专利名称：survivin基因叶酸受体靶向的新型脂质体的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型脂质体及其用途。基于急性髓细胞白血病细胞表面叶酸受体的高表达性与RNA干扰的用途，本发明公开了ー种叶酸受体靶向的新型脂质体。并利用细胞生物学技术与免疫学实验对所述脂质体进行了功能验证。
背景技术：
急性髓细胞白血病(acute myelocytic leukemia,AML)是多能干细胞或已轻度分化的前体细胞核型发生突变所形成的ー类疾病是造血系统的克隆性恶性疾病。人群接受大剂量放射线或长期接触苯可增加这类疾病的发病率。AML是ー个具有高度异质性的疾病群，它可以由正常髓系细胞分化发育过程中不同阶段的造血祖细胞恶性变转化而来，起源于不同阶段祖细胞的AML具有不同的生物学特征。对于AML的治疗主要有三种诱导缓解化疗、 缓解后治疗和造血干细胞移植等，效果不是很明显而且成本极高。AML患者总的完全缓解率仅50% 70%，长期无病生存率为25% 30%。伴随着AML致病机制被逐渐的解密，分子靶向治疗的发展成为了一种发展和趋势。如正对髓系相关的CD33抗原使用的单克隆抗体已经成为了ー种新的治疗方法，其他正对靶分子的方法还在不断发展中[Blood，2010，115 453-474]。细胞凋亡(Apoptosis)是细胞生命周期中的重要组成部分。它是ー种不同于坏死而是由基因调控的细胞主动性死亡过程。凋亡可清除DNA受损细胞，在肿瘤形成中发挥重要作用，如果细胞凋亡受到抑制，可使不稳定的细胞继续生存且进一歩突变而导致肿瘤发生。恶性血液病是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，同其他实体瘤一祥，细胞过度增殖和凋亡受阻是其发生的基础。细胞内与凋亡有关的基因分为两大类一是诱导凋亡基因；另一类是抑制凋亡基因家族(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs)。survivin (生存素)基因就属于IAPs家族的重要成员之一。通常IAPs家族蛋白结构包含2-3个串联含有半胱氨酸/组氨酸的杆状病毒TAP重复区序列(baculovins TAP repeat,BIR),其羧基末端有一保守的锌结合区域，亦称锌指结构。survivin是IAPs家族成员中最简单的蛋白分子，只有ー个部分保守的BIR结构域，其羧基端缺少锌指结构，survivin基因定位于17q25，，全长共编码142个氨基酸，生存素蛋白分子量为16500kD的胞浆蛋白[Ambrosini G7Adida C，A novel antiapoptosis gene survivin expressed incancer and phoma. NatMed,199(,3(8) 917]survivin的分布。免疫组化等研究表明，survivin除了在胎盘和胸腺组织中有微弱的表达外，在其他正常的组织中都检测不到[Altieri DC，Marchisio PC. survivinapoptosis an interloper Detween cell death and cellproliferation in cancer. LabInvest，1999，79 :1327-33]。但同时研究表明survivin基因的mRNA和蛋白在近乎所有的常见癌组织都有过量表达，这ー普遍分布现象显示基因在癌症中可能处于失控的表达状态[Ambrosini G，Adida C，A novel antiapoptosis gene survivin expressedincancer and phoma. NatMed，1997，3 (8) :917]。survivin 基因分布于胚胎、发育的胎儿组织，绝大多数肿瘤组织内，50% 80%的急性髓细胞白血病表达，但在分化成熟的正常组织中未见表达，为理想的基因治疗靶点。survivin抑制细胞凋亡的机制，主要是通过抑制caspase活性而发挥抗凋亡作用。它作用于各个凋亡途径的汇交点，即直接抑制終末效应蛋I=I caspase-J,caspase-9 矛ロ caspase—/[Tamm 丄，Wang Y, bausvilie E, et al. IAP-familyprotein survivin inhioits caspase activity and apotosis induced byFas(しl)95),Bax, caspases, and anticancer drugs. Cancer Res, 1998, 58 :5315-20] 另外也有研究认为survivin可能还通过与周期蛋白激酶cdk4等相互作用阻断凋亡信号转导通路从而抑制细胞凋亡。可以说survivin基因具有抑制细胞凋亡和调节细胞有丝分裂的双重功能，是联系细胞周期和细胞凋亡界面的重要因子。总之，survivin基因在肿瘤细胞，本例中涉及的是急性髓细胞白血病细胞表达的普遍性及相对于正常组织的特异性，使得应用靶向生存素survivin的抗肿瘤疗法具有较好的祀向性和可能性。
RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是 Andrew 和 Craig 等在 1998 年研究Caenorhabditis elegans相关基因功能时，发现并命名的新技术，随后此技术在全球得以广泛的开展和应用，特别是Elbashir等在《自然》上载文证实在哺乳动物细胞中可以应用RNAi技术后，揭开了 RNAi应用于哺乳细胞研究的新篇章。RNAi是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。其机制是双链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。在此基础上发展的RNA干扰技术，是指体外人工合成的或体内的双链RNA(dsRNA)在细胞内特异性的将与之同源的mRNA降解成小片段,使相应的基因沉默的技术[Fire A, Xu S, MontgomeryMK, et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNAinCaenorhabditis elegans. Nature. 1998 ；391 :806-811]。RNAi 是现代基因治疗重要手段之一，具有高度特异性，21nt干扰性小RNA在哺乳动物细胞中可以诱导强有力的特异性RNAi作用。RNAi基因抑制的有效性很大程度取决于siRNA靶序列的选择。通常ー个基因需要设计3 4个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。叶酸是维生素B复合体之一,相当于蝶酰谷氨酸(pteroylglutamic acid, PGA),是米切尔从菠菜叶中提取纯化的，故而命名为叶酸。有促进骨髓中幼细胞成熟的作用，人类如缺乏叶酸可引起巨红细胞性贫血以及白细胞減少症，对孕妇尤其重要。叶酸受体(folatereceptor, FR)是ー种可以介导细胞内化,将叶酸摄取入真核细胞胞楽;的一种高亲和カ受体。FR是由ー个基因家族的三个基因编码的一类单链糖蛋白家族，分子量38-40kD，对叶酸及5-甲基四氢叶酸具有高度亲和力。现已鉴定出三种FR受体FR-α、FR_i3和FR-Y。其中FR- a和FR- β通过糖基化磷脂酰肌醇定位在细胞膜上，而FR- Y则是ー种分泌性蛋白，1ΑΑ于胞夕卜[Hilgenbrink, A. R. ；Low, P. S. Folate Receptor-Mediated Drug Targeting From. Therapeutics toDiagnostics. J. Pharm. Sci. 2005,94, 2135-2146]。FR 是一种在肿瘤细胞膜表面高表达的细胞因子，在包括急性髓细胞白血病在内的恶性肿瘤细胞膜表面其活性和数量显著高于正常细胞，而FR在正常组织中几乎不表达。而在肿瘤组织中高表达并且具有高度亲合力，这种特性使FR可以成为肿瘤靶向治疗中的通路[Leamon CP and LowPb(2001)Folate-mediatedtarget mg from diagnost ics to drug and gene delivery.Drug DiscovToday 6 :44-51]。祀向治疗是指针对肿瘤细胞恶性表型的分子祀点,通过特异性细胞受体信号(本例中涉及survivin的抑制表达)等调节其功能，实现抑制肿瘤细胞生长或促进细胞凋亡的抗肿瘤作用。在体内靶向投递siRNA拥有重要的临床应用前景，但目前可用的方法缺乏靶向性，并且存在毒性问题。长期循环的叶酸受体靶向的脂质体可能是ー个传递寡核苷酸的新载体。本发明目的_在探讨叶酸受体靶向的脂质体在K562细胞(瘤细胞作为小鼠白血病皮下种植瘤模型)中传递包被siRNA的效率，在K562细胞中survivin基因呈现高表达水平。因此，我们研究叶酸受体祀向的脂质体包被的能特异性抑制survivin表达的siRNA能否在体内外下调survivin基因的表达，从而实现抑制肿瘤细胞生长或促进细胞凋亡的抗肿瘤作用。
发明内容
本发明公开了ー种新型的叶酸受体靶向的脂质体，具有抑制急性髓细胞白血病细 胞(K562细胞)生长的作用。本发明所述的脂质体为叶酸受体靶向的脂质体，由ニ硬脂酰磷脂酰胆碱(Di stearoy lphosphat idyl choline, DSPC)、胆固醇、离子化的氨基脂 1，2 ニ 油酸 _3_ ニ甲基酸铵丙烧(1, 2-dioleoyl-3-(dimethylammonio)propane, DODAP)、N-掠榈酸鞘氨Il- -I-玻怕四先聚こニ酉！· (N_palmitoylsphingosine_l_[succinyl—methoxypoly (ethyleneGlycol) 2000]，PEG-CerC16)、叶酸以及针对survivin基因的siRNA片段组成。所述siRNA的正义链选自SEQ ID NO :1，反义链选自SEQ ID NO :2。本发明公开了所述的脂质体在制备急性髓细胞白血病药物的用途。本发明还公开了所述脂质体的制备方法，包括以下步骤I)脂溶液的制备将ニ硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、1，2_ ニ油酸-3-ニ甲基酰胺丙烷、聚こニ醇溶于无水こ醇中，再加入不同剂量的叶酸-聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺(通过聚こニ醇将ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺与叶酸连接)，调溶液的PH到PH4. 0，然后，将300mM的柠檬酸溶液和40% (v/v)こ醇加入到该溶液中，形成脂溶液。2) siRNA 的制备在另ー个管中在ρΗ4· O的300mM的柠檬酸溶液和40% (v/v)こ醇溶液中制备SiRNA03)溶液混合65°C加热上述两种溶液，然后边轻轻涡旋边将脂溶液加入到siRNA溶液中，加入的比例为150 μ g siRNA/ μ mol液体。4)叶酸-PEG-脂质体-survivin siRNA 的纯化该混合物通过三层IOOnm聚碳酸酯过滤器过滤10次。该混合物在300mM pH 4. O的柠檬酸溶液中透析，除去多余的こ醇，并进ー步在HBS (20mM HEPES, 145mM NaCl，pH 7.6)中透析12h-18h，除去柠檬酸缓冲液，中和D0DAP，并释放任何与小泡膜表面相关的siRNA。最后，包含siRNA的叶酸受体靶向脂质体通过琼脂糖凝胶柱CL-4B从自由siRNA中被分离出来。
图 I 是 survivin 的表达情况。米用 survivin siRAN 20pmol、30pmol、40pmol、50pmol、60pmol分别组合，制备成相应的转染混合物，转染K562细胞，于转染48h采用RT-PCR 测定 survivin 表达水平(survivin mRNA/GAPDHmRNA Copies)。图2是半定量法测定各实验组survivin基因的相对表达量。I. 00E+00group Survivin-siRNA转染组；2. 00E+00group :无关干扰组转染组；3. 00E+00group :空脂质体组；4. 00E+00group :空白对照组。*Error Bars show 95. O % Cl of Mean Bars showsMeans. 图3是体内实验。RT-PCR定量分析脂质体注射治疗k562细胞复制小鼠皮下种植瘤模型后肿瘤细胞中survivin基因的表达抑制(RT-PCR测定survivinmRNA/GAPDH mRNAしopies)。图4(A，B, C)是流式细胞术监测基因治疗后肿瘤细胞凋亡情况。37天瘤体积21 X 15mm,有分叶,给予瘤周皮下注射叶酸-PEG-脂质体-siRNA 0. 2ml/只 天,连续4天。处死动物，取瘤体组织，用胶原酶IV溶解形成细胞悬液200目尼龙网过筛，调整细胞浓度I X 106，采用流式细胞术监测细胞凋亡情況。细胞凋亡结果如图4B。FITC为Annexin V(早期凋亡)，PE为PI (坏死细胞标记)。
具体实施例方式I.材料和方法I)细胞系K562细胞系用含10%胎牛血清的1640培养基培养；2mmol/L的L-谷氨酸；100IU/ml青霉素G ;100mg/mL链霉素；37°C，5% CO2孵箱孵育。培养基每3天更换一次。2) siRNA 的构建siRNA的寡核苷酸针对人survivin基因，survivin-siRNA序列如下正义链5，2GGATCCGACTTGGCCCAGTGTTTCTTTCAAGAGA AGAAACACTGGGCCAAGTC TTTTTT ATCGATA-3’ (SEQ ID 1)反义链3，-ACCTAGGCTGAACCGGGTCACAAAGAAAGTTCTCTTCTTTGTGACCCGGTTCAG AAAAAA TAGCTA-5，(SEQ ID 2)3)构建了叶酸-PEG-脂质体-survivin siRNA确立了 survivin基因RNAi的序列后,合成了叶酸-新脂质体-survivinRNAi转染系统，进行了小鼠的体内试验。以K562细胞为瘤细胞，复制了小鼠白血病皮下种植瘤模型，研究了叶酸-新脂质体-survivin RNAi转染系统对小鼠种植瘤survivin基因的抑制效果及其生物效应。制备叶酸-PEG-脂质体-survivin RNAi转染系统(I)制备ー种全新的脂质体，成分为ニ硬脂酰磷脂酰胆碱(Di stearoy lphosphat idyl choline, DSPC)、胆固醇、离子化的氨基脂 I，2 ニ 油酸-3- ニ甲基酸铵丙烧(1, 2-dioleoyl-3-(dimethylammonio)propane, D0DAP)及 N-掠榈酸鞘氨Il- —I—玻怕酉先深こ ニ 酉！· (N-palmitoylsphingosine-l-[succinyl-methoxypoly (ethylene Glycol) 2000]，PEG-CerC16)。DODAP在脂类双层膜系统中是一种阳离子脂质体，等电点6. 6，在酸性环境中(如PH4. O)，这种脂类带有正电荷，可以与带负电荷的寡核苷酸结合，所形成的DODAP/寡核苷酸复合物在含こ醇的缓冲液中可以与其它脂类反应，在通过透析去除こ醇后形成含寡核苷酸的脂质体，其体积为100-200nm，包裹寡核苷酸的效率为60-80 %，而脂类/寡核苷酸比率低至O. 15-0. 25，全身注射后它可以在血液中循环很长时间，副作用小，在体内具有广泛的应用潜能。(2)用新脂质体包裹survivin基因siRNA。(3)脂质体与叶酸连接将上述脂质体包裹的survivin基因RNAi与叶酸连接。其目的是通过白血病细胞膜高表达的叶酸受体，进ー步提高脂质体的靶向性，其转运效率可提高8-10倍。正常组织细胞基本不表达叶酸受体。4) K562细胞对叶酸-PEG-脂质体-survivin siRNA的吸收实验K562细胞被接种到24孔板，每孔5 X IO4个细胞，培养过夜。向细胞中加入以下浓度的包含有FR-靶向脂质体的siRNA 16. 7、50、100和150nmol/L。37°C下孵育I小时，然后用磷酸盐缓冲液(PBS) (3X3min)洗涤细胞。用细胞裂解液裂解缓冲液(含O. I %的Triton X-100的Tris-HCl，EDTA, pH值7. 6)裂解细胞，细胞裂解液HOOOrpm离心IOmin0荧光显微镜下检测上清中Cy3标记寡核苷酸。上清中蛋白的含量通过考马斯亮蓝G-250染色法检测。siRNA的吸收的结果表示为pg Cy3标记的siRNA/ug蛋白。LA-N-5对照组FR-靶向的脂质体siRNA的吸收的鉴定方法相同。5)K562细胞的转染实验Κ562细胞被接种到24孔板，每孔5Χ IO4个细胞，培养过夜。为四组，分别如下FR革巴向的survivin siRNA脂质体(siRNA浓度50pmol/L), FR革巴向的对照siRNA脂质体(对照 siRNA 浓度为 50pmol/L), survivin siRNA 无脂质体(survivin 基因 siRNA 浓度为50pmol/L)和空白对照组(同体积的脂质体)。在48h和72h后，survivin mRNA基因的表达及LA-N-5细胞的増殖根据下面方法进行检測。6)实时定量RT-PCR检测定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术SYBR Green I被用于survivin基因mRNA表达的检测。总RNA在25ul的反应体系中用第一链cDNA合成试剂盒合成。用Oligo-dT进行反转录。该混合物在30°C孵育60分钟，95°C，5min退火，然后储存在_20°C。我们用人类甘油三磷酸脱氢酶(hGAPDH)作为内參。I μ L(20 μ L)合成的cDNA在25 μ L的体系中扩增，包括2. 5 μ m dNTPs, 10 μ m的survivin基因(或hGAPDH)引物，1.25U的Taq DNA聚合酶。MYCN基因PCR扩增条件为95°C，45s ；64°C,45s ；72°C,45s ;40个循环，然后 72°C延伸 lOmin。hGAPDH PCR条件为95°C,25s ；58. 5°C, 25s ；72°C,25s ；40 个循环，然后 72°C延伸 IOmin0 survivin 基因 mRNA 的表达的计算survivin基因拷贝数/GAPDH的拷贝。7)体外K562细胞survivin基因mRNA定量检测接下来，37°C孵育Ih，每组用PBS洗两次(每次2min)。经过48h和72h培养后，收获的细胞进行总RNA提取。survivin基因mRNA的表达水平用荧光定量RT-PCR使用荧光染料 SYBR GREEN I。8) MTT法分析K562细胞的增殖K562细胞的生长情况通过MTT法进行检測。简单地说，5X IO3个细胞每孔接种于96孔板和培养过夜。然后于不同孔中分别加入以下试剂100nmol/L的包含FR靶向脂质体的survivin siRNA,或相同体积包埋脂质体的对照siRNA。接着37°C下孵育Ih后,用PBS洗(2X2分钟)。经过48し7211孵育后，每孔加2(^しMTT(5g/L)，培养。吸取含有MTT的培养基，甲臜晶体溶解在200 μ L ニ甲基亚砜(DMSO)中。490nm处测定其吸光度值。9)皮下移植瘤模型和基因治疗并采用流式细胞术监测细胞凋亡实验(I)移植瘤模型实验用K562细胞复制小鼠皮下种植瘤模型研究叶酸-新脂质体-survivin RNAi局部注射对白血病细胞的抑制作用。关于肿瘤模型的建立最佳年龄4周龄裸鼠,体重20g ；皮下成瘤注射细胞悬液浓度5xl07，O. 2ml/20g,成瘤时间10 14天；腹腔成瘤注 射细胞悬液浓度5x IO5,0. 5ml/20g,成瘤时间30 60天；皮下成瘤率高于腹腔成瘤，且易观察，容易測量，但皮下成瘤者易缺血坏死，平时活动易造成局部损伤；注射剂量SurvivinsiRNA 3mg/kg ；注射时间皮下成瘤注射细胞悬液浓度5xl0Vml，0. 2ml/20g，成瘤时间10 14天。然后开始注射survivin siRNA脂质体载体进行基因治疗,3mg/kg, I次/天,连续5天,第5次注射后24小时处死动物，取瘤组织用RT-PCR进行survivin基因表达研究。(2)基因治疗及流式细胞术检测细胞凋亡实验37天瘤体积21mmX 15mm，有分叶，给予瘤周皮下注射叶酸-PEG-脂质体-siRNA O. 2ml/只 天，连续4天。处死动物，取瘤体组织，用胶原酶IV溶解形成细胞悬液200目尼龙网过筛，调整细胞浓度I X IO6,采用流式细胞术监测细胞凋亡情況。10)统计分析所有的实验进行了至少一式三份并记录了結果。SPSS 10. O统计软件包被用来进行统计分析。数据的显示是平均值加上标准差(SD)。单向方差分析(ANOVA)及X 2检验分析来分析各组之间的意义。统计学意义，确定在P < O. 05水平。2.实验结果I) survivin siRNA 的定量米用survivin siRAN 20pmol、30pmol、40pmol、50pmol、60pmol 分别组合，制备成相应的转染混合物，转染K562细胞，于转染48h测定survivin表达水平。浓度为50pmol吋，survivin抑制率达到最高(90. 44% )，再增加浓度，抑制率不再增加。这表明转染的最佳浓度为50pmol/L(图I)。2) survivin-siRNA 基因敲除的定量叶酸受体靶向脂质体导致的survivin基因沉默结果如表I和图2。结果表明，第一组中K562细胞被转染48h后，survivin mRNA表达水平明显降低，80. 83%的抑制率。Survivin-siRNA组与空脂质体组P值为O. 002 (p < O. 01)，有统计学差异，而无关干扰组及空脂质体组与空白对照组的P值分别为O. 908和O. 996 (P > O. 05)，无统计学差异。但是，在其他组survivin mRNA表达水平没有受到抑制,表明了 survivin基因被敲除的特异性。表I不同组脂质体转染K562细胞对其survivin基因表达的抑制
权利要求
1.ー种survivin基因的siRNA，其特征在于所述siRNA的正义链为SEQID NO :1，反义链为 SEQ ID NO 2o
2.survivin基因叶酸受体靶向的新型脂质体，其特征在于该脂质体包裹如权利要求I所述的survivin基因的siRNA。
3.权利要求2所述的脂质体的制备方法，包括以下步骤(1)将ニ硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、I，2-ニ油酸-3-ニ甲基酰胺丙烷、聚こニ醇溶于无水こ醇中，再加入不同剂量的叶酸-聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺，调溶液的pH，然后，将柠檬酸溶液和こ醇加入到该溶液中，形成脂溶液；⑵在柠檬酸溶液和こ醇溶液中制备siRNA ； (3)加热上述(I)、⑵得到的两种溶液混合，得到叶酸-PEG-脂质体-survivin siRNA混合物；(4)将(2)中的混合物过滤，然后在柠檬酸溶液中透析，除去多余的こ醇，并进ー步在HBS中透析，除去柠檬酸缓冲液，中和D0DAP，并释放任何与小泡膜表面相关的siRNA。最后，包含siRNA的脂质体通过琼脂糖凝胶柱从自由siRNA中被分离出来。
4.权利要求3所述的脂质体的制备方法，其特征在于所述的pH为4。
5.权利要求3所述的脂质体的制备方法，其特征在于所述的柠檬酸溶液的浓度为.300mM，こ醇溶液的浓度为40% (v/v)。
6.权利要求3所述的脂质体的制备方法，其特征在于所述的加热温度为65°C。
7.权利要求3所述的脂质体的制备方法，其特征在于所述的混合比例为150ygsiRNA/ μ mo I 液体。
8.权利要求I所述的siRNA或权利要求2所述的脂质体在制备用于治疗急性髓细胞白血病的药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了survivin基因叶酸受体靶向的新型脂质体一种叶酸受体靶向的新型脂质体，是可以专一抑制急性髓细胞白血病细胞增殖分化的脂质体，由二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、1，2-二油酸-3-二甲基酰胺丙烷、聚乙二醇-CerC16、叶酸以及针对survivin基因的siRNA组成。这种脂质体是在K562细胞中投递siRNA的良好载体，更加有意义的是siRNA对特异性基因的抑制率非常理想。瘤周皮下注射叶酸-PEG-脂质体-siRNA治疗方案的荷瘤小鼠，肿瘤细胞的凋亡比例明显增加，确实能够对肿瘤细胞的生长起到抑制效果，且主要通过诱导肿瘤细胞凋亡的方式来进行。本发明产品可以作为潜在靶向治疗急性髓细胞白血病的药物。
文档编号A61K48/00GK102676517SQ20121001524
公开日2012年9月19日 申请日期2012年1月17日 优先权日2012年1月17日
发明者唐锁勤, 王天有 申请人:中国人民解放军总医院, 首都儿科研究所