专利名称：一种芽孢杆菌、一种透明质酸酶及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于酶学和药物化学领域，涉及一种芽孢杆菌、一种透明质酸酶及其制备方法和用途。
背景技术：
透明质酸(hyaluronic acid, HA)是一种酸性黏多糖，由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单位构成的无分支高分子糖胺聚糖，存在于动物组织细胞间质和某些细菌的荚膜中。透明质酸广泛用于医药、化妆品、食品等领域，分子量一般为IO5 — IO7Da (道尔顿)。寡聚透明质酸是指分子量小于IOkDa的透明质酸。研究表明，分子量对透明质酸的活性有很大影响，不同分子量的透明质酸甚至表现出截然相反的活性(郭学平等，低分子量及寡聚玻璃酸，中国生化药物杂志，2003，24 (3):148-150)。研究表明，寡聚透明质酸在体内具有促血管生成作用，在体外可促进内皮细胞的增生，促进创伤愈合(West DC, Kumar S.The effect of hyaluronate and its oligosaccharides on endothelial cell proliferation and monolayer integrity.ExpCell Res.1989，183(1): 179-96)。寡聚透明质酸盐具有促血管生成、促进创伤愈合等生物活性，在医药领域具有良好的应用前景。
在炎症过程中，寡聚透明质酸对树突细胞和巨噬细胞等免疫活性细胞具有强力活化作用(Termeer C，Benedix F，Sleeman J, et al.0ligosaccharides of Hyaluronan activate dendri tic cells via toll-like receptor4.J Exp Med.2002，195(I):99_111)。寡聚透明质酸在体外可抑制小鼠TA3/St乳腺癌细胞、大鼠CG神经胶质瘤细胞、人HCT克隆瘤细胞及人LXI肺癌细胞的生长，具有抗肿瘤作用(Ghatak S，Misra S，TooleBP.Hyaluronan cons titutively regulates ErbB2phosphorylation and signalingcomplex formation in carcinoma cells.J Biol Chem.2005，280(10):8875-83)。此外，寡聚透明质酸盐分子中的羟基、羧基和其他极性基团可与水分子形成氢键而结合大量的水分，保水效果明显，因此寡聚透明质酸盐可用于防晒、抗衰老、保湿化妆品中。目前，透明质酸降解的方法主要有物理降解、化学降解、生物降解三大类，物理降解法很难将透明质酸降至IOkDa以下，化学降解法和酶法可以制备寡聚透明质酸，但化学降解法制备寡聚透明质酸，需要较剧烈的反应条件(如较高的酸碱浓度等)才能达到最大程度的降解。此时，不但糖链上的糖苷键断裂，而且单糖(葡糖醛酸和乙酰氨基葡糖)残基的结构也遭到破坏，如乙酰基被水解掉，单糖六元环断裂等(表现在红外图谱上是与欧洲药典标准图谱不一致)，对制得的寡聚透明质酸的生物活性产生一定影响(郭学平等，低分子量及寡聚玻璃酸，中国生化药物杂志，2003，24 (3):148-150)。化学降解法制备的寡聚透明质酸还容易发生褐变(中国专利申请号201110008110.9)，生产过程会污染环境。而酶解法降解透明质酸时，只断裂单糖分子间的糖苷键，不会对其他结构造成破坏，而且酶解法反应条件温和，不用强酸强碱，制备的寡聚透明质酸不会发生褐变，不会造成环境污染，并且酶解法制备的寡聚透明质酸的双糖结构完整，红外图谱与欧洲药典图谱一致，因此酶解法最适合制备寡聚透明质酸。降解透明质酸所用的酶主要是透明质酸酶(又称为玻璃酸酶)，根据作用机制的不同，可以分为3类:(1)内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶，为水解酶，作用于β-1，4糖苷键，终产物主要为四糖，也可作用于软骨素或硫酸软骨素，并有转糖苷酶活性。哺乳动物来源的以及动物毒液来源的属于此类。(2)水蛭、十二指肠虫来源的透明质酸酶，为内切-β_葡糖苷酸酶，作用于β_1，3糖苷键，也是水解酶，主要降解产物是四糖，特异性降解透明质酸；(3)细菌透明质酸酶，也称为透明质酸裂解酶(hyaluronate lyase),作用于β_1，4糖苷键,通过 β -消去机制得到 4，5_不饱和双糖(Kreil, G, Hyaluronidases—a group of neglectedenzymes, Protein Sci,1995, 4 (9):1666-1669)。目前工业生产寡聚透明质酸或其盐的 方法是化学降解法，由于含透明质酸酶的动物组织来源有限，有文献报道的微生物来源透明质酸酶发酵液单位酶活较低，发酵液最高酶活是 1.3X102IU/mL (W02010130810A1 ；Eileen Ingham, K.T.Holland, G.Gowl and and ff.J.Cunliffe, Purificat ion and Partial Characterizat ion ofHyaluronate Lyase(EC4.2.2.1)from Propionibacterium acnes, Journal of GeneralMicrobiology(1979)，115，411-418)，其余文献报导的酶活均低于100IU/mL，不可能大规模制备透明质酸酶，也就不可能用酶法大规模生产寡聚透明质酸或其盐。此外，目前一般将分子量在IO4Da-1O6Da的透明质酸称为低分子透明质酸(LMW-HA)0分子量为2万一 6万的LMW-HA可刺激体外培养的骨细胞的增生，增加培养基中骨细胞集落的数目和单个集落的面积(US5646129)。使用含有妥布霉素和分子量为50万的HA的滴眼液治疗细菌性角膜溃疡，与只含妥布霉素的滴眼液相比，可显著缩短愈合时间(Gandolfi SA, Mas sari A,Orsoni JG.Low-molecular-weight sodium hyaluronate inthe treatment of bacterial corneal ulcers s[J].Graefes Arch Clin Exp OphthalmoI, 1992, 230(1): 20-23)。韩国专利(KR20080087941)提供了一种含分子量小于10万的HA的组合物，该组合物易于被人体吸收，口服可有效改善皮肤皱纹、提高皮肤弹性。日本专利(JP2000-103723)提供了一种含分子量20万一 40万HA的组合物，该组合物可促进毛发生长。但是，与寡聚透明质酸或其盐的情形类似，酶解法制备的低分子透明质酸或其盐在结构上比化学法制备的要完整，化学法制备的低分子透明质酸或其盐的结构会发生开环、脱乙酉先基等。LMW-HA因其相对分子质量较小，外用时可被皮肤更好的吸收，促进皮肤营养的供给和废物排泄，从而防止皮肤老化，达到深层保湿和美容养颜的效果，而且还可促进表皮细胞的增殖和分化，清除氧自由基，修复日光或紫外线伤害的皮肤。口服LMW-HA易于吸收，不仅可以活化皮肤细胞，保持表皮湿润，同时具有良好的增强免疫功能和抗衰老功能。因此化妆品用及保健食品用HA多为LMW-HA。另外，LMW-HA还具有促血管生成、细胞免疫活化和促进骨生成的作用，对治疗细菌性角膜溃疡具也有良好的疗效，在医药领域应用广泛。LMW-HA是由高分子量HA降解得到的，降解的方法主要有物理降解、化学降解、生物降解三大类。物理降解法中的超声降解法虽然不添加化学试剂和酶，但很难将高分子量HA降解至分子量200kDa以下(覃彩凤，王淼，陈晓峰.透明质酸的降解方法及工艺条件研究[J].2007，4:32-36)。机械研磨法也是一种有效降低HA相对分子量的方法，有专利报道在室温下研磨时间为0.5h - 12h，振荡频率为IOHz - 30Hz，但不适用于大规模生产(CN101942037A)。化学降解法会造成结构破坏，这时不但糖链上的糖苷键断裂，而且单糖(葡糖醛酸和乙酰氨基葡糖)残基的结构也可能遭到破坏，如乙酰基被水解掉、单糖六元环断裂等。有报道酶解法生产低分子HA的制备过程，先将HA从发酵液中分离纯化出来，然后再添加入透明质酸酶进行酶解，再经过膜过滤、乙醇沉淀、脱水干燥得到低分子HA(CN101020724A)，上述制备工艺所用的透明质酸酶为透明质酸酶成品，价格很高，很难实现工业化生产。目前，有文献报道的微生物来源透明质酸酶发酵液单位酶活较低，发酵液最高酶活是1.3 X 102IU/mL (W02010130810A1)，其余文献报道的酶活均低于102IU/mL，因此应用酶切法大规模生产低分子HA目前很难实现。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了一种芽孢杆菌和一种透明质酸酶。该透明质酸酶活性高，可达105IU/mL(发酵液)，纯化后可以达到8 X IO6 — 1.5 X IO7IU/mg，远高于目前文献中报道的最高酶活。该透明质酸酶的分子量为123KDa，最适作用温度及PH分别为42°C、6.5，热稳定性和pH稳定性高。该酶可催化裂解透明质酸和硫酸软骨素，但是不能降解海藻酸钠，肝素钠，壳聚糖，几丁质和羟甲基纤维素钠。利用该透明质酸酶降解高分子透明质酸，反应速度快、反应条件温和、环境污染小，可大规模工业化生产低分子透明质酸及寡聚透明质酸，还可生产低分子硫酸软骨素(本发明中是指分子量为1，000 -10，000的硫酸软骨素，也称为低分子量硫酸软骨素)。本发明采用芽孢杆菌发酵得到的透明质酸酶对高分子量透明质酸或其盐进行降解，酶活高、条件温和、操作简单、无环境污染。由此提供了下述发明:本发明的一个方面涉及一种芽孢杆菌，其保藏编号为CGMCC N0.5744，保藏日期为2012年2月8日，保藏单位 是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。针对现今生物降解透明质酸或其盐所需降解酶活性低、来源有限、成本高的缺点，发明人从空气中分离得到了一种产透明质酸酶的芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50，该菌种已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了保藏，保藏号为CGMCCN0.5744，保藏时间为2012年2月8日。本发明的另一方面涉及一种制备透明质酸酶的方法，包括使用本发明的芽孢杆菌的步骤。根据本发明的制备透明质酸酶的方法，其包括下述步骤:将本发明的芽孢杆菌斜面培养、种子培养、发酵培养、离心、硫酸铵分级沉淀、超滤，制得透明质酸酶。根据本发明任一项所述的制备透明质酸酶的方法，其包括如下步骤:(I)将本发明的芽孢杆菌进行斜面培养，得斜面菌种；(2)取斜面菌种接种到已灭菌的种子培养基中，在25 - 400CUOO 一 200rpm的条件下培养10 — 24h,得种子液；(3)将种子液接种到已灭菌的发酵培养基中，在25 - 400CUOO 一 300rpm的条件下培养12 - 24h，得透明质酸酶发酵液；
(4)离心分离发酵液，取上清液；(5)将上清液用硫酸铵分级沉淀，过滤(例如采用0.65 μ m的微孔滤膜进行过滤)，得到粗制的透明质酸酶；(6)将步骤(5)沉淀出来的粗制透明质酸酶溶于磷酸盐缓冲液中，超滤除去小分子杂质，得纯化的透明质酸酶。可选地，步骤(6)也可以采用如下的步骤(6 — I)至(6 — 3): (6 -1):将步骤(5)中的粗制透明质酸酶溶于pH4.5-8.0的缓冲溶液中，得粗酶液；将粗酶液装入截留分子量为3.0X IO3 - 1.4X IO4Da的透析袋，放入pH4.5 — 8.0的缓冲溶液中，4°C下透析过夜；(6 - 2):将透析后的粗酶液进行离子交换色谱分离，色谱柱填料是DEAE琼脂糖凝胶FF介质，用O — 0.5M NaCl溶液进行梯度洗脱，并收集洗脱峰；(6 - 3):将步骤(6 - 2)得到的透明质酸酶样品进行冷冻真空干燥，得到白色粉末，即为透明质酸酶。步骤6 — I至6 — 3是对透明质酸酶的进一步纯化。上述分离纯化透明质酸酶的方法中，SDS-PAGE电泳检测步骤(6_2)得到的透明质酸酶纯度达到97%以上。上述步骤(I)中，每IOOmL斜面培养基中含有以下成分:蛋白胨0.2 — 2.0g，酵母粉 0.2 — 2.0g, K2HPO4.3Η200.05 — 0.15g, MgSO4.7Η200.05 — 0.15g,葡萄糖 0.5 — 1.5g,琼脂粉2.0g, pH调至6.0 — 8.0，斜面培养的温度为25 — 40°C。上述步骤(2)中，每IOOmL种子培养基中含有以下成分:蛋白胨0.2 一 2.0g，酵母粉 0.2 — 2.0g, K2HPO4.3Η200.05 — 0.15g, MgSO4.7Η200.05 — 0.15g,葡萄糖 0.5 — 1.5g,pH 调至 6.0 - 8.0。上述步骤(3)中，每IOOmL发酵培养基中含有以下成分:蛋白胨0.2 — 2.0g，酵母粉 0.2 — 2.0g, K2HPO4.3Η200.05 — 0.15g, MgSO4.7Η200.05 — 0.15g,葡萄糖 0.5 — 1.5g,吐温 800.05mL, pH 调至 6.0 — 8.0。可采用盐酸、硫酸或磷酸中的一种或一种以上调节斜面培养基、种子培养基和发酵培养基pH。斜面种子培养和发酵培养的接种量可以通过现有技术得到，不需付出创造性的劳动。种子培养基的接种量能够达到发酵培养所需接种量的种子液即可，发酵培养基的接种量一般在3 — 15%即可。上述步骤(4)中，发酵液离心的转速为10000 - 15000rpm，离心时间为10 —20mino上述步骤(5)中，硫酸铵分级沉淀的步骤是:将上清液中加入硫酸铵，使其质量体积浓度为20% — 25%，过滤除去产生的沉淀，然后继续加入硫酸铵，至其质量体积浓度为35% -40%为止，得到的沉淀即为透明质酸酶。本发明中所述的质量体积浓度的意思是:每mL上清液中含有硫酸铵的质量(g)。上述步骤(6)中，磷酸盐缓冲液的pH优选为6.0，浓度优选为50mmol/L，在实际应用中可酌情变动。超滤所用的为超滤膜。超滤膜的截留分子量为3XlO4Da15本发明的再一方面涉及一种透明质酸酶，其由上面任一项所述的制备透明质酸酶的方法制得。本发明芽孢杆菌生产的透明质酸酶在发酵液中的酶活可达到IX IO5 — 3X IO5IU/mL,大大高于文献报道中的最高酶活(1.3 X 102IU/mL),且该酶热稳定性和pH稳定性高，用其降解高分子透明质酸，用来制备寡聚或低分子透明质酸，成本显著降低，可用于大规模生产，解决了动物来源的透明质酸酶成本高的问题，在生化研究领域及寡聚或低分子透明质酸的生产方面有广阔的应用前景。本发明还涉及一种分离的多肽(或蛋白)，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示；具体地，所述多肽(或蛋白)为透明质酸酶。在本发明的一个实施方案中，所述透明质酸酶由本发明的芽孢杆菌制得。本发明还涉及一种透明质酸酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。一种分离的多肽(或蛋白)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；具体地，所述多肽(或蛋白)为透明质酸酶。一种分离的多核苷酸，其编码SEQ ID NO:2所示所示的氨基酸序列；具体地，所述多核苷酸的序列为SEQ ID NO:3所示的序列或SEQID NO:3的互补序列。一种重组载体，其含有本发明的多核苷酸。一种重组宿主细胞，其含有本发明的重组载体。本发明的再一方面涉及一种制备寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐的方法，包括使用本发明中任一项所述的透明质酸酶或者含有本发明中任一项所述的透明质酸酶的发酵液对分子量大于IOkDa的透 明质酸或其盐进行降解的步骤。根据本发明制备寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐的方法，其包含如下步骤:I)配制透明质酸或其盐溶液:向纯化水中加入分子量大于IOkDa的透明质酸或其盐，配制成质量体积浓度为I 一 30%的溶液；2)酶解:调节步骤I)中溶液的温度为20 — 48°C、pH为4 — 9，然后向其中加入芽孢杆菌透明质酸酶，将透明质酸或其盐酶解至所需分子量，得酶解液；3)灭活:将酶解液在50 — 90°C下保持10 — 60min,对芽孢杆菌透明质酸酶进行灭活；优选地，还包括如下步骤:4)过滤:向灭活后的酶解液中加入易溶性无机盐，搅拌至完全溶解，然后用孔径为0.45 μ m的滤膜过滤，得滤液，每IOOmL酶解液中加入0.1 一 IOg的易溶性无机盐；5)沉淀:将步骤4)的滤液与滤液体积3 — 20倍的醇或酮混合均匀，析出寡聚透明质酸盐沉淀；6)脱水干燥:将步骤5)中的寡聚透明质酸盐沉淀分离出来，用有机溶剂脱水，然后真空干燥，得寡聚透明质酸盐。根据本发明制备寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐的方法，其中，步骤I)中，每Ikg透明质酸或其盐加2 X IO7 — 5 X IO7IU的芽孢杆菌透明质酸酶。根据本发明的制备寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐的方法，其中，步骤2)中，酶解温度为35 — 45°C，酶解pH为5.5 — 7.5，将透明质酸酶解至分子量为大于或等于3000Da，并且小于104Da。根据本发明的制备寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐的方法，其满足如下的A — F中的任一项或多项:A.步骤I)中，透明质酸盐为透明质酸的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐或锌盐；B.步骤2)中，采用酸或碱调节pH至4 一 9，所述酸为盐酸、冰乙酸、硫酸或磷酸，所述碱为氢氧化钠或氢氧化钾；C.步骤3)中，将酶解液在55 - 65°C下保持20 — 30min，对芽孢杆菌透明质酸酶进行灭活；D.步骤4)中，所述易溶性无机盐为钠盐、钾盐、钙盐、锌盐或镁盐；优选钠、钾、钙、锌、镁的氯化物、硫酸盐或硝酸盐；E.步骤5)中，所述醇或酮为乙醇、丙酮、甲醇、丙醇或异丙醇；F.步骤6)中，脱水所用的有机溶剂为酮或醇。上述方法中，所用的芽孢杆菌透明质酸酶即芽孢杆菌(Bacillus sp.) A50CGMCCN0.5744发酵得到的透明质酸酶比活为8 X IO6 — 1.5 X 107IU/mg，酶的加入量为每kg透明质酸或其盐中加2 X IO7 - 5 X IO7IU的纯化酶。透明质酸酶对透明质酸有很好的降解性，只要加入合适的透明质酸酶，即可以得到任意小分子量的透明质酸，因此在酶解时，控制时间的长短即可得到所需分子量的透明质酸。此外，步骤4)中以滤膜过滤酶解液，滤去透明质酸酶等杂质，提高了产物的纯度，所选滤膜为本领域常用的过滤膜即可，只要满足孔径的要求都能用于本发明，滤膜的孔径为0.45 μ m，材质可以是纤维素酯类、聚砜类、或聚酰胺类。上述步骤6)中，脱水所用的有机溶剂为与水互溶的有机溶剂，将寡聚透明质酸盐沉淀加入此有机溶剂中可以带走 沉淀中的大部分水，优选的，有机溶剂为酮或醇，最优选的为常用的乙醇、丙酮。本发明的制备寡聚透明质酸或其盐的方法操作简单，条件温和，对产品结构无破坏，无环境污染，而且发酵来源的透明质酸酶成本低，适合大规模工业化生产，制备的寡聚透明质酸盐具有透皮吸收性好、纯度高、无细胞毒性、抗氧化能力强、颜色无褐变等优点，可用在化妆品、食品及医药领域，前景广阔。本发明的再一方面涉及一种寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐，其由本发明中任一项所述的制备寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐的方法制得。本发明的再一方面涉及一种寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐，其N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖的含量彡65%、彡70%、彡75%、彡80%、彡85%、彡90%或彡95%(w/w);具体地，所述N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖的含量通过HPLC法测得。更具体地，HPLC的条件为:采用糖分析柱进行高效液相色谱测定；流动相为0.411101/1他4 04溶液；流速为0.6ml/min ;柱温为35°C ;检测波长为232nm ;进样量为20 μ L。例如可以采用下面的步骤:a.标准对照品溶液:称取一定量的标准对照品(Hyaluronic acid disaccharideΔ DiHA sodium salt, Η9649, Sigma)用磷酸盐缓冲液(ρΗ6.0, 5mmo 1/L)溶解配制成 lmg/mL的溶液，得到标准对照品溶液；b.样品预处理:称取一定量的待测样品(比较例1-7、实施例13-26制备)，用磷酸盐缓冲液(pH6.0，5mmol/L)溶解配制成lmg/mL的溶液。取ImL样品溶液加入1000IU的透明质酸酶(可以为实施例10-12制备)，42°C水浴2h ;酶解结束后，将酶解液煮沸2min使酶失活，得到样品酶解液。将样品酶解液转移至20mL容量瓶中，加入流动相稀释至刻度，混匀，过滤即得供试液。c.标准对照品溶液处理:取ImL标准对照品溶液采用流动相稀释20倍，过滤待用。d.色谱条件:采用糖分析柱进行高效液相色谱测定；流动相为0.4mol/L NaH2PO4溶液；流速为0.6ml/min ;柱温为35°C ;检测波长为232nm ;进样量为20 μ L ;e.结果计算:采用高效液相色谱分别对标准对照品和待测样品进行色谱分离，按外标法以透明质酸双糖峰面积计算；具体地，按以下公式计算寡聚透明质酸或其盐的含量(以N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖的含量表示):
权利要求
1.一种芽孢杆菌，其保藏号为CGMCC No. 5744，保藏日期为2012年2月8日，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。
2.一种制备透明质酸酶的方法，包括使用权利要求I所述的芽孢杆菌的步骤；具体地，包括下述步骤 将权利要求I所述的芽孢杆菌斜面培养、种子培养、发酵培养、离心、硫酸铵分级沉淀、超滤，制得透明质酸酶。
3.根据权利要求2所述的方法，包括如下步骤 (1)将权利要求I的芽孢杆菌进行斜面培养，得斜面菌种； (2)取斜面菌种接种到已灭菌的种子培养基中，在25- 400CUOO - 200rpm的条件下培养10 — 24h，得种子液； (3)将种子液接种到已灭菌的发酵培养基中，在25- 400CUOO - 300rpm的条件下培养12 — 24h，得透明质酸酶发酵液； (4)离心分离发酵液，取上清液； (5)将上清液用硫酸铵分级沉淀，过滤(例如采用O.65 μ m的微孔滤膜进行过滤)，得到粗制的透明质酸酶； (6)将步骤(5)得到的粗制透明质酸酶溶于磷酸盐缓冲液中，超滤除去小分子杂质，得纯化的透明质酸酶。
可选地，步骤(6)也可以采用如下的步骤(6 — I)至(6 — 3): (6 - I):将步骤(5)中的粗制透明质酸酶溶于pH4. 5-8.0的缓冲溶液中，得粗酶液；将粗酶液装入截留分子量为3. OX IO3 - I. 4 X IO4Da的透析袋，放入pH4. 5-8.0的缓冲溶液中，4°C下透析过夜； (6 - 2):将透析后的粗酶液进行离子交换色谱分离，色谱柱填料是DEAE琼脂糖凝胶FF介质，用O — O. 5M NaCl溶液进行梯度洗脱，并收集洗脱峰； (6 - 3):将步骤(6 - 2)得到的透明质酸酶样品进行冷冻真空干燥，得到白色粉末，SP为透明质酸酶。
4.一种透明质酸酶，其通过权利要求2或3所述的方法制得。
5.一种分离的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示；具体地，所述多肽为透明质酸酶。
6.一种分离的多核苷酸，其编码SEQ ID NO :2所示所示的氨基酸序列；具体地，所述多核苷酸的序列为SEQ ID NO 3所示的序列或SEQ ID NO 3的互补序列。
7.—种重组载体,其含有权利要求6所述的多核苷酸。
8.—种重组宿主细胞，其含有权利要求7所述的重组载体。
9.一种组合物，其包含权利要求4所述的透明质酸酶、权利要求5所述的多肽、权利要求6所述的多核苷酸、权利要求7所述的重组载体或者权利要求8所述的重组宿主细胞；可选地，其还包含药学上或食品学上可接受的载体或辅料。
10.权利要求I所述的芽孢杆菌或权利要求6所述的多核苷酸或权利要求7所述的重组载体或权利要求8所述的重组宿主细胞在制备透明质酸酶中的用途。
11.权利要求4所述的透明质酸酶或权利要求5所述的多肽在制备寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐、低分子透明质酸或低分子透明质酸盐、或者低分子硫酸软骨素中的用途；具体地，所述寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐，分子量为大于或等于3000Da，并且小于IO4Da ；具体地，所述低分子透明质酸或低分子透明质酸盐，分子量为IOkDa — IOOOkDa,优选为10kDa 一 500kDa。
12.寡聚透明质酸或者寡聚透明质酸盐在制备促血管生成和/或促进创伤愈合或抗氧化或防晒或晒后修复或清除自由基或促进HUVEC细胞增殖或抗肿瘤或提高免疫力的药物或者在制备食品或保健品或化妆品中的用途；具体地，所述化妆品为防晒、晒后修复、抗衰老、或保湿的化妆品。具体地，所述寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐由SEQ IDNO :2所编码的透明质酸酶制得或者所述寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖的含量≥65%、≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥90%或≥95% (w/w)。
13.根据权利要求12所述的用途，其中，所述N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖的含量通过HPLC法测得；可选地，所述寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐的其分子量为大于或等于3000Da，并且小于104Da。
14.一种组合物，其包含寡聚透明质酸或者寡聚透明质酸盐；可选地，其还包含药学上或食品学上可接受的载体或辅料。具体地，所述组合物为化妆品；更具体地，所述化妆品为防晒、晒后修复、抗衰老、或保湿的化妆品。具体地，所述寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐由SEQ ID NO 2所编码的透明质酸酶制得或者所述寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖的含量≥65%、≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥90%或≥ 95% (w/w)。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中，所述N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖的含量通过HPLC法测得；可选地，所述寡聚透明质酸或寡聚透明质酸盐的其分子量为大于或等于3000Da，并且小于104Da。
全文摘要
本发明属于酶学和药物化学领域，涉及一种芽孢杆菌、一种透明质酸酶及其制备方法和用途。具体地，本发明涉及一种芽孢杆菌，其保藏号为CGMCC No.5744，保藏日期为2012年2月8日，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。本发明还涉及一种透明质酸酶及其制备方法，以及所述透明质酸酶在制备寡聚透明质酸或其盐或者低分子透明质酸或其盐的中的用途。利用本发明的透明质酸酶制备寡聚透明质酸或其盐或者低分子透明质酸或其盐，操作简单，条件温和，对产品结构无破坏，而且成本低，适合大规模工业化生产。本发明制备的寡聚透明质酸盐具有透皮吸收性好、纯度高、无细胞毒性、抗氧化能力强等优点，可用在化妆品、食品及医药领域。
文档编号A61P9/00GK103255076SQ20121049701
公开日2013年8月21日 申请日期2012年11月29日 优先权日2012年2月21日
发明者郭学平, 石艳丽, 李海娜, 王冠凤, 薛蔚, 乔莉苹, 冯宁, 张晓鸥, 刘爱华 申请人:华熙福瑞达生物医药有限公司