提取异硫氰酸酯的方法

专利名称：提取异硫氰酸酯的方法
技术领域：
本发明的实施方案涉及从植物材料中提取异硫氰酸酯的方法。更具体但不排外地讲，本发明的实施方案涉及从芥菜种子和芥菜种子精油中提取主要的湿气敏感性异硫氰酸酯的方法。
背景技术：
消费品能够为微生物的快速生长提供良好的环境。在生产或包装过程中，这种暴露可能并且确实经常导致产品无意地接种了微生物。随后，腐败微生物例如食品中的腐败微生物经摄取产品提供的营养成分而快速増殖。防腐剂如山梨酸盐、苯甲酸盐、有机酸及其混合物已经用于各种产品，特别是食品和饮料，以提供一定的微生物抑制度。然而其中某些有效抑制微生物生长剂量的防腐剂会 给产品带来异味，从而造成产品不适用于其指定用途。类似地，天然防腐剂如游霉素在很多情况下用于食品和饮料产品中，以抑制微生物生长。遗憾的是，虽然这些天然防腐剂可有效地抵抗酵母或细菌，但是它们可能不能有效抵抗两者。已经公开，包含异硫氰酸酯的芥菜植物精油在口腔治疗中以及对于特定食品表现出抗细菌和抗真菌功效。參见例如Sekiyama等人的1994年8月2日公布的转让给NipponSanso Corp.的美国专利5，334，373 ;和Madaus等人的1976年12月21日公布的美国专利3，998，964。芥菜精油中的异硫氰酸酯化合物是提供抗微生物效果的活性试剂。来源于白芥菜或黄芥菜植物(Sinapis alba或Brassica alba)的精油也提供上述抗细菌和抗真菌有益效果。此外，异硫氰酸酯化合物在较低用量下是有效的抗微生物剂。存在于白芥菜精油中的主要的异硫氰酸酷、4-羟基苄基异硫氰酸酯(4-HBITC)是湿气敏感性化合物，其暴露于水分下数小时内开始降解(即水解)。当降解吋，4-羟基苄基异硫氰酸酯形成4-羟基苄醇等化合物。然而，从芥菜植物中分离和提取白芥菜精油存在问题。与挥发性的并且可以蒸汽蒸馏的大多数其它植物精油不同，白芥菜精油在大气压下不挥发，并且需要通过采用溶剂或方法如超临界流体提取将它从种子中提取出来。此外，与大多数其它植物精油不同，白芥菜精油较不稳定，当暴露于水分时尤其如此。该不稳定性要求附加的条件，当精油生成吋，将其从芥菜种子中提取出来，并且其后即刻稳定，以保持其抗微生物特性。目前，芥菜处理工业主要利用白芥菜粉末，而精油很大程度上被忽视。事实上，为利用没有芥菜“热”敏性的白芥菜粉末，使磨碎的芥菜粉末经历热去活化步骤。这里有意将黑芥子酶(其催化4-羟基苄基异硫氰酸酯由其前体4-羟基苄基葡糖异硫氰酸酯形成)去活化，因此当该粉末与潮湿的食品如肉和香肠混合时，所述精油不会形成。此外，由于4-羟基苄基异硫氰酸酯的不稳定性，无论是作为天然产物还是作为纯化学品，其当前均无法商购获得。因此，基于上述全部理由，白芥菜精油在本领域没有因其抗细菌和抗真菌效果而被广泛知晓或广泛利用。然而，本发明人已惊奇地发现，在一个实施方案中，通过向磨碎的脱脂芥菜种子中加入水以产生白芥菜精油，使用溶剂或超临界流体提取白芥菜精油，通过移除溶剂和残余水分干燥精油，然后将所得白芥菜精油与吸湿性载体紧密混合，包含于其中的湿气敏感性异硫氰酸酯化合物能够被稳定。因此，白芥菜精油与吸湿性载体的共混物随后能够用作固体食品的有效抗细菌剂和抗真菌剂。较大規模制备白芥菜精油中所涉及的按比例放大问题和白芥菜精油的不稳定性未被參与提取精油的其它人所认识到。例如，所涉及的ー些公布描述第一溶剂提取步骤，以移除芥菜油的不挥发性组分或甘油三酯组分，然后在用水活化前将脱脂芥菜种子除溶剤，以生成活性组分4-羟基苄基异硫氰酸酷。制备WMEO的其它早期尝试包括下列步骤，如所涉及领域中所述。如DE2046756A中所述，第一溶剂提取磨碎的芥菜种子以移除所有不挥发性油，干燥所述种子，用水润湿并且使生成4-HBITC的反应进行至多24小时，用丙酮提取湿芥菜种子残余物，减压移除丙酮，并且用96%こ醇提取残余物以获得活性组分4-HBITC的溶液。GB 224524描述，从芥菜种子中溶剂提取或压出不挥发性油，然后加入水以形成糊状物质，使其反应24小时至48小吋，以使白芥子硫苷前体转化成白芥子硫苷芥菜油。挤压该糊状物质以移除水、黑芥子酶、芥子酸硫酸氢盐、糖和痕量的4-HBITC之后，用こ醚溶剂提取残余物以及压过的提取物，并且减压移除醚，以获得白芥子硫苷油。US 6824796描述了从叶菜和根茎如山葵中提取异硫氰酸酯的方法。此处，通过在水中碾磨植物材料将黑芥子酶催化剂活化后，使用植物油 作为异硫氰酸酯的溶剤。科学文献还描述了基于下列的方法首先使用溶剂将芥菜种子脱月旨，然后干燥种子以使其去除任何残余溶剂，在水中压碎脱脂的种子，并且在溶剂的存在下使反应进行约 24 小时(Borek, V. & Morra, M. J. , 2005, “ Ionic thiocyanate productionirom 4-hydroxybenzyl glucosinolate contained in Sinapis alba meal，，， Journal oiAgricultural and Food Chemistry, 53,8650-8654 ；Vaughn, S. V.和 Berhow, M. A, 2005,“Glucosinolate hydrolysis products from various plant sources pH effects,isolation and purification，，，Industrial Crops and Products,红，193-202)。在所有这些实例中，黑芥子酶体系的全部潜力未被利用，而且由此提取方法的时间和其它物流不提供切实可行的条件，以经济的方式获得任何エ业规模量的白芥菜种子精油。上文的ー些方法使整个过程増加非常高的成本以及处理另ー溶剂移除和蒸发步骤的额外负担。另ー些方法没有尝试通过加入已知的黑芥子酶活化剂如抗坏血酸来加速反应，从而使得大規模エ艺非常低效和耗吋。文献中也没有展示通过采用适当比率的部分脱脂芥菜种子、水和こ酸こ酯而能够实现的过程效率，所述比率使得低速离心步骤能够分离出包含白芥菜精油的溶剤。发明概述一个实施方案涉及产生精油的方法。它能够包括提供包含葡糖异硫氰酸酯前体和黑芥子酶的植物材料，其中所述植物材料包含不挥发性油；降低所述植物材料的粒度以产生粉末；通过使用水溶剂和促进剂活化所述黑芥子酶以形成浆液，其中所述黑芥子酶催化所述葡糖异硫氰酸酯前体产生包含异硫氰酸酯的精油；并且将所述浆液分离成精油和残余溶剂。另ー个实施方案涉及产生精油的方法。它能够包括提供包含前体白芥子硫苷和黑芥子酶的芥菜种子，其中所述芥菜种子包含不挥发性油；任选地，降低所述芥菜种子中的不挥发性油含量；降低所述种子的粒度以产生芥菜粉末；通过使用水溶剂和促进剂活化所述黑芥子酶以形成浆液，其中所述黑芥子酶催化所述白芥子硫苷前体产生包含异硫氰酸酯的精油；并且将所述浆液分离成精油和残余溶剂。所述精油能够为白芥菜精油，其能够包含湿气敏感性异硫氰酸酯化合物，所述化合物能够为4-羟基苄基异硫氰酸酷。发明详述I.定义除非另外指明，本文所用的所有百分比、比率和比例均按重量计。应当理解，在本说明书中给出的每ー上限值包括每ー个下限值，即如同上述下限值在本文中所明确表示的。在本说明书全文中给出的每ー最小数值限度将包括每ー较高数值限度，如同该较高数值限度在本文中被明确表示。在本说明书全文中给出的每ー数值范围将包括包含于该较宽数值范围内的每ー较窄数值范围，如同该较窄数值范围在本文中被明确表不。所有项目的列表，例如成分的列表，均旨在作为并应当被解释为马库什(Markush) 群组。因此，所有的列表均可被理解和解释为“选自由”项目的列表“以及它们的组合和混合物组成的组”的项目。本文引用的是本发明所用的包括多种成分的组分的商品名。本文的发明者不旨在限于某ー商品名的物质。在本文的描述中与以商品名引用的那些材料等价的材料(如以不同的名称或參考号从不同来源得到的那些)可以被取代和应用。本文的组合物和方法可包括本文所描述的任何特征或实施方案，或基本上由其组成，或由其组成。在本公开的多个实施方案的描述中，公开了多个实施方案或独特的特征。对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是，这些实施方案和特征的所有组合都是可能的并可导致本公开的优选实施。虽然只举例说明和描述了本发明的多种实施方案和个别特征，在不脱离本发明实质和范围的条件下，可以对其进行各种改变和变型。还显而易见的是，前述公开中提出的实施方案和特征的所有组合都是可能的并可导致本发明的优选实施。如本文所用，当用于权利要求或说明书中时，包括“所述(the) ”、“ー个(a和an) ”的冠词被理解为是指一个或更多个受权利要求书保护或受说明书保护的物质。如本文所用，术语“包括”、“包含”和“涵盖”旨在为非限制性的。如本文所用，术语“多个”是指ー个以上的。如本文所用，术语“抗微生物效果”是指产品抑制微生物的生长，移除微生物和/或换句话讲减少微生物的存在，所述微生物包括例如酵母、细菌、霉菌和/或真菌，优选酵母和/或细菌。如本文所用，“精油”涉及能够从植物中蒸馏或提取出的所有化合物组合，所述油衍生自所述化合物组合，并且所述化合物组合给出该植物特有的芳香。參见例如H. McGee的“On Food and Cooking”，Charles Scribner’s Sons, 154-157 (1984)。根据本发明的实施方案，所述精油优选源自白芥菜或黄芥菜植物(Sinapis alba或Brassica alba),其能够产生湿气敏感性异硫氰酸酯化合物，并且更具体地讲为4-羟基苄基异硫氰酸酯(4-HBITC)。如本文所用，术语“湿气敏感性”是指异硫氰酸酯化合物在水的存在下降解。该降解通过水解反应进行，因此随着水存在下储藏时间的推移，导致活性异硫氰酸酯抗微生物剂含量減少。測定湿气敏感性的方法示于下文测试方法部分中。湿气敏感性异硫氰酸酯的特征在干，当悬浮在PH为约3. 6的磷酸盐缓冲水溶液中并且温度为约20°C至约23°C且时间超过24小时的时候，异硫氰酸酯化合物的浓度至少减少起始浓度的约20%。湿气敏感性化合物的ー个实例为4-羟基苄基异硫氰酸酷。如本文所用，与相应的精油有关的术语“天然组分”涉及得自天然存在的精油的本发明所用组分。如本文所用，术语“基本上不含”是指包含小于约0. 05重量％ (即小于约500份
每ー百万份)。II.方法的实施方案 本发明的实施方案涉及从植物材料中提取异硫氰酸酯的方法。在ー个方面中，本发明的实施方案涉及从植物中提取油的方法。本发明的实施方案涉及从芥菜种子和芥菜种子精油中提取主要的湿气敏感性异硫氰酸酯的方法。A.异硫氰酸酯化合物根据本发明的实施方案，所述方法包括从植物中提取精油。此类油可包括白芥菜精油(WMEO)。此类白芥菜精油可包含异硫氰酸酯化合物，其可为湿气敏感性化合物。因此，本文公开的实施方案可包括从来源于芥菜植物的白芥菜精油中提取湿气敏感性异硫氰酸酷化合物(即具有-N = C = S部分的化合物)，如化合物4-羟基苄基异硫氰酸酷。以前已经确定此类化合物在食品中具有有益的抗微生物活性。參见转让给The Procter & GambleCompany的美国专利7,658,961。已知,经常将这些化合物与已知的防腐剂苯甲酸、山梨酸或它们的盐联合使用，和/或可将湿气敏感性异硫氰酸酯化合物如白芥菜精油中的4-羟基苄基异硫氰酸酯与吸收、吸取和结合水分的吸湿性载体组合，而不使用这些已知的防腐剤。虽然本文公开方法的实施方案能够提取任何湿气敏感性异硫氰酸酷，但是4-羟基苄基异硫氰酸酯(4-HBITC)的提取是其ー个具体的实施方案。在本发明的实施方案中，包含湿气敏感性异硫氰酸酯化合物的组分可为白芥菜或黄芥菜族(Sinapis alba或Brassica alba)的精油、精油的天然组分、或精油的合成组分(均更详细描述于下文中)。已知，植物中的芸苔族是具有约2000个物种和超过300个属的小族(參见例如由A. S. Naidu 编辑的“Natural Food Antimicrobial Systems”, CRC Press LLC,第 399-416页，2000)。作为另外一种选择，包含湿气敏感性异硫氰酸酯化合物的组分可为精油、精油的天然组分、或精油的合成组分，所述精油为可产生湿气敏感性异硫氰酸酯化合物的任何其它族植物的精油。參见例如由0. R. Fennema编辑的“Food Chemistry”, Marcel Dekker,Inc ,第 602-603 页(1985),和“Naturally Occurring Antimicrobials in Food, Councilfor Agricultural Science and Technology”第 31-32 页(1998)。如本领域已知，可将例如任何芸苔属物种的种子和/或花朵匀化、磨碎、碾碎、压制或换句话讲破坏，以活化相应精油的一个或多个前体(例如葡糖异硫氰酸酷)。已知从所述油开始的异硫氰酸酯化合物的生产通过在例如匀化、碾磨、粉碎、压制或换句话讲破坏植物、它们的种子和/或花朵的基础上的酶催化而发生。參见例如1994年I月20日公布的Concannon 的 WO 94/01121,和 Brown 等人的“Glucosinolate-Containing Plant Tissuesas Bioherbicides，，，Journal of Agricultural Food Chemistry,第 43 卷,第 3070-3074页(1995)。通常已知在与葡糖异硫氰酸酯相互作用后參与异硫氰酸酯化合物生产的酶是黑芥子酶，其还被称为硫葡糖苷酶(并且具有酶分类号EC 3. 2. 3. I)。已知黑芥子酶对各种葡糖异硫氰酸酯是非特异性的。
因此，本文的实施方案可涉及包含葡糖异硫氰酸酯前体和黑芥子酶的任何植物材料，一个非限制性实例为芥菜种子。在具体的实施方案中，包含湿气敏感性异硫氰酸酯化合物的植物材料是预想的。植物材料可包括十字花科(Brassicaceae)(以前为Cruciferae),并且ロ包括介米(Brassica nigra, Brassica juncea, Brassica hirta 或bmapis alba)、卷ンLi、米(Brassica oleracea；(B. oleracea var. botrytis)、抱^1 甘
(B. oleracea var. gemmifera) >(B. oleracea var. italicaノ 、大头米(B. oleracea
var. gongylodes)、芥末(或日本山葵)(Wasabia japonica)、低芥酸菜籽(B. napus)和芜菁(B.rapa)。其它非限制性实例包括其它植物材料，如刺山柑(白花菜科)和辣木科。B.提取方法因此，本文公开了从芥菜植物精油中提取异硫氰酸酯化合物的方法实施方案。在一个实施方案中，由白芥菜或黄芥菜(Sinapis alba)提供包含约5%至约35%的4_羟基 苄基异硫氰酸酯(4-HBITC)的白芥菜精油(WMEO)。可制得包含约10%至约30%的4-羟基苄基异硫氰酸酯(4-HBITC)的WME0。可制得包含约15%至约27%的4-羟基苄基异硫氰酸酷(4-HBITC)的WME0。可制得包含约22%至约28%的4-羟基苄基异硫氰酸酯(4-HBITC)的WME0。其它实施方案包括包含白芥菜精油的组合物，所述白芥菜精油包含约30%至约
35%的4-羟基苄基异硫氰酸酯(4-HBITC)，然而可制得包含约30 %至约35 %的4-羟基苄基异硫氰酸酯(4-HBITC)的白芥菜精油。白芥菜精油中的该活性化合物4-HBITC为湿气敏感性化合物，其暴露于水分下数小时内开始降解(即水解)。因此，4-HBITC在中性pH下非常易于水解。如所述，白芥菜种子包含其前体白芥子硫苷和黑芥子酶(硫代葡萄糖苷水解酶)。当通过加入水活化时，形成湿的芥菜种子，黑芥子酶催化白芥子硫苷的降解，获得4-羟基苄基异硫氰酸酷。在适当的反应时间后，4-HBITC和其它脂溶性材料转移到溶剂层中，然后可与湿芥菜种子中分离。接着可在低温下减压移除溶剤，以获得包含4-HBITC的WMEO。根据均转让给 The Procter & Gamble Company 的 US6, 361，812B1 ；US 6, 558, 723B2 ；US 7，105，190B2和US 7，658，961，可为干性的该4-HBITC配制剂可用作防腐剤。提取方法可包括下列一般步骤，所有步骤不是必须需要的，并且所有步骤描述于下文中1)冷挤压或溶剂提取芥菜种子，以移除不挥发性油；2)压碎脂肪減少或无脂肪的芥菜种子，以获得脱脂白芥菜粉末；3)将脱脂白芥菜粉末加入到包含活化剂抗坏血酸的溶剂和水的混合物中；4)使黑芥子酶催化的白芥子硫苷水解反应发生一段时间，并且使4-羟基苄基异硫氰酸酯溶于溶剂中；5)使包含4-羟基苄基异硫氰酸酯的溶剂与湿脱脂芥菜粉末分离；6)减压移除溶剤，以获得包含4-羟基苄基异硫氰酸酯的白芥菜精油；并且7)干燥湿脱脂芥菜粉末，以获得低温烘干(deheated)并脱脂的芥菜粉。在一个实施方案中，可首先将白芥菜种子冷压，以尽可能多的移除种子油，而不增加压榨饼的温度。在一个实施方案中，压榨饼的温度可低于约70°C，以确保压榨饼中保留黑芥子酶活性。将所述压榨饼磨碎后，在一个实施方案中可使其润湿，以致使黑芥子酶活化，催化白芥子硫苷至4-HBITC的水解。在一个实施方案中，可使用约I毫摩尔的抗坏血酸作为黑芥子酶的有效活化剂。起反应的湿芥菜体系中可混入溶剤，这可确保当使用こ酸こ酯溶剂时，由所述反应制得的4-HBITC将转移到亲脂性こ酸こ酯层中。反应时间后，在一个实施方案中，在约4小时的反应时间后，可分离出こ酸こ酯层。压榨饼水こ酸こ酯比率可为约I : 0.3 : 2，以避免形成稳定的乳液，并且具有足够的水以使酶活化。可通过离心将包含4-HBITC和残余芥菜油的こ政こ酯从反应体系中移出，并且立即真空蒸发以获得WMEO。此处，在一个实施方案中，可避免干燥こ酸こ酷。然后可使WMEO保持冷冻，以避免4-HBITC降解。然而，如US 7，658，961中所提出的，可实施WMEO在麦芽糊精上的包覆，以使其能够贮藏于冷藏温度或室温下。现在更具体地描述如本文所述的提取方法的实施方案。i.减少油含暈在一个实施方案中，提供后，可降低包含前体白芥子硫苷和黑芥子酶的芥菜种子不挥发性油的含量。芥菜种子的不挥发性油含量为约26重量％至约28重量％。不挥发性油含量由存在于芥菜种子中的甘油三酯构成。含量降低后，芥菜种子的不挥发性油含量可为约2%至约10%，或约4%至约9%，或约6%至约8%。降低油含量可包括机械压榨，如冷榨或溶剂提取芥菜种子以移除不挥发性油，然后将脂肪減少或无脂肪的芥菜种子压碎，以获得脱脂白芥菜粉末。 在一个实施方案中，可采用机械压榨如冷榨以降低不挥发性油含量。如本领域所熟知的，冷榨可一般涉及使待冷榨的物体经受温度和压カ。在一个实施方案中，冷榨可包括使芥菜种子经受如上所述的压力和温度，并且不使用溶剂提取，从种子中提取精油。该实施方案可被称为“榨油”，并且可不采用溶剂提取。压榨后，移除尽可能多的油。在此类实施方案中，可将温度保持等于或低于约70°C，或低于约50°C。该温度可保留黑芥子酶活性。当油被提取或压榨后，油以及油提取后留下的压饼可如下文所公开的进行处理。在一个实施方案中，可将压饼压碎、研磨，或换句话讲通过降低粒度加工成芥菜粉末。如所述，可通过例如冷榨将芥菜种子机械压搾。该压榨可制得压制的包含精油的芥菜种子粉饼。一般来讲，芥菜种子具有约26%至约28%的油含量，和约6%至约7%的含水量。通过冷榨或压碎芥菜种子，由于含水量不足以维持酶作用，因此不会发生黑芥子酶催化的葡糖异硫氰酸酯水解反应。因此，芥菜种子提供供压出或排出不挥发性油的良好来源。搾油可在许多不同类型的机器中进行，以制得脱脂粉末。在一个实施方案中，单螺杆压机可在压榨压榨筒内的芥菜种子。单螺杆压机可包括具有榨筒的螺杆一端处的进料料斗，其中将种子压榨以挤出油的另一端处的冲头，以及介于料斗和冲头之间的有孔部分。有孔部分使压榨的油能够流出。压制的芥菜种子形成脱脂压饼，其能够被挤压或迫使通过冲头内的喷嘴，并且当它离开机器时可形成连续圆柱形粒料。这些机器的大热容量能够防止压饼温度升得远远超过有益于挤压芥菜种子的约60°C至约65°C。此时，脱脂压饼可具有约6-8 %的残余脂肪，并且还包含前体白芥子硫苷和酶黑芥子酶。在一个实施方案中，挤压步骤期间压饼经受的温度不足以使黑芥子酶变性。接着，脱脂芥菜可以圆柱形粒料形式离开压榨机，所述粒料可被研磨成细粉，其在一个实施方案中可成为方法下ー步的原材料。在另ー个实施方案中，可使用称为笼型挤压机的ー类螺杆压机。在该实施方案中，具有挤压螺杆的榨筒可从靠近进料料斗的点开槽至榨筒的末端。挤压螺杆可对着这些狭槽挤压芥菜种子以压出油，所述油可经由纵向狭槽与植物碎屑一起离开榨筒。可调节狭槽间隔和挤压螺杆压カ件，以获得最清澈的油，和具有可能最低油含量的脱脂压饼。长挤压区域产生大量摩擦，和由此产生的热。此类挤压机的热容量低，因此压饼趋于温热至至多约80°C至约85°C的温度。因此，在一些实施方案中，脱脂压饼的黑芥子酶活性可能因温度的这种升高而受到不利的影响。如果当压饼从挤压机离开时温度为约70°C至约75°C，它可被稍后冷却，从而保持足够的酶活性以在压饼润湿时催化白芥子硫苷的水解。脱脂压饼可包含至多17%的残余脂肪。使用笼型螺杆压机的另一个变化是将芥菜种子分成两批。可将该批中的第一批挤压，使得压饼温度不升高超过约65°C至约70°C，而可将第二片挤压以使除油最大化，而不考虑压饼温度。如此，当挤压后将两批再合并时，最终残余油含量可大大低于17%，并且在润湿时，合并的压饼以及第一批中的黑芥子酶将是活性的，并且能够将两批中的白芥子硫苷水解成4-羟基苄基异硫氰酸酯。根据水解反应催化所需的酶活性，可改变两批的比例。例如，可将芥菜种子分成三批。可使该批中的两批经历更高温度的挤压步骤，而可使第三批经历较低温度的挤压步骤，从而保留该第三批的酶活性。可将三批再合并以获得远远小于17%的最终残余油含量，和足以将所有批次中的白芥子硫苷催化水解成4-羟基苄基异硫氰酸酯的酶活性。由上文方法降低油含量后，提供了脱脂芥菜压饼或粉末，并且进行进一步处理。
用溶剂处理然后可处理粉末或压饼，以提取残余的不挥发性油并且活化黑芥子酶。此类处理可通过加入溶剂和促进剂来进行。溶剂可包括水溶剂、乙酸乙酯、水、以及它们的组合和混合物。溶剂可与粉末或压饼一起加入到反应容器中以形成反应混合物。加入溶剂和促进剂后，黑芥子酶将被活化，并且芥菜粉饼或粉末与溶剂和促进剂形成浆液。黑芥子酶可催化白芥子硫苷前体产生包含异硫氰酸酯的精油。如本文所述，精油可为WME0，并且异硫氰酸酯可为湿气敏感性异硫氰酸酯如4-HBITC。可用于提取部分脱脂芥菜压饼中残余不挥发性油以及生成的4-羟基苄基异硫氰酸酯的溶剂包括但不限于乙酸乙酯、己烷、庚烷、甲基戊烷、二氯甲烷和氯仿。在一个实施方案中，使用乙酸乙酯。乙酸乙酯不是水溶性的，因此可易于经由简单的离心步骤从反应混合物中移除。此外，乙酸乙酯与水形成低沸共沸物，其具有91. 53%乙酸乙酯和8. 47%水的组成，沸点为70. 4°C，与纯乙酸乙酯的77. 2°C形成对比。该形成使得分离出的乙酸乙酯能够无需预干燥步骤而从最终溶剂移除步骤中去除，这是因为所加入的水同样由与乙酸乙酯形成的共沸物移除。用于从溶剂中移除水的干燥剂在重新使用之前必须再生，并且需要将它们加热并且在使用前保存在干燥条件下。除了水以外，干燥剂的再生还释放出残余的溶齐U，并且此类蒸气不能放空到大气中，因此需要蒸气涤气和溶剂回收步骤，这增加了复杂性和成本。使用乙酸乙酯作为溶剂的额外有益效果在于，乙酸乙酯与水形成的共沸物将乙酸乙酯沸点降低约7°C，从而能够在较低温度下蒸发。溶剂能够在反应槽中与所需量的水混合，并且可将部分脱脂的粉化芥菜压饼在混合下加入到所述槽中，以确保充分润湿。在另一个实施方案中，可使部分脱脂的粉化芥菜压饼首先与干燥的活化剂/促进剂混合，以确保同质，并且在混合容器中用所需量的水润湿。然后可将溶剂加入到该混合容器中，并且首先在高速下混合以确保同质，然后在低速下混合以保持浆液为悬浮态，以供反应发生，并且使4-羟基苄基异硫氰酸酯转移到溶剂中。在其它实施方案中，可使用乙酸乙酯和水的组合。乙酸乙酯和水的具体量可变化。在使用部分脱脂芥菜压饼的实施方案中，脱脂芥菜压饼内容物中的脂肪可与所用溶剂量有关。在一个实施方案中，脱脂芥菜压饼可具有高达17%的脂肪含量。在该实施方案中，加入的水可保持小于约40%，同时乙酸乙酯最大含量为用于形成芥菜浆液的部分脱脂芥菜压饼重量的2倍。该实施方案可避免形成稳定的乳液。在一个实施方案中，可避免形成乳液，以能够经由下文所述的简单离心步骤，将乙酸乙酯从反应混合物中分离出来。因此，在一个实施方案中，控制适当量的水分，使得反应开始，并且在乙酸乙酯和白芥菜粉末之间分配，但不过度而形成乳液。此外，选择脱脂白芥菜水乙酸乙酯比率，以提供足够的水，使当润湿的脱脂芥菜压饼与乙酸乙酯混合时，黑芥子酶催化的白芥子硫苷至4-羟基苄基异硫氰酸酯的水解反应有效发生，并且还避免形成上述稳定乳液。此外，在一个实施方案中，PDMS :水乙酸乙酯的比率可为约I : 0.4 : 1.8。因此，在一个实施方案中，基于重量，脱脂芥菜压饼与水以及乙酸乙酯的比率可为I份脱脂芥菜压饼0. 4份水1. 8份乙酸乙酯。在另一个实施方案中，PDMS 水乙酸乙酯的比率按重量计可为约I : O. 25 : I. 5至约I : O. 5 : 3。 还可使用促进剂。促进剂是使由黑芥子酶催化的反应加速的物质。在一个实施方案中，促进剂可为抗坏血酸。在其它实施方案中，可使用金属盐。可加入介于约O. 75毫摩尔至约3毫摩尔之间，或约I. O毫摩尔至约2. 5毫摩尔之间，I. 5毫摩尔至约2. O毫摩尔之间，或约I. O毫摩尔的促进剂。所用促进剂的量能够适当活化黑芥子酶。较低的量可能不提供黑芥子酶的适当活化，而较高的量可与4-HBITC反应形成称为抗坏血酸原的化合物，其可降低4-HBITC的收率。可因下列原因而使用这些促进剂。黑芥子酶或硫代葡萄糖苷水解酶(E. C. 3. 2. I. 147)为具有可接纳促进剂如抗坏血酸分子的一个或多个位点的酶。从工艺可行性角度上看，加入低浓度例如约ImM的抗坏血酸如本文所公开那些，可使反应速率有利进行。不存在活化剂时，约21°C室温下，溶剂中4-HBITC的最大浓度出现在包含部分脱脂白芥菜、水和溶剂的反应浆液中约24小时后。加入促进剂如抗坏血酸后，类似反应体系中的最大浓度在约3-4小时内达到，并且该浓度在接下来的20-22小时内保持不变，提供足够宽的时间窗以离心并且分离大规模生产体系中的与水不混溶的有机溶剂。在一个实施方案中，部分脱脂芥菜种子(PDMS)可直接加入到溶剂混合物中以形成浆液。通过在反应容器中将部分脱脂芥菜种子直接加入到溶剂如乙酸乙酯-水混合物中，然后加入促进剂，工艺可因避免了麻烦的预润湿步骤而提速。当用水润湿时，PDMS趋于形成团块，相比之下，当PDMS易于润湿并且易于分散形成易于搅拌的浆液时加入到乙酸乙酯-水混合物可使浆液反应特定的反应时间。在一个实施方案中，反应时间可为约4小时。在另一个实施方案中，反应时间可为至多约4小时。在另一个实施方案中，反应时间可为约3小时至约5小时。在另一个实施方案中，反应时间可为约2小时至约6小时。在另一个实施方案中，反应时间可为约I小时至约8小时。在另一个实施方案中，反应时间可为至少约I小时。此外，在一个实施方案中，将纤维素酶类酶加入到PDMS中，也可提高该反应阶段期间4-HBITC的收率。iii·分离此外，可接着实施分离步骤。可实施分离步骤，以从反应混合物中分离出溶剂，使得浆液分离成滤饼、精油和残余溶剂，其中精油和残余溶剂可为富含精油的溶剂，其随后分离成精油和残余溶剂。在生成4-HBITC的上述水解反应完成后，可将浆液分离。在一个实施方案中，可将浆液分离成滤饼、精油和残余溶剂，其中精油和残余溶剂可为富含精油的溶剂，其随后分离成精油和残余溶剂。因此，可从湿芥菜滤饼中出分离出包含所有4-HBITC的溶剂如乙酸乙酯(如果使用的话)，然后如下文所述进一步分离，以获得精油。该分离可由如本领域已知的任何分离技术实现。例如，该分离技术可包括离心或过滤。在一些实施方案中，可进行过滤、批量或连续离心。在一个实施方案中，可在上述反应之后立即进行分离。在另一个实施方案中，可在反应后约I小时内进行分离。在另一个实施方案中，可在反应后约2小时内进行分离。在一个实施方案中，可在密闭过滤体系内进行过滤。可使用该密闭过滤体系，因为乙酸乙酯是挥发性的，并且一般应控制，以使向大气中的蒸发最小化。由于乙酸乙酯的挥发特性，还可使用密闭容器内包含滤饼的过滤器。一些实施方案包括立式和卧式叶片过滤器、 滤过器、烛形过滤器、以及具有类似设计的其中可在密闭或封闭环境中实现过滤的过滤器。在另一个实施方案中，可实施离心。在一个实施方案中，湿芥菜浆液在分离前可具有约30%至约39%的可移除固体(悬浮固体)材料。在一个实施方案中，湿芥菜浆液在分离前可具有约32%至约35%的可移除固体(悬浮固体)材料。在一个实施方案中，湿芥菜浆液在分离前可具有约33%至约34%的可移除固体(悬浮固体)材料。在该固体含量下，一个分离实施方案可包括滗析离心机。滗析离心机可包括旋转的圆柱形卧式筒体，所述筒体一端具有圆柱段，并且另一端具有径向倾斜锥形段，并且在上述两段之间具有倾斜度较小的任选段。在筒体的锥形段中可整合涡壳，并且可分离驱动。湿芥菜和溶剂混合物(湿芥菜浆液)可通过被布置居中的进料管进入分离空间，所述进料管通过筒体的圆柱段伸入。湿芥菜浆液可在离心力作用下旋甩到内筒壁上。可与筒壳以不同速率旋转的涡壳可将分离出的芥菜固体传送至筒锥段，其中固体通过筒端排放口排出。也可同时分离出乙酸乙酯溶剂物流，并且可在圆柱端离开滗析器。排放出的湿芥菜固体可直接落在以低真空运作的连续带式烘干机上。烘干机内的温度可保持在约70°C至约75°C，使得从芥菜中蒸发出湿乙酸乙酯，之后蒸发出水。低真空可产生足够的拉力，迫使乙酸乙酯蒸气和水蒸气向真空源移动。包含乙酸乙酯蒸气的输出蒸气和水蒸气可均接触冷却旋管，所述冷却旋管将两种蒸气冷凝成它们的液体形式。可将冷凝的液体抽到分离槽中，其中乙酸乙酯和水分离。乙酸乙酯可被回收以提取下批芥菜种子。可在该真空烘干机中将湿芥菜干燥并且完全除溶剂。在一个实施方案中，可将湿芥菜粉饼分离成如本文所述的低温烘干并脱脂的芥菜粉和残余溶剂。芥菜粉可如本文所述使用。在一个实施方案中，在离心出残余湿芥菜粉饼后，乙酸乙酯可在蒸发前在干燥剂如无水硫酸钠上干燥以移除残余的水。然而，在另一个实施方案中，已发现由于乙酸乙酯与约8%的水形成共沸物，所得沸点降为约8°C，因此直接蒸发潮湿的乙酸乙酯获得WME0，而不形成水层。采用此分离技术，可使芥菜固体与溶剂物流分离。然后，溶剂物流可包含溶剂如乙酸乙酯中含4-HBITC的WMEO浓缩溶液，然后可在蒸发形成精油和残余溶剂之前贮存于槽中。iv.讲一步分离因此，在一个实施方案中，可实施自溶剂物流中进一步分离溶剂如乙酸乙酯，获得残余溶剂和包含4-HBITC的含WMEO精油。在一个实施方案中，蒸发可在较低的压力和温度下进行，以避免对WMEO的不利热效应。可采用若干类型的真空蒸发。在一个实施方案中，蒸发可经由蒸发器单程移除约99%或更多的乙酸乙酯，从而使对WMEO的热降解效应最小化，因此可产生4-HBITC。可使用多种蒸发器以达到该目的。升膜式蒸发器、降膜式蒸发器、离心式蒸发器是可使用的蒸发器。因此，在一个实施方案中，该蒸发可获得精油。在一个实施方案中，通过包含约5 %至约35%的4-羟基苄基异硫氰酸酯(4-HBITC)的白芥菜精油(WMEO)。在其它实施方案中，制得包含约10%至约30%的4-HBITC的WME0。在其它实施方案中，制得包含约15%至约27%的4-HBITC的WME0。在其它实施方案中，制得包含约22%至约28%的4-HBITC的 WMEO0V.讲一步富集在一个实施方案中，可发生白芥菜精油中4-HBITC的进一步富集。在一些实施方案中，可存在富集的需要，因此对于需要较高风味品质的应用，对白芥菜精油作净化。为支持这些应用，可如下进一步纯化WMEO :首先将WMEO与己烷、庚烷或甲基戊烷以一份WMEO比约I. 2至约I. 3份己烷、庚烷或甲基戊烷的比率混合。此类混合可移除WMEO中的一些甘油三酯材料，并且可致使包含大部分4-HBITC的下层油层与己烷分离。可将该提取重复一次至两次或更多次，以确保WMEO进一步富集。然后可将己烷层合并，并且重复用无水甲醇提取以移除己烷层中的4-HBITC。然后可合并甲醇层和原下层油层，并且减压蒸发，以获得高度富集的WME0，其具有约30重量％至约80重量％的4-HBITC。高度富集的WMEO可包含约35重量％至约75重量％的4-HBITC。高度富集的WMEO可包含约45重量％至约70重量％的4-HBITC。高度富集的WMEO可包含约49重量％至约65重量％的4-耶11^。高度富集的WMEO可包含约45重量％至约55重量％的4-HBITC。高度富集的WMEO可包含约35重量％至约80重量％的4-HBITC。高度富集的WMEO可包含约40重量％至约80重量％的4-HBITC。高度富集的WMEO可包含约45重量％至约80重量％的4-HBITC。高度富集的WMEO可包含约50重量％至约80重量％的4-HBITC。之后，此高度纯化的WMEO可适于加入到需要较高风味品质的食物和饮料产品中。在另一个实施方案中，为易于分配并且为确保较大的稳定性，可接着使WMEO与水溶性吸湿物质如麦芽糊精以适宜的比率混合。由于WMEO现富含4-HBITC，因此WMEO与麦芽糊精的比率小于I : 9。在一个实施方案中，范围可为约I : 6至约I : 9。包含一种或更多种湿气敏感性异硫氰酸酯化合物(优选4-羟基苄基异硫氰酸酯)的精油自身可随后用于例如 US 6，361，812B1 ；US 6，558，723B2 ；US 7，105，190B2 和 US7,658,961中所述的组合物和方法中。vi.讲一步处理如本文参考文献中所述，可对WMEO和/或4-HBITC实施其它处理。在一个实施方案中，可实施WMEO冷冻。此类冷冻可保存精油。可在低达约_25°C下实施冷冻。冷冻后，可将WMEO放入到麦芽糊精或任何其它吸湿性载体中，并且如例如US 6，361，812B1 ；US6，558，723B2 ；US 7，105，190B2 和 US 7，658，961 中所述使用。III.杭微牛物功效白芥菜精油中4-羟基苄基异硫氰酸酯的浓度取决于起始部分脱脂白芥菜压饼的脂肪含量。该特性适用，因为溶剂溶解所得湿芥菜粉末中的所有脂溶性材料，并且白芥菜精油组成为起始部分脱脂白芥菜压饼中4-羟基苄基异硫氰酸酯和残余脂溶性材料的总和。例如，如果使用未经任何脱脂并且具有约26-28%初始脂肪含量的完整芥菜种子作为原料，则WMEO中的4-HBITC浓度为约5-6%;当使用具有约17. 5%脂肪含量的部分脱脂白芥菜粉末作为原料时，WMEO中的4-HBITC浓度为约10. 1% ;当起始部分脱脂白芥菜中的脂肪含量为约14%时，WMEO中的4-HBITC浓度为约15. 5-15. 9% ;当起始脱脂白芥菜中的脂肪含量为约8. 2%时，所得WMEO中的4-HBITC浓度为约24% ;最后当起始部分脱脂白芥菜中的脂肪含量为约6-7%时，WMEO中的4-HBITC浓度为约26%。不受理论的束缚，起始部分脱脂白芥菜中的脂肪含量与WMEO中4-HBITC浓度大致线性相关。如果起始白芥菜压饼是完全脱脂的，则WMEO中4-HBITC浓度可达到高达约90%。本发明人已惊奇地发现，WMEO的抗微 生物效果范围取决于其中4-羟基苄基异硫氰酸酯的浓度。例如，4-羟基苄基异硫氰酸酯浓度为约5-6%的WMEO仅能够有效抵抗革兰氏阴性菌生物体，并且已发现对革兰氏阳性菌生物体的生长基本上无效应。当WMEO中4-羟基苄基异硫氰酸酯浓度为约15%时，除了观测到对革兰氏阴性菌生物体的持续抑制效应以外，还观测到对革兰氏阳性菌生物体的显著但有限的抑制效应。当WMEO中4-羟基苄基异硫氰酸酯浓度为约24%时，观察到非常显著的对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌生物体的抑制效应。不受理论的束缚，本发明人相信，除了 WMEO中4-HBITC以外还存在的不挥发性芥菜油对4-HBITC施加分配效应，这可减缓或防止其释放到含水介质中，这是对抗微生物的作用所需的。革兰氏阴性菌微生物具有由脂多糖构成的细胞壁，而革兰氏阳性菌微生物具有主要由肽聚糖类分子构成的细胞壁。脂多糖类结构中具有高含量的脂质，本发明人相信疏水性化合物如4-HBITC将与该结构密切缔合，而肽聚糖类结构中不存在脂质，致使此类缔合较少。因此，为增强其活性范围，而且为需要较高风味品质的应用，可实施具有较低浓度4-HBITC的白芥菜精油的进一步富集和净化。为支持这些应用，可如下进一步纯化WMEO :首先使WMEO与己烷或甲基戊烷以I份WMEO与约I. 2至约I. 3份己烷或甲基戊烷的比率混合，以移除WMEO中的一些甘油三酯材料，并且使包含大部分4-HBITC的下层油层与己烷分离。可将该提取重复一次至两次以上，以确保WMEO进一步富集。然后可将己烷层合并，并且重复用无水甲醇提取以移除己烷层中的4-HBITC。然后可合并甲醇层和原下层油层，并且减压蒸发，以获得高度富集的具有大于50%的4-HBITC的WME0。此高度纯化的WMEO适于加入到需要较高风味品质的食物和饮料产品中。为易于分配并且为确保较大的稳定性，可接着使WMEO与水溶性吸湿物质如麦芽糊精以适宜的比率混合。由于WMEO现富含4-HBITC，因此WMEO与麦芽糊精的比率可小于约I : 9。IV.粉末所得低温烘干并脱脂的干燥芥菜粉可具有约42 %，或约35 %至约45 %，或约35 %至约45%，或约38%至约43%的蛋白质含量。所述粉末可具有约2. 5%，或约1%至约5%，和约2%至约4%的脂肪含量。由于移除白芥菜精油的处理，没有改变具有乳化特性的芥菜种子粘液，并且所得低温烘干并脱脂的芥菜粉可用于原指定用途，作为肉制品的乳化剂，具有脂肪低的附加有益效果。与低温烘干的仍具有未遭损坏的白芥子硫苷前体的接触来自食品供应中另一来源的葡萄糖苷酶时可产生不可取的“热”的芥菜粉不同，如本文公开的低温烘干并脱脂的芥菜粉在接触其它食物源时将不产生任何“热”。此外，低温烘干并脱脂的芥菜粉中的高蛋白质含量可使其自身增加其它用途，作为富含蛋白质产品中的蛋白质源。采用芥菜蛋白质的早期方法涉及使用多种溶液从芥菜种子中提取出蛋白质组分，从而减弱蛋白质组分的乳化特性。本文所述方法允许食物处理者具有灵活性，使用低温烘干并脱脂的整个芥菜，或单独使用蛋白质，没有因意外活化黑芥子酶体系而产生不可接受的“热”的风险。因此，本发明的一个实施方案涉及低温烘干并脱脂的芥菜粉。干燥得自上文分离步骤的湿芥菜压饼后，以良好收率形成脱脂并低温烘干的芥菜粉。该低温烘干并脱脂的芥菜粉不存在白芥子硫苷，因为所有白芥子硫苷已被水解成4-羟基苄基异硫氰酸酯，并且黑芥子酶因干燥步骤而被大幅度变性。因此，一个实施方案包括低温烘干并脱脂的芥菜粉。低温烘干并脱脂的芥菜粉可基本上不含白芥子硫苷，和/或基本上所有的黑芥子酶可被变性。与芥菜粉末相关的涉及其粘液的乳化特性被充分保留于低温烘干并脱脂的芥菜粉中。所得低温烘干并脱脂的芥菜粉可具有约42 %，或约35 %至约45 %，或约35 %至约45 %，或 约38%至约43%的蛋白质含量。所述粉末可具有约2. 5%，或约1%至约5%，和约2%至约4%的脂肪含量。由于低温烘干并脱脂的芥菜粉基本上没有白芥子硫苷，和/或黑芥子酶已被变性，因此将不出现与湿芥菜粉末相关的热觉。因此，芥菜粉末可用于需要乳化剂或高蛋白质组分的许多情形。例如，所述粉末可用作当前所用芥菜粉末的替代物。具体实例包括用于肉糜如香肠中；在高蛋白质巴型产品中用作与大豆和低芥酸菜籽粗粉相似的高蛋白质来源；以及在宠物食品中用作高蛋白质组分。存在未发现充分分布于植物界中的较大量硫氨基酸如胱氨酸和甲硫氨酸以及赖氨酸，应增加蛋白质组分的品质。最后，考虑到若干高价值组分来源于该低温烘干并脱脂的芥菜粉，它是非常经济的。IV.用于测定4-羟基苄基异硫氰酸酯并且鉴定湿气敏感性异硫氰酸酯化合物的测试方法可采用超临界流体色谱法测定防腐剂组合物中4-羟基苄基异硫氰酸酯的量。首先将精确称量的防腐剂组合物溶解在相容的溶剂如乙酸乙酯或乙酸乙酯和乙醇的混合物中，或者固体防腐剂组合物用乙酸乙酯反复提取。经由超临界流体色谱法,采用具有以下修正的Buskov, S.等人的“Supercriticalfluid chromatography as a method of analysis for the determination of4-hydroxybenzylglucosinolate degradation products，，(Journal of Biochemical andBiophysical Methods,第43卷,第157-174页,2000),分析这些溶液。使用配备光电二极管阵列检测器的 Berger SFC 3D 体系(Berger Instruments Inc. , Newark, DE)进行分析。将包含对轻基苯甲酸丁酯的乙酸乙酯溶液(IOml)作为内标,注入到Cyano柱(15cmX5mm内径，5 μ m粒度，Phenomenex, Torrance, CA)中。炉温为50°C。移动相为使用4% MeOH作为调节剂的CO2，其维持在200巴压力下并且以2mL/min速率泵送。在226和252nm处检测洗脱液。4-羟基苄基异硫氰酸酯在约3. Smin处洗脱。其特征可通过用以下方式制得的合成4-羟基苄基异硫氰酸酯纯样本色谱法确认。
改进由Soledade, Μ. , Pedras, C.和 Smith, K. C.的题目为 “Sinalexin，phytoalexin from whole mustard elicited by destrucin B and Alternariabrassicane”(Phytochemistry, 46 (5),第 833-837 页，1997)所述的方法，并且如下使用。在IOOmL圆底烧瓶中，将硫光气(I. Ig, 9. 56mmol)溶于氯仿(20mL)中。随后,将溶于甲醇(20mL)中的对羟基苄胺(400mg，3. 25mmol)和三乙胺(820mg，8. ImmoI)的溶液滴加到用冰浴保持在0-4°C的搅动的溶液中。约30min后，加料结束，并且允许混合物在冰浴中再保留10分钟。通过在硅胶60254上使用Fcc洗脱液作为移动相的薄层色谱法，跟踪该反应。随后，在45°C下真空旋转蒸发移除溶剂，并且将残余物溶于二氯甲烷-乙酸乙酯(49+1 ；4mL)混合物中。通过快速柱层析进一步纯化所述化合物，其及其改进由Still,W.C. ,Kahn,Μ.和Mitra A. , J.描述于 “Rapid chromatographic method for separation with moderateresolution”(Organic Chemistry, 14,第 2923-2925 页，1978)中。用移动相冲刷柱子后，将溶于移动相(4mL)中的反应产物放置在柱子顶部。通过以一定方式调整氩气过压以使得溶剂顶端以约2inch/min下降，以进行洗脱。收集IOmL的等分试样。目标化合物通常在6-10部分洗脱出来。将该部分合并，并且在45°C下真空旋转蒸发移除溶剂后，获得黄色的油(典型收率66%)。通过⑶Cl3中的H1-NMRXDCl3中的C13-NMR、以及电子轰击模式下运 行的GC-MS，证实4-羟基苄基异硫氰酸酯的结构。通过在室温下将包含异硫氰酸酯的材料悬浮于含水磷酸盐缓冲液(pH为约3. 6)中，鉴定湿气敏感性异硫氰酸酯化合物。充分摇动所得悬浮液，并且将起点样品移入分液漏斗中，并且用乙酸乙酯提取。再用两体积乙酸乙酯重复该提取。将分离出的乙酸乙酯层合并，并且在无水硫酸钠上干燥，并且在用超临界流体色谱法分析起点异硫氰酸酯浓度前保持冷冻。为测定异硫氰酸酯化合物对水解降解的灵敏性，将异硫氰酸酯悬浮液在约20°C至约23°C的温度下储藏约24小时。在24小时后重复该提取过程，并且用超临界流体色谱法测定残余的异硫氰酸酯化合物的量。湿气敏感性异硫氰酸酯化合物的特征在于，在约24小时后异硫氰酸酯的浓度与起点浓度或起始浓度相比降低至少约20%。VI.实施例实施例I通过将水加至磨碎的白芥菜种子，然后根据本领域描述的已知方法用超临界二氧化碳提取精油，以产生白芥菜精油。提取后，经由离心或真空下干燥，立即将残余水分从精油中移除。所得白芥菜精油包含约25重量％的4-羟基苄基异硫氰酸酯。在室温(约20-230C )下，将精油悬浮于含水磷酸盐缓冲液(pH为约3. 6)中，并且如上文部分中所述，在起点和储藏约24小时后测定4-羟基苄基异硫氰酸酯的含量。在24小时后，4-羟基苄基异硫氰酸酯含量的百分降低率为约72%。因此，4-羟基苄基异硫氰酸酯为湿气敏感性异硫氰酸酯化合物。实施例2如下制备白芥菜精油首先使用Rosedowns Mini 200螺杆压机装置冷榨800kg白芥菜种子。所得压饼在约75-78°C下离开压机，并且由锤磨作用立即冷却至室温。压饼的油含量为17%。将约340kg锤磨过的白芥菜压饼加入到带式共混机中，并且向其加入78g抗坏血酸，同时共混以确保均匀混合。在室温下以小比例加入约102kg自来水，以确保压饼均匀润湿。在混合约10-15分钟后，将润湿且黑芥子酶活化的压饼转移到包含626kg乙酸乙酯的搅动的溶剂槽中。在室温下，活化的湿芥菜压饼和乙酸乙酯浆液在密闭的溶剂槽中搅拌约4小时，以确保4-羟基苄基异硫氰酸酯自湿白芥菜压饼产生并转移到乙酸乙酯中。在反应阶段结束时，将湿白芥菜压饼的乙酸乙酯浆液泵送至滗析离心机中，以使乙酸乙酯与湿白芥菜压饼分离。乙酸乙酯层收集于静态溶剂槽中，而将具有某些残余乙酸乙酯的湿白芥菜压饼直接转移到真空辅助的带式烘干机中。真空条件允许湿乙酸乙酯离开芥菜压饼，并且冷凝于外部冷凝器中。分离出乙酸乙酯顶层，并且储存以供再次使用，而将水层放出。芥菜压饼继续在连续带上行进至烘干机底部，此处不含溶剂的干燥芥菜压饼经由螺杆传送装置离开。对该低温烘干并脱脂的芥菜粉进行其总组成和其氨基酸组成的分析。将包含WMEO的乙酸乙酯层泵送至保持在约56cmHg真空下的升膜式蒸发器中，以从白芥菜精油中移除乙酸乙酯。蒸发步骤获得约65. 5kg包含8. 4%的4-羟基苄基异硫氰酸酯的 WMEO。 实施例3
如下制备白芥菜精油首先使用KK8型单螺杆压机(KERNKRAFT，Moosbauer andRieglsperger GbR. Germany)冷榨5kg白芥菜种子，以获得具有6. 8%不挥发性油的白芥菜压饼和约60°C的温度。将压饼锤磨，以提供均匀粉末，并且在秤盘上称出151. 5g粉末。在配备顶部传动搅拌器的密闭混合容器中，使45. 5g自来水与305mL乙酸乙酯和O. 036g加入的抗坏血酸混合，同时搅拌。加入抗坏血酸后，立即将部分脱脂的芥菜粉末加入到混合容器中，并且高速混合以确保均匀分散。当已形成均匀浆液时，将速率减慢，并且再持续混合4小时。此时将浆液从混合容器中移除并且离心，以使乙酸乙酯与部分脱脂的湿芥菜压饼分离。从离心管中滗析出乙酸乙酯，并且减压蒸发，获得约9. 5g包含27%的4-羟基苄基异硫氰酸酯的白芥菜精油。实施例4通过根据以下制剂，将实施例2的白芥菜精油与麦芽糊精一起研磨，制备粉末状防腐剂组合物。
重量％ 重量
白齐菜精油(得自实施例2)10.0% lO.Og
L0103J麦芽糊精(15 DE)90.0% 900g
总计100%IOOg将材料共混物紧密混合，或使用研钵和研杵研磨。所得防腐剂组合物中4-羟基苄基异硫氰酸酯的含量为约O. 84重量％。在室温(约21. 1°C)下，粉末状防腐剂组合物中的4-羟基苄基异硫氰酸酯的含量在防腐剂组合物储藏期间保持稳定。实施例5通过根据以下制剂，将实施例3的白芥菜精油与麦芽糊精一起研磨，制备粉末状防腐剂组合物。
重量％ 重量
白齐菜精油(得自实施例2)10.0% 7
麦芽糊精(15 DE)90.0% 90.0
总计100°/。IOOg 将材料共混物紧密混合，或使用研钵和研杵研磨。所得防腐剂组合物中4-羟基苄基异硫氰酸酯的含量为约2.6重量％。在室温(约21. rc )下，粉末状防腐剂组合物中的4-羟基苄基异硫氰酸酯的含量在防腐剂组合物储藏期间保持稳定。实施例6用生长在胰酪胨大豆琼脂斜面(35°C下培养)上的金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、肠炎沙门氏菌(ATCC 13076)、单核细胞增多性李斯特菌(ATCC 7644)以及生长在产气荚膜梭菌(SFP)琼脂斜面(厌氧条件下，35°C下培养)上的产气荚膜梭菌(ATCC 3624)培养物的20-24小时旧培养物，接种蛋白胨培养液(O. 5重量％，pH7. I)。起始计数介于IXlO5和IXlO7Cfu ml/1之间。将实施例4的粉末状防腐剂组合物加入到接种的培养基中，以达到350mg Γ1的起始4-HBITC含量，并且充分摇晃。样品储存在6. 5°C下，并且根据USP26 (United States Pharmacopoeia, Rockville, MD, USA),在用 Letheen 中和一天后，放置在微生物含量测试(MCT)琼脂上。微生物计数的平均对数降低对金黄色葡萄球菌而言为
2.23，对肠炎沙门氏菌而言为I. 61，对单核细胞增多性李斯特菌而言为O. 80，并且对产气 荚膜梭菌而言为2.17。实施例7用金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、肠炎沙门氏菌(ATCC 13076)、单核细胞增多性李斯特菌(ATCC 7644)的20-24小时旧胰酪胨大豆琼脂斜面，接种蛋白胨培养液(O. 5重量％，pH7. I)。产气荚膜梭菌(ATCC3624)培养物生长在产气荚膜梭菌(SFP)琼脂斜面上，并且在厌氧条件下，35°C下培养。起始计数介于I X IO5 I X IO7Cfu ml/1之间。将实施例5的粉末状防腐剂组合物加入到接种的培养基中，以达到360mg I/1的起始4-HBITC含量，并且充分摇晃。样品储存在6. 5°C下,并且根据USP 26 (United States Pharmacopoeia,Rockville，MD，USA)，在用Letheen中和一天后，放置在微生物含量测试(MCT)琼脂上。微生物计数的平均对数降低对金黄色葡萄球菌而言为3. 95，对肠炎沙门氏菌而言为4. 93，对单核细胞增多性李斯特菌而言为4. 17，并且对产气荚膜梭菌而言为5. 40。本文所公开的尺寸和数值不应被理解为严格限于所述确切数值。相反，除非另外指明，每个上述尺寸旨在表示所述值以及该值附近的函数等效范围。例如，所公开的尺寸“40_”旨在表示“约40_”。除非明确地不包括在内或换句话讲限制，本文所引用的每篇文献，包括任何交叉引用的或相关的专利或专利申请，均特此以引用方式全文并入本文。任何文献的引用不是对其作为本文所公开的或受权利要求书保护的任何发明的现有技术，或者其单独地或者与任何其它参考文献的任何组合，或者参考、提出、建议或公开任何此类发明的认可。此外，当本发明中术语的任何含义或定义与以引用方式并入的文件中术语的任何含义或定义矛盾时，应当服从在本发明中赋予该术语的含义或定义。尽管已用具体实施方案来说明和描述了本发明，但是对那些本领域的技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的实质和范围的情况下可作出许多其它的改变和变型。因此，随附权利要求书中旨在涵盖本发明范围内的所有这些改变和变型。
权利要求
1.一种产生精油的方法，包括 a)提供包含葡糖异硫氰酸酯前体和黑芥子酶的植物材料，其中所述植物材料包含不挥发性油； c)降低所述植物材料的粒度以产生粉末； d)通过使用水溶剂和促进剂活化所述黑芥子酶以形成浆液，其中所述黑芥子酶催化所述葡糖异硫氰酸酯前体产生包含异硫氰酸酯的精油； e)将所述浆液分离成精油和残余溶剂。
2.—种产生精油的方法，包括 a)提供包含前体白芥子硫苷和黑芥子酶的芥菜种子，其中所述芥菜种子包含不挥发性油； b)任选地，降低所述芥菜种子中的不挥发性油含量； c)降低所述种子的粒度以产生芥菜粉末； d)通过使用水溶剂和促进剂活化所述黑芥子酶以形成浆液，其中所述黑芥子酶催化所述白芥子硫苷前体产生包含异硫氰酸酯的精油； e)将所述浆液分离成精油和残余溶剂。
3.如任一项前述权利要求所述的方法，并且其中精油包含白芥菜精油，更优选地，其中所述精油包含湿气敏感性异硫氰酸酯化合物，并且甚至更优选地，其中所述精油包含4-羟基节基异硫氰1酸酷。
4.如任一项前述权利要求所述的方法，并且其中所述精油包含白芥菜精油，所述白芥菜精油包含约5%至约35%的4-羟基苄基异硫氰酸酯。
5.如任一项前述权利要求所述的方法，并且其中使所述芥菜种子中的不挥发性油含量从约26%至28%降低至约2%至约10%。
6.如任一项前述权利要求所述的方法，并且其中所述降低步骤在小于约70C下通过机械压榨被执行。
7.如任一项前述权利要求所述的方法，并且其中所述降低粒度包括由所述芥菜种子产生芥菜粉末。
8.如任一项前述权利要求所述的方法，并且其中所述水溶剂包含乙酸乙酯。
9.如任一项前述权利要求所述的方法，并且其中所述促进剂包含浓度为约O.75毫摩尔至约3毫摩尔的抗坏血酸。
10.如任一项前述权利要求所述的方法，并且其中所述水溶剂包含乙酸乙酯和水，芥菜与水以及乙酸乙酯的比率按重量计为约1:0. 25:1. 5至约1:0. 5:3。
11.如任一项前述权利要求所述的方法，并且其中活化进行约I小时至约8小时。
12.如任一项前述权利要求所述的方法，并且其中所述分离包括 1)将所述浆液分离成富含精油的溶剂和残余的湿芥菜粉饼；并且 2)将所述富含精油的溶剂分离成精油和残余溶剂，其中所述精油包含约5%至约35%的湿气敏感性异硫氰酸酯化合物。
13.如任一项前述权利要求所述的方法，并且其中所述分离还包括将所述湿芥菜粉饼分离成低温烘干并脱脂的芥菜粉和第二残余溶剂。
14.一种产生精油的方法，包括a)提供包含前体白芥子硫苷和黑芥子酶的芥菜种子； b)降低所述种子的粒度以产生芥菜粉末； c)通过使用水溶剂和促进剂活化所述黑芥子酶以形成浆液，其中所述黑芥子酶催化所述白芥子硫苷前体产生包含异硫氰酸酯的精油； d)将所述浆液分离成富含精油的溶剂和残余的湿芥菜粉饼； e)将所述精油与所述溶剂分离； f)将所述精油分配到烃溶剂中； g)将所述富含异硫氰酸酯的油与所述烃溶剂分离。
15.如权利要求14所述的方法，并且其中所述精油包含白芥菜精油，并且其中所述白芥菜精油包含4-羟基苄基异硫氰酸酯。
全文摘要
产生精油的方法。所述精油能够是白芥菜精油。所述白芥菜精油能够包括湿气敏感性异硫氰酸酯化合物。所述湿气敏感性异硫氰酸酯化合物能够是4-HBITC。所述精油能够由芥菜种子产生，所述芥菜种子能够包含前体白芥子硫苷和黑芥子酶。所述芥菜种子能够降低成粉末。通过使用水溶剂和促进剂活化所述黑芥子酶以形成浆液能够被执行，其中所述黑芥子酶催化所述白芥子硫苷前体产生包含异硫氰酸酯的精油。
文档编号A61K36/31GK102811727SQ201180016867
公开日2012年12月5日 申请日期2011年3月22日 优先权日2010年3月31日
发明者A.埃卡纳亚克, S.A.文迪斯特, J.J.克斯特, P.H.佐滕达姆, J.R.D.戴维 申请人:宝洁公司