一种特异抗人肺特异x蛋白的单克隆抗体的制备、鉴定及应用的制作方法

专利名称：一种特异抗人肺特异x蛋白的单克隆抗体的制备、鉴定及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株特异性抗人肺特异X蛋白(LunX蛋白)的单克隆抗体。具体地说，本发明涉及一株特异性针对人LunX蛋白第103至256位的氨基酸序列的单克隆抗体，本发明还涉及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及所述单克隆抗体的应用。
背景技术：
在全球范围内，肺癌是近年来发病率最高的恶性肿瘤之一，其发病率上升速度是最快的。肺癌5年存活率为13 % ;80 %的患者在诊断后I年内死亡；肺癌早期诊断率为15%，但这些患者5年存活率达到60% 90%。由此可见，亟待寻找肺癌的早期诊断和治疗的祀点。目前国际上倾向于将肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌占肺癌的85%以上。肺特异X 蛋白(简称 LunX 蛋白)，又称PLUNC ；NASG ；SPURT ；LPLUNC3 ；SPLUNCI。其基因是日本学者Iwao等通过对人体13种不同组织中分离出来的RNA运用差异显示技术，于2001年发现的一种人肺组织特异性X蛋白。基因定位于20pll.1ql2，全长1015bp，包括一个编码256个氨基酸的768个核苷酸的开放式读码框。其含有和LPS结合的BPI样结构域，所以认为LunX蛋白是一个参与天然免疫的天然免疫分子。目前其主要研究集中于上呼吸道，当感染时上皮细胞等LunX蛋白表达升高，而正常肺实质细胞不表达LunX蛋白，但伴随癌变开始高表达。由于LunX蛋白在肺癌病人中表达的特异性，因此，准确快速检测组织局部LunX蛋白表达以及探讨以LunX作为靶标的生物治疗具有重要的临床意义。

发明内容
发明概述本发明的一个目的是提供对人LunX蛋白有特异性的单克隆抗体。本发明的又一个目的是提供产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株LunX-mAb-S-35-8。本发明的又一个目的是提供本发明的单克隆抗体的制备方法。本发明的又一个目的是验证本发明的单克隆抗体在体外能够抑制肺癌细胞的增殖，在体内可以抑制肿瘤的生长，并且在体内可以抑制肿瘤的生长及转移。本发明的又一个目的是提供本发明的单克隆抗体在免疫组织化学检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者的肺组织中LunX蛋白表达试验中的应用。本发明的又一个目的是提供本发明的单克隆抗体在细胞免疫荧光检测NSCLC患者的锁骨下淋巴结中LunX蛋白表达试验中的应用。有益效果本发明提供了一株特异性抗人LunX蛋白的单克隆抗体、其制备方法、鉴定及应用，所述单克隆抗体特异性好，灵敏度高，能够应用于检测人肺脏组织和淋巴结LunX蛋白的表达，可以作为肺癌的早期或转移的诊断指标之一，另外，本发明的单克隆抗体可以抑制肿瘤的生长及转移。因此，本发明对肺癌的诊断及治疗具有重大的临床意义。发明详述本发明的第一方面涉及一种特异性抗人LunX蛋白的单克隆抗体，该抗体的类型为IgG2b, K，其特异性针对的是人LunX蛋白的第103-256位的氨基酸序列。本发明的第二方面涉及稳定分泌所述抗人LunX蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株LunX-mAb-S-35-8，该细胞株已于2012年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉，武汉大学，邮编430072)，保藏编号为CCTCC NO :C2012187。本发明的特异性抗人LunX蛋白的单克隆抗体在本文中也可以称为单克隆抗体S-35-8。 本发明的第三方面涉及所述单克隆抗体的制备方法，所述制备方法包括重组人LunX蛋白的表达、复性与纯化，用纯化后的人LunX蛋白免疫小鼠，取免疫后小鼠的脾细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞融合，筛选出能够稳定分泌对重组人LunX有反应性的单克隆抗体的杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞培养上清中或者从用该杂交瘤细胞免疫的小鼠腹水中获取单克隆抗体。本发明的第四发明涉及本发明的特异性抗人LunX蛋白的单克隆抗体的功能鉴定S-35-8单克隆抗体能够在体外抑制NC1-H292细胞的增殖，将本发明的S_35_8单克隆抗体加入NC1-H292细胞培养上清中，细胞计数实验显示S-35-8单克隆抗体能够抑制NC1-H292细胞的增殖；S-35-8单克隆抗体能够在体内抑制移植性肿瘤(移植性肿瘤人肺癌细胞系NC1-H292细胞接种于裸鼠皮下)的生长，肿瘤大小测量结果显示S-35-8单克隆抗体能够抑制肿瘤的生长；S-35-8单克隆抗体能够在体内抑制移植性肿瘤(移植性肿瘤人肺癌细胞系NC1-H292细胞通过尾静脉接种于裸鼠体内)的生长和转移，小鼠荧光成像结果显示S-35-8单克隆抗体能够抑制肿瘤的生长和转移。本发明的第五方面涉及本发明的特异性抗人LunX蛋白的单克隆抗体在制备用于检测非小细胞肺癌患者的组织中的LunX蛋白的试剂中的应用。在一个优选实施方案中，所述非小细胞肺癌患者的组织选自肺组织或锁骨下淋巴结。具体地，本发明的特异性抗人LunX蛋白的单克隆抗体可以用于免疫组织化学检测NSCLC患者肺组织中的LunX蛋白。用本发明的S-35-8单克隆抗体鉴定LunX蛋白的表达，免疫组织化学实验显示S-35-8单克隆抗体能在免疫组织化学水平用于检测NSCLC患者肺组织中的LunX蛋白。本发明的特异性抗人LunX蛋白的单克隆抗体还可以用于细胞免疫荧光检测NSCLC患者锁骨下淋巴结中的LunX蛋白。用本发明的S-35-8单克隆抗体鉴定LunX蛋白的表达，细胞免疫荧光实验显示S-35-8单克隆抗体能在细胞免疫荧光水平用于检测NSCLC患者锁骨下淋巴结LunX蛋白。本发明的第六方面涉及本发明的特异性抗人LunX蛋白的单克隆抗体的制药用途。具体地，涉及本发明的特异性抗人LunX蛋白的单克隆抗体在制备用于抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用，或本发明的特异性抗人LunX蛋白的单克隆抗体在制备用于抑制体内肿瘤生长和/或转移的药物中的应用。本发明的第七方面涉及一种用于检测非小细胞肺癌的诊断剂，所述诊断剂包含本发明所述的特异性抗人LunX蛋白的单克隆抗体。本发明的第八方面涉及一种用于抑制肿瘤细胞增殖和/或抑制肿瘤生长和/或转移的药物，所述药物包含治疗有效量的本发明所述的特异性抗人LunX蛋白的单克隆抗体。优选地，所述肿瘤为非小细胞肺癌。优选地，本发明涉及一种用于治疗受试者中的非小细胞肺癌的药物，所述药物包含治疗有效量的本发明所述的特异性抗人LunX蛋白的单克隆抗体。其中所述受试者为哺乳动物，优选为人。本领域技术人员应该理解，尽管在本发明的一个具体实施方案中，本发明的特异 性抗人LunX蛋白的单克隆抗体为一株鼠来源的抗人Lunx蛋白的单克隆抗体(由鼠源杂交瘤细胞表达)，其结构可划分为可变区、恒定区和绞链区，可变区识别及结合Lunx蛋白，而恒定区具有小鼠种属特异性，但是，本发明的单克隆抗体可以进行人源化处理，即，通过分子克隆等技术将其恒定区替换为人种属的IgG2b, K亚型的恒定区，人源化后的抗体可以用于治疗人受试者中的非小细胞肺癌。因此，本发明的特异性抗人LunX蛋白的单克隆抗体的人源化形式也包含在本发明的范围内。本发明中，术语“单克隆抗体的特异性”是指单克隆抗体识别抗原上的特定表位或者抗原决定簇并与之结合的性质。术语“单克隆抗体的反应性”是指在合适的反应条件下，单克隆抗体与抗原结合的能力。术语“细胞株”是指通过筛选或者有限稀释方法，从原代培养物或者细胞系获得的单细胞培养物。根据本发明的公开内容，选择LunX蛋白的C端(第103个氨基酸-第256个氨基酸)，按照本文描述的方法制备有特异性的单克隆抗体对本领域的技术人员而言是显而易见的，应该视为包含在本发明的范围内。


从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中图1，原核重组表达载体pET22b_LunX的构建流程图。图2，LunX重组蛋白表达、复性、纯化和鉴定。A，重组蛋白诱导表达结果；B，重组蛋白以包涵体形式存在结果；C，重组蛋白免疫印迹鉴定结果；D，重组蛋白复性后结果；E，复性蛋白纯化后结果，F，纯化后LunX蛋白的质谱鉴定结果。箭头表示LunX重组蛋白的条带。图3，本发明的单克隆抗体纯度鉴定结果。图4，免疫印记检测本发明的单克隆抗体特异性的结果。图5，S-35-8单克隆抗体应用于肺癌的治疗。A，S_35_8单克隆抗体在体外抑制NC1-H292细胞的增殖；B，S-35-8单克隆抗体抑制移植皮下肿瘤的生长；C，S-35-8单克隆抗体抑制移植肺癌的生长和转移。
图6，S-35-8单克隆抗体应用于免疫组织化学检测NSCLC患者肺组织LunX蛋白表达的结果。图7，S-35-8单克隆抗体应用于细胞免疫荧光检测NSCLC患者锁骨下淋巴结LunX蛋白表达的结果。生物材料保藏说明本发明筛选得到的表达本发明的特异性抗人LunX蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为LunX-mAb-S-35-8，该细胞株已于2012年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉，武汉大学，邮编430072)，保藏编号为CCTCC NO :C2012187。序列表说明 SEQ ID No:1 入 LunX 蛋白的 cDNA 序列(NCBI Reference Sequence:
_ NM^016583.3)__
SEQ ID No:2 人 LunX 蛋丨 的贫坫酸序列(uniprot/Q9NP55 ,
_UNQ787/PRQ1606)_
SEQIDNo:3 原核重组表达的LunX蛋白的氨基酸序列，为人UmX
蛋广丨笫103至256位氨基酸.序列，其中第--位的M为 存:原核细胞中表达引入的起始中硫氨酸，C端的6个 His为纯化标签
具体实施例方式下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。实施例中的实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规技术，实验试剂均为市售
女口
广叩ο实施例1 :原核重组表达载体pET22b_LunX的构建人工合成LunX 全长基因(NCBI Reference Sequence :ΝΜ_016583· 3)，并克隆到pBluescriptll SK(+)载体(购自上海生工)中构建 pBluescriptll SK(+)-LunX 重组载体。通过http: //expasy. otr/tools/在线软件对LunX的二级结构预测,截取LunX的C端(第103至256位氨基酸)进行重组表达，在目的序列的C端依次引入6His-Tag和终止密码子。设计上游引物5’ -GGAATTCCATATGAACAACATCATTGACAT-3’ 和下游引物 5’ -CCGCTCGAGGACCTTGATGACAAAC-3’。以pBluescriptll SK (+)-LunX为模板PCR扩增目的片段，PCR产物经过NdeI和XhoI酶切之后克隆到pET_22b (+)载体(购自Novagen)，转入大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，筛选阳性克隆进行DNA测序鉴定，测序结果表明重组表达载体pET22b-LunX构建成功。原核重组表达载体pET22b-LunX的构建流程如图1所示。实施例2 :重组LunX蛋白的表达，复性，纯化及鉴定。I，重组LunX蛋白的诱导表达将pET22b_LunX转入到大肠杆菌Rosetta (DE3)感受态细胞(购自Novagen公司，货号70954-3)中，挑选单克隆菌落接种于含有50μ g/ml氨苄青霉素和34 μ g/ml氯霉素的LB培养基中，置于37°C摇床中，200转/分钟培养至OD6tltol = O. 6-0.8时，加入ImM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，继续培养4-6小时诱导蛋白表达。4°C、6000g离心10分钟收菌，沉淀用裂菌缓冲液(50mM TrisUOOmM NaCl pH8. 5)洗涤之后，用高压破碎方法裂菌。裂菌后的混合体进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定，如图2A结果显示，和对照相比，IPTG诱导 后菌裂解液在ISkDa处有一条明显的条带。裂菌后的上清和沉淀分别进行SDS-PAGE鉴定，结果显示重组蛋白主要以包涵体形式存在，如图2B所示。对目的条带进行免疫印迹检测，即小鼠抗His-tag抗体(购自Abmart公司，货号M20001)l 1000稀释作为一抗，辣根过氧化物酶(酶)标记的羊抗鼠IgG(购自Boster公司，货号BA1050)1: 5000稀释作为二抗,化学发光显色(显色试剂盒购自Thermoscientific公司，货号34080)检测,在18kDa处有一条特异的条带，图2C显示,表明诱导表达的蛋白为重组LunX蛋白。2，重组LunX蛋白的复性及纯化。采用稀释复性的方法对重组LunX蛋白进行复性。具体方法大量诱导Rosetta (DE3)/pET22b_LunX菌,通过高压破碎，4°C、6000g离心10分钟，弃上清，沉淀用包涵体洗涤缓冲液(50mM TrisUOOmM NaCl、2M尿素、ImM 二硫苏糖醇PH8. 5)洗涤3次，每次4°C、6000g离心10分钟，弃上清。包涵体沉淀用包涵体裂解液(50mM TrisUOOmM NaCl、8M尿素、ImM 二硫苏糖醇pH8. 5)溶解，室温搅拌I小时。4°C、12000g离心10分钟，取上清，以I 500比例缓慢加入到复性缓冲液(50mM TrisUOOmMNaCUO. 5M L-精氨酸、3mM还原型谷胱甘肽、O. 3mM氧化性谷胱甘肽pH9. 5)中，4°C静置48小时，复性蛋白用Millpore公司的LabScale TEF system(5kDa浓缩膜)进行浓缩，蛋白浓缩液在透析缓冲液(50mM TrisUOOmM NaCl pH9. O)中透析过夜，如图2D所示。浓缩后的复性蛋白用镍柱亲和层析纯化，不同浓度的咪唑洗脱目的蛋白，在IOOmM咪唑洗脱液(50mMTrisUOOmM NaCl、200mM咪唑pH9. O)中得到纯度一般的重组LunX蛋白。进一步用分子筛层析(S-200)纯化，洗脱缓冲液(Tris 50mM、NaCl IOOmM PH9. 2)洗脱到90ml时，得到纯度较高复性效果较好的重组LunX蛋白洗脱液，将含有目的蛋白的洗脱液用Millipore浓缩管进行浓缩和Bio-Rad蛋白定量试剂盒进行定量，最后可以得到纯度大于90%、浓度为Img/ml的LunX重组蛋白。结果如图2E所示。3，重组LunX蛋白的鉴定。将纯化后的LunX重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，并用考马斯亮蓝染色。将含有目的条带的胶进行质谱鉴定，结果显示，有13个不同的肽段和LunX序列相匹配，结果如图2F所示，划线部分为13个肽段所覆盖的序列，几乎覆盖整个LunX蛋白的C端，证明该重组蛋白即为重组LunX蛋白。实施例3 :抗人LunX蛋白单克隆抗体的制备1.细胞融合前准备
(I)小鼠免疫及脾细胞的制备抗原免疫小鼠的方法纯化后终浓度为100 μ g/ml的LunX蛋白与等体积完全弗氏佐剂(CFA)混合，充分混匀形成油包水状，取8-10周龄的BALB/c雌鼠(购自上海斯莱克，体重20g左右，8周龄)进行初次免疫，每只小鼠腹腔注射40-60 μ g LunX蛋白(剂量为2. 5mg/kg小鼠体重)。以后间隔2周免疫一次,使用相同剂量的LunX蛋白与等体积不完全弗氏佐剂混合。免疫5次后，ELISA检测小鼠血清效价不低于1: 105时，小鼠腹腔注射40-60 μ g LunX蛋白，三天后取小鼠脾细胞。脾细胞的制备方法将上述免疫后小鼠眼眶采血后脱白处死，无菌取脾脏，过200目细胞筛，收集脾细胞悬液，冰浴中自然放置10分钟后弃沉降物，4°c 750g离心10分钟，收集细胞，加入 Iml 红细胞裂解液(O. 155M NH4Cl, IOmM KHCO3,0.1mMNa2EDTA pH7. 4)作用 5 分钟，加入20ml不完全RPM1-1640培养基(购自赛默飞，货号SH30809. 01B)中止反应。4°C 750g离心10分钟，弃上清，细胞沉淀用20ml不完全RPM1-1640培养基洗涤2次，每次4V750g离心10分钟。弃上清，细胞沉淀用不完全RPM1-1640培养基重悬。ELISA检测抗体效价的方法用包被液(O.1M碳酸盐缓冲液pH 9.6)稀释纯化的LunX蛋白至10 μ g/ml，100 μ I每孔包被96孔ELISA板，4 °C过夜，用PBST (O. 05 %Tween20-PBS pH 7· 4)清洗3遍，I % BSA封闭，37°C孵育2小时。PBST清洗3遍，加入待测倍比稀释的小鼠血清(实验组)，设置6-7个梯度，未免疫小鼠做阴性对照，100 μ I每孔，37°C孵育I小时。PBST清洗3遍，每孔加入100 μ I辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠抗体(购自博士德1: 10000稀释)，37°C孵育I小时。PBST清洗3遍后加入TMB(购自eBioscience公司，货号00-4201-56)底物，100 μ I每孔，避光显色10-15分钟，加入终止液(1Μ HCl) 100 μ I每孔，终止后立即用酶标仪进行检测，读取波长450nm的吸光值(OD45tl)及630nm的吸光值(OD63tl)，计算Λ OD450 = OD45tl-OD63tl。与PBS孔相比，实验组Λ OD450与阴性对照组AOD45tl的比值大于2.1为阳性。(2)饲养细胞的制备在细胞融合的前一天，制备小鼠腹腔巨噬细胞。将8周BALB/c小鼠脱臼处死，无菌操作下，剪开腹部，吸取5ml RPM1-1640不完全培养基注入腹腔，反复冲洗腹腔，吸回冲洗液并用RPM1-1640不完全培养基洗涤2次，每次4°C 300g离心10分钟，收集细胞用含10%小牛血清的RPM1-1640完全培养基重悬细胞，使浓度为2xl05/ml，加入96孔板中，每孔IOOul，37 0C 5% CO2条件下培养。(3)骨髓瘤细胞SP2/0的培养，复苏骨髓瘤细胞SP2/0(购自ATCC，ATCC编号CRL-1581)，用8_氮鸟嘌呤筛选HGPRT缺陷株，细胞融合时细胞要处于对数生长期，融合前用不完全的RPM1-1640培养基洗涤，每次4°C 300g离心10分钟，收集细胞并用不完全的RPM1-1640培养基重悬。2，细胞融合及杂交瘤细胞的制备取制备好的免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0于离心管中，分别取IO8和
2.5X107，用不完全的RPM1-1640培养基洗涤一次。离心后弃上清，轻轻弹散细胞，加入O. 7ml 40°C的PEG(分子量1，000-6, 000)溶液，PEG的终浓度为50 % (W/V),60秒之后开始加入40°C预热的不完全RPM1-1640培养基(5分钟加完)，首先加1ml，I分钟后加4ml，二分钟后加入20ml。4°C 300g离心10分钟收集细胞，用2XHAT培养基轻轻悬起细胞，使浓度为2xl06/ml。IOOul每孔加到含饲养细胞的96孔板中，继续培养。每两天吸出上清 IOOul,加入等体积的 HAT 培养基(20 % FCS、IOmM sodium hypoxanthine>40mMaminopterinU. 6mM thymidine 的 DMEM 培养基)。一周后，用 HT 培养基(包含 20% FCS、IOmM sodiumhypoxanthine、1. 6mM thymidine 的 DMEM 培养基)培养 2-3 周。当观察到杂交瘤细胞克隆长出时，用含10%小牛血清的RPM1-1640培养基培养，并用ELISA法检测是否有抗体分泌。接着用有限稀释法筛选阳性克隆，多次筛选后获得杂交瘤细胞株。连续体外培养2个月以上或者冻存6个月之后，细胞株仍能稳定和大量分泌抗人LunX蛋白抗体，从而获取杂交瘤细胞株命名为LunX-mAb-S-35-8。该杂交瘤细胞株已于2012年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉，武汉大学，邮编430072)，保藏编号为CCTCCN0 :C2012187。3，单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备一般有两种方法，方法一，增殖培养法，杂交瘤细胞体外低血清培养2-3天后大量收培养上清，上清中含有较高浓度的单克隆抗体。方法二，小鼠腹腔 接种法，首先500 μ I无菌的液体石蜡通过腹腔免疫8-10周龄的BALB/C鼠，一周之后腹腔注射I X 106杂交瘤细胞，7-10天左右收集腹水，高速离心收集上清。通过上述方法获得的抗体，用Protein A亲和层析方法纯化并进行SDS-PAGE鉴定抗体纯度,如图3所示。经过纯化的单克隆抗体纯度高于95%，抗体的重链约为45kDa，轻链约为25kDa。实施例4 :单克隆抗体的鉴定1，间接ELISA测定单克隆抗体效价ELISA检测单克隆抗体效价的方法如下用包被液(0.1M碳酸盐缓冲液pH 9. 6)稀释LunX重组蛋白至10 μ g/ml, 100 μ I/孔，包被 96 孔 ELISA 板，4°C过夜，用 PBST (0. 05 % Tween20-PBSpH 7. 4)清洗 3 遍，I % BSA 封闭，37°C孵育2小时。PBST清洗3遍，分别加入经过倍比稀释的杂交瘤细胞培养上清或腹水，设置12个梯度，用无关的杂交瘤细胞(例如，无关的杂交瘤细胞可为分泌NKp30的3G5杂交瘤细胞株(CGMCC NO :4244)，关于该无关的杂交瘤细胞可参见申请号为201010531489. 7的专利申请，其申请日为2010年10月29日，
公开日为2011年3月16日)培养上清和腹水作为阴性对照，设PBS为调零孔，100 μ I/孔，37°C孵育I小时。PBST清洗3遍，每孔加Λ 100 μ I辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠抗体(购自博士德，I 10000稀释)，37°C孵育I小时。清洗后每孔加入100 μ I TMB底物液，避光显色10-15分钟，加入终止液(1ΜHCl) 100 μ I/孔，终止后立即用酶标仪进行检测，读取波长450nm的吸光值(OD45tl)及630nm的吸光值(OD63tl)，计算Λ OD450 = OD450-OD6300与PBS孔相比，实验组Λ OD450与阴性对照组AOD45tl的比值大于2.1为阳性。2，竞争ELISA测定单克隆抗体的亲和常数。用包被液稀释LunX抗原至2 μ g/ml, 100 μ I/孔，包被96孔ELISA板，4°C过夜。制备抗原竞争的单克隆抗体混合液，将抗原对倍稀释成2μ g/ml、l μ g/ml、0. 5 μ g/ml、0. 25 μ g/ml,0. 125 μ g/ml 0. 0625 μ g/ml,0. 03125 μ g/ml、0 μ g/ml，各取 50 μ I 与 50 μ I 单克隆抗体杂交瘤细胞上清4°C孵育过夜。用PBST(0. 05% Tween20-PBS pH 7. 4)清洗ELISA板3遍，I % BSA封闭，37°C孵育2小时。PBST清洗3遍，将各浓度抗原与杂交瘤上清的孵育液100 μ I加入每孔，设PBS为调零孔，37°C孵育I小时。PBST清洗3遍，每孔加入100 μ I辣根过氧化物酶(HR)标记的羊抗鼠抗体(购自博士德，I 10000稀释)，37°C孵育I小时。清洗后加入TMB底物液，100 μ I/孔，避光显色10-15分钟，加入终止液(1Μ HCl) 100 μ I/孔，酶标仪终止后立即检测OD450和0D630。抗体亲和常数计算公式为AO/ (AO-A) = Ι+Kd/aO，其中AO为竞争抗原为O时的OD值，A为各抗原浓度的OD值，a0为抗原总量，Kd为解离常数。根据K= 1/1((1求出1(，1(为亲和常数，单位L/M。3，单克隆抗体的Ig亚类测定采用Sigma-Aldrich提供的小鼠单克隆类型鉴定快速检测试剂盒IsoQuickTM Kitfor Mouse Monoclonal Isotyping IS0Q5中的亚类检测试纸进行测定。单克隆抗体的亚类、培养上清效价、腹水抗体效价和亲和常数的结果见表I。 表I
抗体名称|S-35-8单克隆抗体
亚类_IgG油，K_
培养上清抗体效价 10_4_
腹水抗体效价_10_^_
亲和常数(L/M)|8. 56 X IO84，单克隆抗体的特异性鉴定采用免疫印迹法鉴定三株单克隆抗体的特异性。分别取Iug融合蛋白6His_LunX和6His-NKP46 (阴性对照，带6个His的NKP46原核重组蛋白)进行检测，首先SDS-PAGE电泳，接着通过湿转的方法将目的蛋白转入PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭I小时，用5%脱脂牛奶稀释单克隆抗体至2ug/ml，室温孵育2小时，TBST洗去非特异结合的抗体，最后孵育二抗(HR标记的羊抗鼠IgG，购自博士德)I小时，孵育温度为37摄氏度，TBST洗涤3次，化学发光显色。如图4所示,经Western blot鉴定,在相对分子质量18kDa(6His_LunX处有一特异条带，而在30kDa(6His-NKp30)处没有特异性条带。说明该单克隆抗体是特异结合LunX,而对6Hi s-Tag没反应。实施例5 :抗人LunX蛋白单克隆抗体的应用1.应用于肺癌的治疗(I) S-35-8单克隆抗体能够在体外抑制肺癌细胞的增殖当NC1-H292细胞(购自上海中科院细胞库)生长状态良好时，铺3xl05个细胞于25cm2细胞培养瓶中，总共铺三瓶，第一瓶加终浓度为80ug/ml的S-35-8单克隆抗体，第二瓶加终浓度为160ug/ml的S-35-8单克隆抗体，第三瓶加等体积的PBS(作为阴性对照)。370C 5% CO2条件下培养3天，用血细胞计数板计数，统计后的结果如图5A所示。可以看出加入单克隆抗体刺激NC1-H292细胞三天后，细胞增殖能力降低并且呈现剂量依赖性，说明本单克隆抗体能够在体外抑制NC1-H292细胞的增殖。(2)在体内S-35-8抑制肿瘤的生长皮下瘤模型体外扩增培养NC1-H292细胞(购自上海中科院细胞库)，收集细胞并用不完全RPM1-1640培养基洗涤一次，800rpm，10分钟离心收集细胞，用不完全RPM1-1640培养基重悬，浓度为2xl07个/ml，接种200ul细胞于5周龄裸鼠(购自上海斯莱克，体重为15g作用)腋窝皮下，总共接种10只。一周后随机分成两组实验组和PBS组，每组5只，实验组每周一和周五通过尾静脉注射20mg/kg(每千克小鼠体重注射20毫克抗体)并测量皮下肿瘤的长边和短边，对照组每周一和周五通过尾静脉注射等体积的PBS并测量皮下肿瘤的长边和短边，总共处理32天。按经验公式(肿瘤大小=长边X短边X短边/2)计算出肿瘤大小，从图5B可以看出实验组肿瘤大小明显小于PBS组，说明单克隆抗体能够抑制肿瘤的生长。转移模型体外扩增培养A549 (通过p⑶NA3质粒转染荧光素酶报告基因)细胞(购自上海中科院细胞库)，收集细胞并用不完全F12k培养基(购自赛默飞)洗涤一次，800rpm, 10分钟离心收集细胞，用不完全F12k培养基重悬，浓度为1. 5xl07个/ml，200ul细胞通过尾静脉接种5周龄裸鼠(购自上海斯莱克，体重为15g作用)，总共接种14只。两天后随机分成两组实验组和PBS组，每组7只，实验组每周一和周五通过尾静脉注射20mg/kg(每千克小鼠注射20毫克抗体)抗体，对照组每周一和周五通过尾静脉注射等体积的PBS，在第三周和第五周时，两组中的每只裸鼠均注射10mg/kg(每千克小鼠注射10毫克)荧光素酶底物，并在小动物成像仪上进行拍照，荧光强度和肿瘤病理情况称正比，结果如图5C所示，从图中可以看出3周后和5周后实验组肿瘤结节阳性区域大小明显少于PBS组，并且荧光强度也弱于PBS组，说明单克隆抗体可以抑制肿瘤的生长及转移。2.应用于免疫组化检测人肺癌组织取三例人肺组织标本作为切片，一例肺炎病灶，一例肺结核病灶，一例非小细胞肺癌的癌组织和癌旁组织，检测其中LunX蛋白表达情况。免疫组化流程固定，用福尔马林(12%甲醛)固定组织，固定时间需超过12小时；脱水，依次经过十二缸溶液(50%乙醇、70 %乙醇、70 %乙醇、80 %乙醇、95 %乙醇、100%乙醇、100%乙醇、二甲苯、二甲苯、石腊、石腊、石腊,时间依次为15min、15min、15min、30min、30min、15min、lh、lh、lh、lh、30min，石蜡缸温度为62 °C );包埋，快速取脱水浸蜡的组织于预热的包埋机石蜡(62°C )中，用BM-1l型病理组织包埋机进行包埋；切片，用YD-1508轮转式切片机(购自益迪医疗设备有限公司)切片，厚度为6um ;摊片，YD-A型摊片机(购自益迪医疗设备有限公司)，45°C水中使组织摊平；烤片，YD-B型烤片机(购自益迪医疗设备有限公司)，40°C烤6h ;65°C烘箱烘2h，使蜡融化；脱蜡，二甲苯I脱蜡15min，二甲苯II脱蜡15min ;水化，依次经过四缸溶液(100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、70%乙醇，时间都为3min)，最后浸入水中5min ;抗体标记和染色，95°C柠檬酸钠(O. OlM柠檬酸钠)中抗原修复 15min，待其自然冷却后用 TBST(50Mm Tris, O. 9% NaCl, O.1 % Tween 20ρΗ7· 4)洗涤3次，8ug/ml单克隆抗体室温孵育2h，TBST洗涤3次，接着按照中杉金桥提供的免疫组化试剂盒(SP-9002)进行操作，最后苏木精染15s并用大量自来水冲洗反蓝；脱水透明，依次经过五缸溶液(80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、二甲苯、二甲苯，时间依次为lmin、lmin、lmin、15min、15min);中性树脂封片；显微镜下观察拍照。结果如图6所示，可以看出LunX只在肺癌组织中表达，浸润癌旁组织中的肿瘤细胞也呈LunX阳性。3.应用于免疫荧光检测淋巴结穿刺标本取五例肿瘤患者(获得患者的书面同意)阳性转移的锁骨下淋巴结穿刺标本，一例淋巴瘤，一例肝癌，三例非小细胞肺癌，检测其中LunX蛋白的表达情况。 免疫荧光流程涂片，抽出的淋巴结组织用少量PBS重悬并吹散，涂于防脱载玻片上，静止30min使细胞充分贴壁；固定，3. 7%甲醛固定min，PBS洗涤3次；穿膜，穿膜液(O. 05% Triton X-100)室温穿孔 10min，PBS 洗涤 3 次；封闭，1% BSA 阻断 30min，PBS 洗涤3次；8ug/ml单克隆抗体室温孵育lh，PBS洗涤3次；二抗驴抗鼠IgG-Alexa Four 488 (购自Invitrogen公司，货号A-21202) I 200稀释，室温孵育lh，PBS洗涤3次；DAPl (细胞核染色)按1: 10000稀释，室温孵育3min，PBS洗涤3次。结果如图7所示，结果表明LunX蛋白只在肺癌转移的阳性淋巴结中表达。应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由权利要求书所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。
权利要求
1.一种特异性抗人LunX蛋白的单克隆抗体,所述单克隆抗体特异性针对人LunX蛋白第103至256位的氨基酸序列。
2.一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CCTCC N0:C2012187，所述杂交瘤细胞株分泌权利要求I所述的单克隆抗体。
3.权利要求1所述的特异性抗人LunX蛋白的单克隆抗体在制备用于检测非小细胞肺癌患者的组织中的LunX蛋白的试剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其中所述非小细胞肺癌患者的组织选自肺组织或锁骨下淋巴结。
5.权利要求1所述的特异性抗人LunX蛋白的单克隆抗体在制备用于抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。
6.权利要求5所述的应用，其中所述肿瘤细胞为非小细胞肺癌。
7.权利要求1所述的特异性抗人LunX蛋白的单克隆抗体在制备用于抑制体内肿瘤生长和/或转移的药物中的应用。
8.权利要求7所述的应用，其中所述肿瘤为非小细胞肺癌。
9.一种用于检测非小细胞肺癌的诊断剂，所述诊断剂包含有效量的权利要求1所述的特异性抗人LunX的单克隆抗体。
10.一种用于抑制肿瘤细胞增殖和/或抑制肿瘤生长和/或转移的药物，所述药物包含治疗有效量的权利要求1所述的特异性抗人LunX的单克隆抗体。
全文摘要
本发明涉及一种抗人LunX蛋白的单克隆抗体，本发明还涉及生产该单克隆抗体的杂交瘤细胞株以及该单克隆抗体的应用。本发明的抗人LunX蛋白的单克隆抗体由杂交瘤细胞株LunX-mAb-S-35-8(保藏编号CCTCC NOC2012187)分泌。本发明的单克隆抗体可以用于免疫组化和免疫荧光检测肺癌标本中的LunX蛋白的表达，还可以用于体外抑制肿瘤细胞的增殖以及对体内肿瘤的治疗。
文档编号A61P35/00GK103012587SQ20121059039
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者魏海明, 郑小虎, 田志刚, 孙汭 申请人:中国科学技术大学