含蛋白或多肽的疏水溶液、其制备方法及用途

含蛋白或多肽的疏水溶液、其制备方法及用途
【专利摘要】本发明属于药物学和制药学领域，涉及含蛋白或多肽的疏水溶液、其制备方法及用途。本发明中，使用水溶性助溶剂作为蛋白和/或多肽的分散介质，制备过程不需要水或水溶液参与，所得的含蛋白和/或多肽的分散介质，可以直接与疏水相混合，由此获得单相、透明稳定的液体溶液，有效地解决了这类分子脂溶性低的问题。采用该方法制成的蛋白和/或多肽的疏水溶液，蛋白和/或多肽的脂溶性及跨膜能力得到显著改善，并且生物活性在室温下能够保持长久地稳定性，没有发生降解或生物活性丢失的现象。本发明的产品，制备工艺简单，成本低廉，适合于工业化生产。
【专利说明】含蛋白或多肽的疏水溶液、其制备方法及用途
【技术领域】
[0001]本发明属于药物学和制药学领域，涉及含蛋白或多肽的疏水溶液、其制备方法及用途。
【背景技术】
[0002]一些有着重要应用的蛋白质多肽如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胰岛素、甲状旁腺激素等，都是亲水性的，其疏水化有着许多重要的应用，例如:能够提高亲水物质的稳定性，能够提高蛋白多肽类药物的脂溶性，增加药物穿越生物膜屏障的能力；能够延长蛋白或多肽药物分子的作用时间，实现缓控释给药；对蛋白酶进行疏水化固定，能够极大地提高产率，并有利于产物的分离和蛋白酶的回收。
[0003]张海州等人通过油包醇体系，制备出了维生素C的非水溶液，能够大大提高维生素C的稳定性。但油包醇体系不稳定，因此，张海州等人以鲸蜡基聚乙二醇/聚丙二醇-10/1二甲基硅氧烷(ABIL EM90，黏度400-2000CS)作乳化剂，制备出膏霜制剂，能够避免油醇分离(张海州，等，用于稳定化妆品中维生素C的油包多元醇体系的研究，2009《日用化学工业》39 (4):249-252 ;专利 CN200810100726.7)。美国专利 US2011/0147259A1 通过加入高熔点的辅料三羟基硬脂酸(熔点110~140C)和12-羟基硬脂酸(熔点80C)以增加体系黏度(黏度值介于2，OOOcp - 3，000，OOOcp)，进而增加油包醇的稳定性。上述技术方案，均是通过增加黏度以克服不同密度的辅料分层，提高油包醇制剂的稳定性，膏霜制剂或2，000cp -3,000,OOOcp的油包醇体系，本领域技术人员都熟知，这些体系并不是真正意义上的透明均匀的溶液，所用的乳化剂ABIL EM90，按产品说明仅限于在化妆品中应用，并不能药用，并且12-羟基硬脂酸被美国FDA 列为间接食品添加剂(用于食品容器和包装材料)，并不能直接做为药物辅料使用。另外，CN200810100726.7中含有大量的多元醇(40 — 80wt%,)，难以显著的提高维生素C的脂溶性。
[0004]专利CN98126744.0和CN200910027809.2均是通过基因突变的方式，对蛋白酶进行改造，生产出可以稳定存在于非水介质中的蛋白酶变异体。M.Hashimoto将棕榈酸以共价结合的方式连接到胰岛素分子上，发现经过修饰后的胰岛素，脂溶性及跨膜能力显著增加(M.Hashimoto, etal.(1992) J.Pharm.Pharmacol.44:555-559)。但是，这些技术手段的共性是产业化成本高，并且伴有药物结构的改变，这有可能改变药物分子的毒理、药理。相对而言，通过制剂的手段，增加亲水分子的脂溶性，具有安全高效的特点。
[0005]通过脂质体技术，或形成药物与磷脂等物质的复合物，能够将亲水物质包裹于疏水介质中，从而提高药物分子的脂溶性及稳定性。相关研究请见JP Colletier, etal.(2002)BMC Biotechnol.2:9-16;CN1421246A,张磊，等，2009,《药学与临床研究》17:81-84 ；F.D.Cui, et a 1.(2006) J CONTROL RELEASE.114:242 — 250 ;D.Y.Lee, etal.(2007) J CONTROL RELEASE.123:39-45。然而在这些研究中，蛋白质、低分子量肝素等亲水性物质，并没有真正溶解在疏水相中，并且整个体系也以固态呈现，而非是一种单相、稳定、澄清的液体溶液。另外，就工艺流程而言，上述技术方案均需要通过旋转蒸发、冷冻干燥等手段除去溶剂，因而增加了设备成本和生产成本。
[0006]专利US5719039获得了一种含有蛋白酶的非水溶液，其是在合适的pH条件下，将含有蛋白酶的水溶液和含有Aerosol OT的异辛烷溶液混合，待形成蛋白酶与表面活性剂的离子复合物后，通过萃取的方法除去水相，溶解在有机相中的蛋白酶与表面活性剂离子复合物经过干燥后，可以溶解在丙酮等有机溶剂中形成稳定的单相溶液。但是在医药领域，有机溶剂有着严格的残留量限制。
[0007]专利CN01115327.X所公开的技术方案，系将含有胰岛素的水溶液与双亲物质混合，最终获得含有胰岛素的油相溶液。类似的AmaniElsayed将含有胰岛素-壳聚糖复合物的水溶液，与双亲物质混合，最终获得含有胰岛素的油相溶液。Amani Elsayed, etal.(2009)EUR.J.PHARM.B10PHARM.73:269 - 279。由于以水相作为亲水性物质(如胰岛素)的分散介质，并且上述制剂并没有去除水分的步骤，可见这些制剂并不属于亲水分子的疏水制剂，而是油包水(W/0)型乳剂。[0008]R.R.C.纽在专利 CN97193180.1、CN97196069.0 所公开的技术方案，以及 C.L.Li的研究(C.L.Li, et al.(2004) J.Pharma.Pharmaco 1.56:1101-1107)，其疏水性溶液得以实现有两个必不可少的步骤:以水相为分散介质，将亲水性物质溶解在水相中；水相与含有双亲介质的疏水相混合后，以及通过冷冻干燥方法等干燥手段除去水分。从这些制备步骤来看，上述疏水溶液的制备方法，均是将W/0型制剂中的水分，借助冷冻干燥等手段去除水分，这与本领域技术人员所了解的冻干乳制剂的制备方法并无二异。另一方面，在去除水分过程中，冷冻干燥法高能耗且生产效率低，而其它诸如喷雾干燥法等干燥手段，又会对稳定性差的药物(如蛋白质)造成影响。
[0009]一种理想的亲水性分子疏水制剂，是制备工艺简单、无需特殊设备、成本低廉，且所使用的辅料是不会带来安全隐患的物质。更重要的是，亲水性分子不以水或水溶液为分散介质，疏水制剂中亲水性分子的活性不仅不会丢失，而且能够在较长的时期内保持。

【发明内容】

[0010]本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了一种含有蛋白和/或多肽的疏水溶液，本发明人惊奇地发现，该疏水溶液能够有效地解决蛋白和/或多肽脂溶性低的问题。本发明的制备过程不需要水或水溶液参与，所得的含蛋白和/或多肽的分散介质，可以直接与疏水相混合，由此获得单相、透明稳定的液体溶液。本发明人还惊奇地发现，蛋白和/或多肽在由此获得的疏水溶液中，脂溶性及跨膜能力得到显著改善，并且生物活性在室温下能够保持长久地稳定性，没有发生降解或生物活性丢失的现象。由此提供了下述发明:
[0011]本发明的一个方面涉及一种含蛋白或多肽的疏水溶液，包括作为主药的蛋白和/或多肽、水溶性助溶剂、乳化剂以及油相。
[0012]优选地，所述蛋白和/或多肽为亲水性的蛋白和/或多肽(即在水溶液中能够维持稳定构象，并保持生物学功能)。
[0013]所述蛋白和/或多肽可以从生物机体中分离获得，也可以通过基因工程手段或有机合成方式获得。
[0014]根据本发明任一项所述的疏水溶液，其中，所述蛋白和/或多肽的分子量为I 一200kDa ;优选为2 — IOOkDa ;更优选为3 — 60kDa，特别优选为4 — 55kDa。[0015]为了更好地说明，本发明实施例中以胰岛素、PTH1-34、GLP-1为多肽代表，其分子量小于6kDa;以胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、尿激酶等作为大分子蛋白质代表，其中尿激酶的分子量最大，约为54kDa。它们的具体分子量如下面的表1所示。
[0016]表1:部分蛋白或多肽的分子量和等电点
【权利要求】
1.一种含蛋白或多肽的疏水溶液，包括作为主药的蛋白和/或多肽、水溶性助溶剂、乳化剂以及油相。
2.根据权利要求1所述的疏水溶液，其特征在于如下的(I)一(17)项中的任意一项或者多项: (1)所述蛋白和/或多肽为亲水性蛋白和/或多肽； (2)所述蛋白和/或多肽的分子量为I一 200kDa ;优选为2 — IOOkDa ;更优选为3 —60kDa，特别优选为4 - 55kDa ； (3)所述蛋白和/或多肽选自降钙素、胰岛素、GLP-1(胰高血糖素样肽-1)、甲状腺素、甲状旁腺激素、生长激素、干扰素、尿激酶、蚓激酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、沙雷肽酶、溶葡萄球菌酶、溶菌酶和过氧化物酶中的任一种或多种；具体地，所述降钙素选自鲑鱼降钙素、鳗鱼降钙素和人降钙素中的任意一种或多种；具体地，所述胰岛素选自猪胰岛素、牛胰岛素和人胰岛素中的任意一种或多种；具体地，所述甲状旁腺激素选自人体甲状旁腺激素1-84和人甲状旁腺激素1-34中的任意一种或多种；具体地，所述生长激素选自猪生长激素、牛生长激素和人生长激素中的任意一种或多种； (4)所述蛋白和/或多肽的含量为0.001 - 5% (w/w);优选为`0.01 — 2% (w/w)或`0.05 — 2% (w/w);更优选为 0.05 — I % (w/w)>0.1 — I % (w/w)或 0.15 — I % (w/w)；进一步优选为 0.1 — 0.8% (w/w)或 0.15 — 0.8% (w/w)； (5)所述水溶性助溶剂选自乙醇、1,2-丙二醇、甘油、二甲基亚砜、PEG200、PEG300和PEG400中的任意一种或多种； (6)所述水溶性助溶剂的含量为0.1 - 15% (w/w);优选为3 - 12% (w/w);更优选为 5 — 12% (w/w)； (7)所述乳化剂为一种或多种的HLB大于或等于4并且小于或等于9的乳化剂，或者为一种或多种的HLB大于或等于12的乳化剂；优选地，所述乳化剂为一种或多种的HLB大于或等于4并且小于或等于9的乳化剂；更优选地，所述乳化剂为一种或多种的HLB大于或等于6并且小于或等于9的乳化剂；特别优选地，所述乳化剂为两种或两种以上的HLB大于或等于6并且小于或等于9的乳化剂； (8)所述乳化剂选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、司盘20、司盘60、司盘80、吐温20、吐温`80、聚甘油-6- 二油酸酯、聚甘油油酸酯、聚乙二醇-6-甘油单油酸酯、聚乙二醇-6-甘油亚油酸酯、聚乙二醇十二羟基硬脂酸酯、聚氧乙烯醚(35)蓖麻油、聚氧乙烯醚(40)氢化蓖麻油、生育酚聚乙二醇琥珀酸酯、聚乙二醇辛酸/癸酸甘油酯和月桂酸聚乙二醇甘油酯中的任意一种或多种； (9)所述乳化剂包含乳化剂I和乳化剂2，其中，乳化剂I为大豆卵磷脂和/或蛋黄卵磷月旨，乳化剂2选自聚甘油-6- 二油酸酯、聚甘油油酸酯`、聚乙二醇-6-甘油单油酸酯、聚乙二醇十二羟基硬脂酸酯和聚乙二醇辛酸/癸酸甘油酯中的任意一种或多种；优选地，乳化剂I的含量为7.5 — 10% (w/w)，乳化剂2的含量为2.5 — 5% (w/w)； (10)所述乳化剂的含量为O— 40% (w/w);优选为I 一 25% (w/w);更优选为5 —25% (w/w);进一步优选为 5 — 20% (w/w)或 5 — 18% (w/w)； (11)所述油相选自所述油相选自中链脂肪酸酯、大豆油、玉米油、花生油、红花油、橄榄油、油酸、维生素E、维生素A和油凝胶中的任意一种或多种；(12)所述油相的含量为45- 95% (w/w);优选为65 — 90% (w/w);更优选为70 —90% (w/w)或 80 — 90% (w/w)； (13)其还包含pH调节剂，所述pH值调节剂选自盐酸、硫酸、乳酸、醋酸、枸橼酸、磷酸、三乙胺、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠中的一种或多种；(14)所述疏水溶液不含水，或者水的含量低于1.0% (w/w)，优选低于0.5% (w/w)； (15)所述疏水溶液的制备过程中不使用水或含水溶液； (16)所述疏水溶液的制备过程不包含除去或者降低水分的步骤(例如旋转蒸发、喷雾干燥或冷冻干燥); (17)所述疏水溶液为单相溶液。
3.根据权利要求1或2所述的疏水溶液，其组分和含量如下面的I) 一 7)组中的任意一组所示:
4.根据权利要求1或2所述的疏水溶液，其组分和含量如下面的(I) - (7)组中的任意一组所示:
(!)重组人贐島素M毫克二甲基亚砜I克I摩尔*酸30微克 中健脂翁酸甘_三酯(Croda_l GTCC)8克 聚乙二醇辛酸/癸酸甘油睛0.2克大豆卵磷鹰0.8克聚甘油油酸酯0.2克；(2)PTH1-3460 亳克丙二醇I见太豆油I4克 大豆卵磚脂(Epikuron 170?Degussa) 0.S 克聚甘油油酸酯0.3克； (3)GLP-120 亳克雨二醇O, 3克 辛酸癸酸甘油酯(Miglyol 812, SASOL)5克 太豆卵鱗脂《Bpikuron 17(1,Degussa) 0.5 克 聚乙二醇十二鋒基璦I旨酸_0.2克；(4)龜蛋白酶30亳克甘油I免 辛酸癸酸甘油酯(Miglyol 812, SASOL)14克聚甘油油酸酯1.5克大I卵磷廳0.5克；(5)
5.权利要求1至4中任一项所述的疏水溶液的制备方法，包括下述步骤: 1)在4一 25°C，将蛋白和/或多肽加入水溶性助溶剂，在400 - 1500rpm条件下，搅拌至形成透明清亮溶液； 2)在20- 80°C条件下，将油相与乳化剂相混合，并在200 - 8000rpm搅拌条件下持续搅拌，直至整个体系呈透明清亮状； 3)在4一 37°C条件下，将步骤I)产物，加入步骤2)产物中，并在200 — 800rpm条件下继续搅拌，直至形成单相、透明清亮的均匀制剂，最终获得含蛋白和/或多肽的疏水溶液。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其中，所述制备方法不包含使用水或含水溶液的步骤。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其中，所述制备方法不包含除去或者降低水分的步骤(例如旋转蒸发、喷雾干燥或冷冻干燥)。
8.—种药物制剂，其包含权利要求1至4中任一项所述的疏水溶液，或者由权利要求1至4中任一项所述的疏水溶液制得；具体地，所述药物制剂为口服液、注射液、软胶囊、乳剂、纳米颗粒或纳米胶囊。
9.权利要求1至4中任一项所述的疏水溶液在制备以蛋白或多肽为有效成分的药物、化妆品或保健食品中的用途。`
【文档编号】A61K38/26GK103861090SQ201210550294
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月18日 优先权日:2012年12月18日
【发明者】马二利, 郑昌学 申请人:美迪思生物科技(北京)有限公司