专利名称：一种rTRAIL突变体及其海兔毒素偶联物的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和药物领域，尤其涉及一种rTRAIL突变体及其海兔毒素偶联物。
背景技术：
肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导配体(TNF relatedapoptosis-inducingligand，TRAIL，或Apo2L，TNFSF10)是继TNF、FasL之后发现的第三个TNF家族的凋亡因子，为一种抗癌应用前景良好的生物药物。TRAIL由Wiley等从心肌cDNA文库中克隆出来的，因其氨基酸序列具有TNF超家族的结构特征并能诱导Jurkat细胞和EB病毒转化的人类淋巴细胞凋亡而得名。TRAIL属II型跨膜蛋白，由281个氨基酸组成，其N端(f 17位氨基酸)位于胞内，C端(第39 281位氨基酸)延伸到胞外，其中第11Γ281位是发挥主要功能的部位。许多临床前期研究表明TRAIL能有效诱导多种癌细胞系凋亡，但对正常细胞无毒副作用。目前国外已进行关于TRAIL及其受体激动型抗体的I、II期临床试验，并取得初步疗效。另外，TRAIL对NF-K B仅有很微弱的激活作用，即使是全身用药，也不会像TNF-α和Fas-L那样产生严重的炎症反应，这些特性使得TRAIL有成为新一代抗肿瘤药物的潜质。TRAIL在免疫系统细胞中表达，包括NK细胞、T细胞、巨噬细胞和树突细胞，并且位于细胞膜中，可经半胱氨酸蛋白酶加工成可溶形式。TRAIL是通过与与其细胞膜受体结合发挥诱导凋亡作用的。目前已发现5种TRAIL受体，包括TRAIL-R1 (DR4，TNFSFIOa)和TRAIL-R2 (DR5, TNFRSFIOb)；TRAIL-R3 (DcRl，TNFRSFlOc)和 TRAIL-R4 (DcR2, TNFRSFlOd)；循环骨保护素(OPG，TNFRSFllb)。DR4和DR5具有一段死亡结构域(DD)，是TRAIL结合受体后诱导凋亡所必需的。其余三个受体由于缺乏功能性死亡结构域，虽然能与TRAIL结合，但无法诱导凋亡。TRAIL与DR4或DR5结合后可激活线粒体依赖和非线粒体依赖两条细胞凋亡信号途径，介导死亡信号传导入细胞内，启动效应物半胱天冬酶-3 (caspase-3)，最终引起肿瘤细胞凋亡。近年来，人们发现重组可溶TRAIL诱导了广谱的人肿瘤细胞系凋亡，但同时也存在一些对TRAIL敏感性较低或耐受的肿瘤细胞，如所有的人黑色素瘤细胞系、大部分乳腺癌细胞系、前列腺癌细胞系LNcaP等，这些细胞表面虽然或多或少也表达DR4或DR5，却由于细胞内凋亡途径中关键酶的缺失、突变和其他抑制凋亡的蛋白高表达等原因，导致TRAIL结合DR4或DR5之后并不能引起细胞的最终凋亡。对于这类细胞所形成的实体瘤，亟须其他治疗手段或改造TRAIL使之具备杀伤敏感性低以及耐受肿瘤细胞的能力。研究发现，可溶型重组TRAIL (rTRAIL)与放化疗联合应用能提高肿瘤细胞对rTRAIL的敏感性，二者具有协同作用。目前国际通用的rTRAIL是95^281位氨基酸片段，rTRAIL单体倾向于形成生物活性较好的三聚体而存在，在三聚体的顶部有一个锌离子结合位点，对稳定三聚体构象起重要作用。
但联合治疗方案仅是将rTRAIL和这些药物同时给药，并未在二者之间建立联系，无法将这些药物单一地导向肿瘤细胞，因此一般只选择低剂量低毒性的药物，以免对正常细胞产生毒害。相应地，也就无法得到更好的治疗效果。因此，若能将一些能够强力杀伤肿瘤细胞的药物加以有效利用，将更有利于肿瘤的治疗。例如化疗药物海兔毒素(MonomethylauristatinE, MMAE)是一种人工合成抗肿瘤小分子,它通过抑制细胞内微管蛋白二聚化而诱导细胞凋亡。但由于它具有很强的无选择毒性，会对正常细胞造成伤害，所以其本身并不能成药。另外，针对TRAIL的突变体、TRAIL受体的抗体的研究都在进行中，但治疗效果仍不理想。
发明内容
本发明提供了一种rTRAIL突变体，将特定氨基酸突变为半胱氨酸，从而实现与海兔毒素的偶联，且不会大幅降低蛋白对肿瘤细胞的杀伤力。一种rTRAIL突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。·
该突变体取自全长TRAIL蛋白的第95 281个氨基酸，且第109位的天冬酰胺(Asn)突变为半胱氨酸(Cys)。本发明还提供了一种编码所述rTRAIL突变体的基因，碱基序列如SEQ ID NO. 2所示。该基因第109位编码天冬酰胺(Asn)的密码子AAT突变为编码半胱氨酸(Cys)的密码子 TGT。本发明还提供了一种含有所述基因的表达单元、重组载体或表达系统。所述表达单元的启动子为T7，在这些启动子的作用下，rTRAIL突变体可以直接在大肠杆菌宿主细胞中实现胞内可溶表达。所述重组载体的原始载体为pET_28a ( + )。所述表达系统可选细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞表达系统，优选为细菌表达系统，最优选为大肠杆菌表达系统。本发明还提供了一种rTRAIL突变体-海兔毒素偶联物，由海兔毒素通过连接臂偶联rTRAIL突变体三聚体构成。所述海兔毒素的合成方法参考美国专利文献Tumerinhibiting tetrapeptide bearing modified phenethylamides,(专利号5,635, 483)。本发明所使用的连接臂为马来酰亚胺修饰的缬氨酸-瓜氨酸二肽，其合成方法参考文献Gene M. D. , et al, Cathepsin B-Labile Dipeptide LinkersforLysosomal Release of Doxorubicin from Internalizing Immunoconjugates:ModelStudies of Enzymatic Drug Release and Antigen-Specific In VitroAnticancerActivity,Bioconjugate Chem.，13(4)855-869(2002).。本发明带连接臂的海兔毒素(vcMMAE)由江阴康诺泰生物技术有限公司代为合成，也可以参考文献(Svetlana 0. D. , et al, Development of potentmonoclonal antibodyauristatin conjugates for cancer therapy, NatureBiotechnology. , 21 (7) 778-784(2003).),偶联时再通过缬氨酸上的马来酰亚胺与rTRAIL突变体的半胱氨酸巯基进行烷基化反应，最终形成本发明偶联物。本发明还提供了所述rTRAIL突变体-海兔毒素偶联物的制备方法，包括(I)将rTRAIL突变体多聚体解聚，重新聚合得到rTRAIL突变体三聚体，具体包括将rTRAIL突变体溶于含锌离子的缓冲液中，加入磷酸三(β -氯乙基)酯，3(T40°C水浴反应I 3h ；由于rTRAIL突变体之间会通过二硫键形成多聚体，加入磷酸三(β-氯乙基)酯(TCEP)使不稳定的多聚体解聚，保持单体状态，反应体系中的锌离子进一步促使rTRAIL突变体单体形成稳定的三聚体。(2)将rTRAIL突变体三聚体与带连接臂的海兔毒素混合，进行偶联反应，偶联后，每个三聚体可以结合1-3个海兔毒素分子；偶联反应的温度优选为0 4°C，时间为30 60mino(3)反应完成后，分离纯化得到rTRAIL突变体-海兔毒素偶联物； 由于本发明rTRAIL突变体-海兔毒素偶联物单体的分子量为23kDa，而反应体系中存在的其他分子的分子量均小于IOkDa,因此，用截留分子量IOkDa的超滤管即可除去体系中的小分子，再经离心去沉淀，将所得上清过滤除菌，即得本发明的偶联物。用于突变的TRAIL分子可来源于人或动物，但为了对人的肿瘤治疗更有帮助，优选为人的天然TRAIL分子。天然rTRAIL单体分子表面也有半胱氨酸巯基，但均用于形成稳定的三聚体，三聚体分子表面因没有游离巯基存在而失去了偶联位点。因此，本发明利用PCR定点突变手段获得了含有一个半胱氨酸突变位点的rTRAIL突变体，步骤为(I)提取人组织总RNA，以总RNA为模板进行反转录，获得cDNA文库；(2)以所述cDNA为模板，利用引物Pl和P2进行PCR扩增，得到TRAIL编码序列；(3)以所述TRAIL编码序列为模板，利用引物P3和P4进行PCR定点突变扩增，获得突变序列；(4)将突变序列可操作性地连入载体，转化宿主细胞；(5)诱导经转化的宿主细胞表达融合蛋白，获得所述rTRAIL突变体。所述引物Pl和P2的序列为Pl :5’ -ATGGCTATGATGGAGGTCCAGG-3’ ；P2 :5， -TTAGCCAACTAAAAAGGCCCCG-3，；所述引物P3和P4的序列为P3 :5’ -TATACCATGGGCACCTCTGAGGAAACCATTTCTACAGTTCAAGAAAAGCAACAATGTATTTCT-3’ ；P4 :5，-TTCTCGAGTTAGCCAACTAAAAAGGCCCCGAAAAAACTGGCTTCATGGTCCATGTCCATGTC-3，。本发明还提供了所述rTRAIL突变体-海兔毒素偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用。所述抗肿瘤药物包括有效量的rTRAIL突变体-海兔毒素偶联物，以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。制备时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可采用固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水等；制剂还可包括湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。所述抗肿瘤药物可制成单元或多元剂型，各剂型包含为了产生所期望的疗效而计算出预定量的rTRAIL突变体-海兔毒素偶联物，以及合适的药剂学赋形剂。所述的抗肿瘤药物可以通过常规途径进行给药，包括(但并不限于)肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、局部给药等。使用该药物时，是将安全有效量的rTRAIL突变体-海兔毒素偶联物施用于人，其中该安全有效量的范围优选为O. 5^50毫克/千克体重，更优选为f 10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是在熟练医师技能范围之内的。此外，本发明的偶联物还可与其他治疗药物联用，其中包括(但并不限于)各种细胞因子，如IFN、TNF、IL-2等；各种肿瘤化疗药物，如5-FU、氨甲喋呤等影响核酸生物合成的药物；氮芥、环磷酰胺等烷化剂类药物；阿霉素、放线菌素D等干扰转录过程阻止RNA合成的药物；长春新碱、喜树碱类等影响蛋白质合成的药物及某些激素类药物，等等。与现有技术相比，本发明的有益效果为(I)本发明偶联物具有rTRAIL突变体和MMAE两者的生物学功能，既具有rTRAIL突变体在肿瘤细胞外诱导凋亡的能力，又具有MMAE在细胞内抑制微管蛋白从而诱导凋亡的能力，在二者的协同下，抗肿瘤效果得到显著增强。(2)本发明偶联物通过rTRAIL突变体与肿瘤细胞表面的死亡受体特异结合，将MMAE定向转运到肿瘤细胞，并在肿瘤细胞内释放发挥作用，既可杀伤对TRAIL敏感性低甚至抵抗的肿瘤细胞，也减少MMAE单独给药产生的毒副作用。(3 )本发明偶联物中的rTRAIL突变体与MMAE偶联后，其水溶液具有比单纯的rTRAIL分子更佳的稳定性，表现为经反复冻融后不出现沉淀。
图I为大肠杆菌表达的rTRAIL突变体N109C电泳图。其中，M代表低分子量Marker ；1为未诱导的菌液；2、3为诱导的菌液；4为未诱导的菌液破碎后离心取的上清(可溶部分);5、6为诱导的菌液破碎后离心取的上清(可溶部分);7、8、9为诱导和不诱导的沉淀用8M尿素重溶后的样品。图2为rTRAIL突变体N109C的亲和纯化结果电泳图。其中，M为蛋白分子量marker。I为IPTG诱导后的菌液，2为破菌后的上清；3为Ni柱的流穿液；4为IOmM咪唑洗脱液；5为60mM咪唑洗脱液；6为500mM咪唑洗脱液。图3为rTRAIL突变体N109C的SP强阳离子交换柱纯化结果电泳图。其中，I为IOmM咪唑洗脱液脱盐后的蛋白溶液；2和3都是SP柱的洗脱蛋白，即纯化后的N109C，4为N109C非变性电泳的结果。图4为N109C及其MMAE偶联物的电泳图。其中，I为N109C，2为N109C_vcMMAE偶联物，3为N109C-vcMMAE脱盐后的产物，4、5、6分别为1、2、3样品非变性条件下的电泳结
果O图5为rTRAIL突变体-vcMMAE偶联物各部分连接关系示意图。图6为各TRAIL元件对不同细胞系的杀伤效果。图7为N109C-vcMMAE偶联物在荷瘤小鼠体内的分布。
图8为N109C-vcMMAE偶联物的肿瘤细胞内吞实验图。图9为rTRAIL突变体-vcMMAE偶联物诱导凋亡机制示意图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细说明。I、建立人前列腺cDNA文库
(I)提取人前列腺mRNA液氮研磨冻存的人前列腺组织小块(IOOmg左右)成粉末状，加TRIZOL试剂ImL继续反复研磨，转移至I. 5mL无RNA酶EP管中，室温放置5min，加O. 2mL氯仿剧烈振荡15s，室温放置3min。4°C 12000g离心15min，转移上层水相至另一无RNA酶的EP管中。加入异丙醇O. 5mL，室温放置lOmin，沉淀RNA。4°C 12000g离心lOmin，去上清，75%乙醇洗涤沉淀。·40C 12000g离心5min，去上清，干燥后用50 μ L DEPC水溶解，-70°C保存。(2)反转录 PCR以oligodT为引物，人前列腺RNA为模板，加AMV逆转录酶进行Reverse-PCR，得到cDNA文库。具体步骤为I) RNA 预变性:5 μ g 人前列腺 RNA+25 μ g OligodT，用 0. 1% DEPC 补足至 10 μ L ；70°C水浴5min，冷却至室温，破坏mRNA 二级结构。2)反转录合成体系为
权利要求
1.一种rTRAIL突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.—种编码如权利要求I所述rTRAIL突变体的基因，其特征在于，碱基序列如SEQ IDNO. 2所示。
3.一种含有如权利要求2所述基因的表达单元、重组载体或表达系统。
4.一种rTRAIL突变体-海兔毒素偶联物，其特征在于，由海兔毒素通过连接臂偶联rTRAIL突变体三聚体构成，rTRAIL突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。
5.如权利要求4所述的rTRAIL突变体-海兔毒素偶联物，其特征在于，所述连接臂为马来酰亚胺修饰的缬氨酸-瓜氨酸二肽。
6.如权利要求4 5任一所述rTRAIL突变体-海兔毒素偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用。
7.—种rTRAIL突变体-海兔毒素偶联物的制备方法，包括(1)将rTRAIL突变体多聚体解聚，重新聚合得到rTRAIL突变体三聚体；(2)将rTRAIL突变体三聚体与带连接臂的海兔毒素混合，进行偶联反应；(3)反应完成后，分离纯化得到rTRAIL突变体-海兔毒素偶联物；rTRAIL突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示；所述连接臂为马来酰亚胺修饰的缬氨酸-瓜氨酸二肽。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述rTRAIL突变体三聚体制备方法为将rTRAIL突变体溶于含锌离子的缓冲液中，加入磷酸三(β-氯乙基)酯，30 40°C水浴反应I 3h。
9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述偶联反应的温度为4°C以下，时间为 30 60min。
10.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述分离纯化方法为利用超滤除去反应液中分子量低于IOkDa的物质，再经离心去沉淀，将所得上清过滤除菌，即为rTRAIL突变体-海兔毒素偶联物。
全文摘要
一种rTRAIL突变体及其海兔毒素偶联物。本发明公开了一种rTRAIL突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明还公开了所述rTRAIL突变体的编码基因及含有该编码基因的表达单元、重组载体或表达系统。本发明还公开了一种rTRAIL突变体-vcMMAE偶联物及其制备方法和应用。本发明偶联物具有rTRAIL突变体和MMAE两者的生物学功能，通过rTRAIL突变体与肿瘤细胞表面的死亡受体特异结合，将MMAE定向转运到肿瘤细胞，并在肿瘤细胞内释放发挥作用，既可杀伤对TRAIL敏感性低甚至抵抗的肿瘤细胞，也减少MMAE单独给药产生的毒副作用。
文档编号A61K38/17GK102936281SQ201210416648
公开日2013年2月20日 申请日期2012年10月25日 优先权日2012年10月25日
发明者陈枢青, 潘利强 申请人:浙江大学