值缓冲作用，保护进入内涵体的基因不被溶酶体酶降解，质子海绵效应使载体因进一步大量结合质子而膨胀，并伴随高渗透压引入的大量水分，导致内涵体破裂解体，将基因释放出来。趋磁细菌磁小体(Bacterial magnetic nMioparticles，BMPs)为趋磁细菌 (Magnetotactic bacteria)体内合成的含有单磁畴的氧化铁或硫化铁(Fe3O4或！^ )晶体，大小均勻为纳米级(20-100纳米)，在外加磁场的作用下有趋磁性，磁小体外有生物膜包被，因此有不团聚、无毒性、免疫原性低等特点，是作为药物、基因等的理想载体。因此，如何将非病毒阳离子载体与磁小体复合，作为合适的载体，实现siRNA治疗成为急需解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的缺点，提供一种提高目标基因携带进入相关目标组织细胞的效率，并使其不被降解的用于基因靶向传递的siRNA载体复合物。同时，本发明目的还旨在提供一种用于基因靶向传递的siRNA载体复合物的制备方法。为了解决以上技术问题，本发明提供一种用于基因靶向传递的siRNA载体复合物，其特征在于，所述siRNA载体复合物为由磁小体、非病毒载体和目的siRNA组成的复合体系，其中所述目的siRNA为与疾病或癌症相关的siRNA。本发明进一步限定的技术方案是所述磁小体为制取自趋磁细菌或现购的磁螺菌属模式菌株AMB-1、格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌MSR-I之一的链状颗粒，其中所述趋磁细菌为从太湖水体淤泥中经富集和筛选得到。进一步的所述磁小体的粒径大小为30 60纳米。进一步的所述目的siRNA的长度为21-23个核苷酸。进一步的所述非病毒载体为聚乙烯亚胺、树状大分子、壳聚糖及其衍生物、和阳离子脂质体中的一种或一种以上，带正电的非病毒载体与目的siRNA的磷酸骨架及带负电的细胞膜表面相结合。一种制备SiRNA载体复合物的方法，包括步骤I、提纯制备磁小体，并对纯净的磁小体进行、射线照射灭菌，测定OD66tl，定量制成备用物；
II、设计并合成与疾病相关的目的siRNA，在缓冲液中稀释保存，定量备用；
III、选取一种或一种以上非病毒载体制成溶液，按非病毒载体中氨基N与目的siRNA中磷酸基P的适当比例混合，在一定温度和PH值条件下静置或振荡，使目的siRNA和非病毒载体通过静电或共价结合制成初级复合物；
IV、将步骤I的备用物与步骤III制得的初级复合物混合，在一定温度和pH值条件下， 通过静电或共价结合，制得siRNA载体复合物。以上制备方法进一步限定的技术方案是步骤I中所述的提纯制备磁小体的方法为采用超声波破碎法或细胞压榨机法破碎菌体并离心沉淀，用磁铁吸附磁小体后再用磷酸缓冲液冲洗干净。进一步的步骤I中所述的测定OD66tl的方法为吸光度法。进一步的步骤IV中备用物与初级复合物按其中磁小体与目的SiRNA质量比为 1:5 1:1混合。本发明的有益效果是本发明所述的用于基因靶向传递的siRNA载体复合物由与肿瘤疾病的相关siRNA、非病毒基因载体、磁小体三部分组成，制备方法简便，基因传递效率高；非病毒基因载体带正电荷，可以有效中和siRNA的电负性，提高载体复合体系进入细胞的效率，并给予siRNA有效的保护，避免RNA酶的降解作用；在磁场的作用下，可以有效提高基因传递效率；可以完成siRNA的传递，并借助磁小体的趋磁作用，使siRNA转染率提高，靶向到达目的组织细胞。
具体实施例方式本发明旨在提出一种提高目标基因携带进入相关目标组织细胞的效率，并使其不被降解的用于基因靶向传递的siRNA载体复合物及其制备方法。该siRNA载体复合物的结构特征为由磁小体、非病毒载体和目的siRNA组成的复合体系，其中目的siRNA为与疾病或癌症相关的siRNA，长度为21-23个核苷酸。其中，该磁小体的粒径大小为30 60纳米，其载体可以是从太湖水体淤泥中经过富集和筛选得到的趋磁细菌，也可以是从市面直接购得的磁螺菌属模式菌株AMB-I和/或格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌MSR-I。为便于说明本发明siRNA载体复合物的制备方法，以下便以从太湖水体淤泥中经富集和筛选的趋磁细菌和购得的磁螺菌属模式菌株AMB-I为例，详细说明制法的工艺情况。实施例1
一种用于基因靶向传递的siRNA载体复合物，其特征在于，所述siRNA载体复合物为由趋磁细菌磁小体、非病毒载体和目的siRNA组成的复合体系，其中所述目的siRNA为与疾病或癌症相关的siRNA，长度为20-23个核苷酸。其中，所述趋磁细菌磁小体为从太湖水体淤泥中经过富集和筛选得到的趋磁细菌进一步制得，其粒径大小为30 60纳米；所述非病毒载体为聚乙烯亚胺、树状大分子、壳聚糖及其衍生物、和阳离子脂质体中的一种或一种以
4上，带正电的非病毒载体与目的SiRNA的磷酸骨架及带负电的细胞膜表面相结合。所述用于基因靶向传递的SiRNA载体复合物的制备方法为I、采用超声波破碎法或细胞压榨机法破碎菌体并离心沉淀，用磁铁吸附磁小体后再用磷酸缓冲液冲洗干净， 对纯净的趋磁细菌细小体进行Y射线照射灭菌，测定OD66tl，定量制成备用物，具体为取从太湖水域中富集培养的趋磁细菌8000g-10000g，超声震荡破碎趋磁细菌并离心沉淀菌体， 用磁铁吸附磁小体，用磷酸缓冲液(PBS，pH7. 4)反复清洗，配合以轻微超声震荡，并重新悬浮与PBS中。取清洗干净的磁小体，进行Y-射线(15kGy)照射灭菌，用无菌PBS缓冲液悬浮，采用吸光值法测定0D_，定量磁小体备用。II、设计并合成与疾病相关的目的siRNA，在缓冲液中稀释保存，定量备用， 具体为选取经典的GFP基因沉默来评价BMP s -壳聚糖-s i RNA复合传递体系，根据公知的EGFP合成目的siRNA序列包括5 ‘-GCAAGCUGACCCUGAA⑶UCdTdT-3，及 3 ‘-dTdTC⑶UCGACUGGGACUUCAA-5’ 的双链 RNA。III、选取一种或一种以上非病毒载体制成溶液，按非病毒载体中氨基N与目的 siRNA中磷酸基P的适当比例混合，在一定温度和pH值条件下静置或振荡，使目的siRNA和非病毒载体通过静电或共价结合制成初级复合物，具体为取壳聚糖(IlOkd)溶液与siRNA 溶液按N/P (壳聚糖中的氨基N与siRNA中磷酸基P的比例)比为2-5进行连接，在0. 9%的 NaCl溶液中振荡混合20-40秒，温度为50_60°C。IV、将步骤I的备用物与步骤III制得的初级复合物混合，在一定温度和pH值条件下，通过静电或共价结合，制得siRNA载体复合物，具体为按照趋磁细菌磁小体 BMPs siRNA质量比为0. 2-1混合，在0. 9%的NaCl溶液中静置20-40分钟，即制得BMPs-壳聚糖-siRNA复合物。在本发明中，制得的BMPs-壳聚糖-siRNA复合物大小为80-150纳米。所述复合物采用磁小体siRNA复合载体体系进行体外转染时，需在细胞的培养皿下放置磁铁(磁场强度为300mT—600mT)5-10分钟，方能保证一定的转染率。转染能稳定表达绿色荧光蛋白 (GFP)的细胞株，荧光显微镜观测绿色荧光蛋白表达收到抑制的水平。实施例2
实施例2中制备的复合物结构与实施例1中相同，所述用于基因靶向传递的siRNA载体复合物的制备方法为I、采用超声波破碎法或细胞压榨机法破碎菌体并离心沉淀，用磁铁吸附磁小体后再用磷酸缓冲液冲洗干净，对纯净的趋磁细菌细小体进行Y射线照射灭菌，测定0D·，定量制成备用物，具体为取纯净的磁螺菌属模式菌株AMB-1，进行γ-射线 (15kGy)照射灭菌，将其中的磁小体用磁铁吸附起来，用无菌PBS缓冲液(pH7. 4)反复清洗磁小体，并用PBS缓冲液悬浮磁小体，采用吸光度法测定0D_，进行磁小体定量备用。II、设计并合成与疾病相关的目的SiRNA，在缓冲液中稀释保存，定量备用，具体为以目标基因XIAP为例，XIAP基因能阻止细胞凋亡，与肿瘤的发生、发展密切相关，该基因在大多数的肿瘤细胞中均过度表达，因此可以作为肿瘤诊治的靶点，参考相关文献中针对XIAP基因靶位点的siRNA序列进行合成目的siRNA序列包括正义链 5 ‘-⑶GGUAGUCCU⑶U CAGCdTdT-3，和反义链 3 ‘-dTdTCACCAUCAGGACAAA⑶CG-5，的双链 RNA。III、选取一种或一种以上非病毒载体制成溶液，按非病毒载体中氨基N与目的siRNA中磷酸基P的适当比例混合，在一定温度和pH值条件下静置或振荡，使目的siRNA和非病毒载体通过静电或共价结合制成初级复合物，具体为将聚乙烯亚胺PEI (25KDa)稀释至适当的浓度，与siRNA按照Ν/Ρ (PEI中的氨基N与siRNA中磷酸基P的比例)比为5_15 进行连接，连接反应体系为0. 9%的NaCl溶液，于室温静置30分钟，得到ΡΕΙ-siRNA复合物。IV、将步骤I的备用物与步骤III制得的初级复合物混合，在一定温度和pH值条件下，通过静电或共价结合，制得siRNA载体复合物，具体为按照磁小体siRNA质量比为 0. 2-1混合，在0. 9%的NaCl溶液中静置20-40分钟，即制得BMPs-PEI_siRNA复合物。在本发明中，制得的BMPs-PEI-siRNA复合物大小为80-150纳米。所述复合物能够稳定表达XIAP基因的细胞，例如乳腺癌癌细胞系MCF-7，采用癌细胞MCF-7裸鼠模型进行siRNA抗肿瘤效果的检测，对裸鼠进行瘤内注射BMPs-PEI-siRNA复合物。进行体内转染时，在注射部位保持磁场(300-600mT) 20-40分钟。除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
权利要求
1.一种用于基因靶向传递的siRNA载体复合物，其特征在于，所述siRNA载体复合物为由磁小体、非病毒载体和目的siRNA组成的复合体系，其中所述目的siRNA为与疾病或癌症相关的、人工合成的siRNA。
2.根据权利要求1所述的一种用于基因靶向传递的siRNA载体复合物，其特征在于， 所述磁小体为制取自趋磁细菌或现购的磁螺菌属模式菌株AMB-1、格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌 MSR-I之一的链状颗粒，其中所述趋磁细菌为从太湖水体淤泥中经富集和筛选得到。
3.根据权利要求2所述的一种用于基因靶向传递的siRNA载体复合物，其特征在于，所述磁小体的粒径大小为30 60纳米。
4.根据权利要求1所述的一种用于基因靶向传递的siRNA载体复合物，其特征在于，所述目的siRNA的长度为20-23个核苷酸。
5.根据权利要求1所述的一种用于基因靶向传递的siRNA载体复合物，其特征在于，所述非病毒载体为聚乙烯亚胺、树状大分子、壳聚糖及其衍生物、和阳离子脂质体中的一种或一种以上，带正电的非病毒载体与目的siRNA的磷酸骨架及带负电的细胞膜表面相结合。
6.一种制备权利要求1所述的siRNA载体复合物的方法，其特征在于包括步骤I、提纯制备磁小体，并对纯净的磁小体进行Y射线照射灭菌，测定OD66tl，定量制成备用物；II、设计并合成与疾病相关的目的SiRNA，在缓冲液中稀释保存，定量备用；III、选取一种或一种以上非病毒载体制成溶液，按非病毒载体中氨基N与目的siRNA中磷酸基P的适当比例混合，在一定温度和PH值条件下静置或振荡，使目的siRNA和非病毒载体通过静电或共价结合制成初级复合物；IV、将步骤I的备用物与步骤III制得的初级复合物混合，在一定温度和pH值条件下， 通过静电或共价结合，制得siRNA载体复合物。
7.根据权利要求6所述的一种用于基因靶向传递的siRNA载体复合物的制备方法，其特征在于，步骤I中所述的提纯制备磁小体的方法为采用超声波破碎法或细胞压榨机法破碎菌体并离心沉淀，用磁铁吸附磁小体后再用磷酸缓冲液冲洗干净。
8.根据权利要求6所述的一种用于基因靶向传递的siRNA载体复合物的制备方法，其特征在于，步骤I中所述的测定OD66tl的方法为吸光度法。
9.根据权利要求6所述的一种用于基因靶向传递的siRNA载体复合物的制备方法，其特征在于，步骤IV中备用物与初级复合物按其中磁小体与目的siRNA质量比为1 5 1 1 混合ο
全文摘要
本发明公开了一种用于基因靶向传递的siRNA载体复合物，所述siRNA载体复合物为由磁小体、非病毒载体和目的siRNA组成复合体系，其中目的siRNA为与疾病或癌症相关的siRNA。同时，本发明还公开了一种用于基因靶向传递的siRNA载体复合物的制备方法，通过静电或共价结合制成磁小体-非病毒载体-siRNA的复合物。本发明公开的用于基因靶向传递的siRNA载体复合物中，带正电荷的非病毒基因载体能有效中和siRNA的电负性，给予siRNA有效的保护，避免RNA酶的降解作用。在磁场的作用下，磁小体可以有效提高目标基因的传递效率。
文档编号A61K48/00GK102552936SQ20111039214
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月1日 优先权日2011年12月1日
发明者于昊, 宋琴, 张蓓蓓, 程国胜 申请人:中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所