通过一步法制备类美登素抗体缀合物相关申请的交叉引用本专利申请要求2011年3月29日提交的美国临时专利申请号61/468,997和2011年3月29日提交的美国临时专利申请号61/468,981的权益，所述临时专利申请以引用的方式并入。发明背景适用于治疗癌症和其他疾病的抗体-药物缀合物（Antibody-Drug-Conjugate，ADC）通常由三种不同的要素构成：细胞结合剂；连接子；以及细胞毒性剂。使细胞结合剂（如抗体）结合于细胞毒性剂的常规方法采用两个不同的与抗体反应的步骤。在第一反应步骤（修饰步骤）中，使抗体与异双官能连接子反应，以产生经过连接子修饰的抗体。然后，任选地从过量连接子或经过水解的连接子试剂中纯化经过修饰的抗体产物。在第二反应步骤（结合步骤）中，使经过连接子修饰的抗体与含有反应性基团（如硫醇）的细胞毒性剂反应，以产生抗体-细胞毒性剂缀合物，在额外的纯化步骤中再次纯化这种缀合物。先前已经被描述为用来制造抗体-细胞毒性剂缀合物的方法是复杂的，因为这些方法受到进行起来较繁琐或产生相比最佳期望的来说纯度较低或稳定性较差的免疫缀合物的步骤的阻碍。因此，将需要修改或除去一个或多个制造步骤，同时改善产品质量，如纯度和/或稳定性。鉴于前述内容，本领域中需要开发制备细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的改进方法，所述缀合物实质上具有高纯度并且可以在避免繁琐步骤的情况下并通过降低使用者的时间和成本来制备。本发明提供了这种方法。本发明的这些和其他优势以及额外的本发明特征将从本文所提供的本发明描述中显而易见。发明概要本发明提供一种制备细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的方法，其包含以下步骤：使细胞结合剂与细胞毒性剂接触以形成包含细胞结合剂和细胞毒性剂的第一混合物，然后在pH值为约4到约9的溶液中使包含细胞结合剂和细胞毒性剂的第一混合物与包含连接子的双官能交联剂接触以提供包含以下的混合物：（i）细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物，其中细胞结合剂经连接子化学偶合于细胞毒性剂，（ii）游离细胞毒性剂，以及（iii）反应副产物。所述方法可以进一步包含纯化混合物以提供经过纯化的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的步骤。本发明的方法提供具有高纯度和/或高稳定性的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物。为了实现缀合物的高纯度和/或高稳定性，必需的是首先使细胞毒性剂与细胞结合剂接触以形成包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物，随后使混合物与双官能交联剂接触。本发明还包括一种细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物，其根据本文所描述的方法来制备。发明详述本发明提供一种制备细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的一步法。所述方法包括使细胞结合剂（例如，抗体）与细胞毒性剂接触以形成包含细胞结合剂和细胞毒性剂的第一混合物，然后在pH值为约4到约9的溶液中使包含细胞结合剂和细胞毒性剂的第一混合物与包含连接子的双官能交联剂接触以提供包含细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物、游离细胞毒性剂以及反应副产物的第二混合物，其中细胞结合剂经连接子化学偶合于细胞毒性剂。然后，对第二混合物进行纯化以提供经过纯化的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物。在一个实施方案中，接触通过以下方式实现：提供细胞结合剂，然后使细胞结合剂与细胞毒性剂接触以形成包含细胞结合剂和细胞毒性剂的第一混合物，然后使包含细胞结合剂和细胞毒性剂的第一混合物与双官能交联剂接触。举例来说，在一个实施方案中，在反应容器中提供细胞结合剂，将细胞毒性剂加入到反应容器中（从而接触细胞结合剂），然后将双官能交联剂加入到包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物中（从而接触包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物）。在一个实施方案中，在反应容器中提供细胞结合剂，并且在向容器中提供细胞结合剂之后立即将细胞毒性剂加入到反应容器中。在另一个实施方案中，在反应容器中提供细胞结合剂，并且在向容器中提供细胞结合剂之后的一段时间间隔（例如，在向空容器（space）中提供细胞结合剂之后约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约1天或更长时间）之后将细胞毒性剂加入到反应容器中。可以快速地（即，在短时间间隔内，如约5分钟、约10分钟）或缓慢地（如通过使用泵）加入细胞毒性剂。然后，可以在细胞结合剂与细胞毒性剂接触之后立即或在细胞结合剂与细胞毒性剂接触之后某个较后的时间点（例如，约5分钟到约8小时或更长时间）使包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物与双官能交联剂接触。举例来说，在一个实施方案中，在将细胞毒性剂加入到包含细胞结合剂的反应容器中之后立即将双官能交联剂加入到包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物中。或者，可以在细胞结合剂与细胞毒性剂接触之后约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时或更长时间使包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物与双官能交联剂接触。在另一个实施方案中，经过多个周期（例如1、2、3、4、5个或更多个周期）加入细胞毒性剂和双官能剂。举例来说，本发明提供一种方法，其包含以下步骤：a）使细胞结合剂与细胞毒性剂接触以形成包含细胞结合剂和细胞毒性剂的第一混合物；然后在pH值为约4到约9的溶液中使第一混合物与包含连接子的双官能交联剂接触以提供包含细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物、游离细胞毒性剂以及反应副产物的第二混合物，其中细胞结合剂经连接子化学偶合于细胞毒性剂；b）使第二混合物与细胞毒性剂接触以形成第三混合物；然后在约4到约9的pH值下使第三混合物与双官能交联剂接触以提供第四混合物；以及c）纯化第四混合物以提供经过纯化的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物。在一个实施方案中，步骤b）在步骤a）之后的一段时间间隔（例如，约1小时、约2小时、约3小时或更长时间）之后进行。在另一个实施方案中，在进行步骤c）之前，步骤b）可以重复若干次（例如1、2、3、4次或更多次）。额外的步骤b）可以在初始步骤b）之后的一段时间间隔（例如，约1小时、约2小时、约3小时或更长时间）之后进行。在另一个实施方案中，在细胞毒性剂的加入完成之前加入双官能交联剂。举例来说，在一个实施方案中，经过一段时间间隔（例如，经过约5分钟、约10分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时或更长时间）将细胞毒性剂连续加入到细胞结合剂中以形成包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物。在细胞毒性剂的加入完成之前，将双官能交联剂加入到包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物中，其条件为在任何时候，细胞毒性剂都在双官能交联剂的摩尔过量下。在一个实施方案中，经过一段时间间隔（例如，经过约5分钟、约10分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时或更长时间）连续加入双官能交联剂。在包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物与双官能交联剂接触之后，使反应进行约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时或更长时间（例如，约30小时、约35小时、约40小时、约45小时或约48小时）。细胞结合剂与细胞毒性剂接触、然后与双官能交联剂接触（即，反应步骤）在pH值为约4到约9（例如，约4、约4.5、约5、约5.5、约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5或约9）的溶液中发生。在一个实施方案中，反应步骤在pH值为约6或更低（例如，约4到约6、约4到约5.5或约4.5到约5.5）的溶液中发生。在另一个实施方案中，本发明方法包括在pH值为约6或更高（例如，约6到约9、约6到约7、约7到约9、约7到约8.5、约7.5到约8.5、约7.5到约8.0、约8.0到约9.0或约8.5到约9.0）的溶液中使细胞结合剂与细胞毒性剂接触、然后与双官能交联剂接触。举例来说，本发明方法包括在pH值为约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9或约9.0的溶液中使细胞结合剂与细胞毒性剂和双官能交联剂接触。在一个具体实施方案中，本发明方法包括在pH值为约7.8（例如，pH值为7.6到8.0或pH值为7.7到7.9）的溶液中使细胞结合剂与细胞毒性剂和双官能交联剂接触。本发明方法包括在本领域中已知的任何适合温度下进行一步反应（即，使细胞结合剂与细胞毒性剂接触、然后与双官能交联剂接触）。举例来说，一步反应可以在约20℃或更低温度（例如，约-10℃（其条件为例如通过存在用于溶解细胞毒性剂和双官能交联剂的有机溶剂而防止溶液冻结）到约20℃、约0℃到约18℃、约4℃到约16℃）下、在室温（例如，约20℃到约30℃或约20℃到约25℃）下，或在高温（例如，约30℃到约37℃）下进行。在一个实施方案中，细胞结合剂与细胞毒性剂和双官能交联剂接触在约16℃到约24℃（例如，约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃或约25℃）的温度下发生。在另一个实施方案中，细胞结合剂与细胞毒性剂接触、然后与双官能交联剂接触在约15℃或更低（例如，约-10℃到约15℃或约0℃到约15℃）的温度下发生。在这方面，本发明方法包括在约15℃、约14℃、约13℃、约12℃、约11℃、约10℃、约9℃、约8℃、约7℃、约6℃、约5℃、约4℃、约3℃、约2℃、约1℃、约0℃、约-1℃、约-2℃、约-3℃、约-4℃、约-5℃、约-6℃、约-7℃、约-8℃、约-9℃或约-10℃的温度下使细胞结合剂与细胞毒性剂接触、然后与双官能交联剂接触，其条件为（例如）通过存在用于溶解双官能交联剂的有机溶剂而防止溶液冻结。在一个实施方案中，本发明方法包括在约-10℃到约15℃、约0℃到约15℃、约0℃到约10℃、约0℃到约5℃、约5℃到约15℃、约10℃到约15℃或约5℃到约10℃的温度下使细胞结合剂与细胞毒性剂接触、然后与双官能交联剂接触。在另一个实施方案中，本发明方法包括在约10℃的温度（例如，8℃到12℃的温度或9℃到11℃的温度）下使细胞结合剂与细胞毒性剂接触、然后与双官能交联剂接触。在一个实施方案中，本发明方法包括在具有高pH值（例如，约7或更高）的溶液中于低温（例如，约15℃或更低温度）下使细胞结合剂与细胞毒性剂接触、然后与双官能交联剂接触。举例来说，在一个实施方案中，本发明方法包括在pH值为约7.5的溶液中于约15℃的温度下、在pH值为约7.8的溶液中于约10℃的温度下、在pH值为约8.2的溶液中于约0℃的温度下或在pH值为约8.5的溶液中于约0℃的温度下使细胞结合剂与细胞毒性剂接触、然后与双官能交联剂接触。在另一个实施方案中，本发明方法包括在pH值为7.0到8.5（例如，pH值为7.5到8.0）的溶液中于5℃到15℃的温度下使细胞结合剂与细胞毒性剂接触、然后与双官能交联剂接触。在一个实施方案中，本发明方法进一步包含猝灭步骤以猝灭任何未反应的细胞毒性剂和/或未反应的双官能交联剂。猝灭步骤在纯化细胞结合剂-细胞毒性剂之前进行。举例来说，本发明方法包括（a）使细胞结合剂与细胞毒性剂接触以形成包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物，然后在pH值为约4到约9的溶液中使包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物与包含连接子的双官能交联剂接触以提供包含以下的混合物：（i）细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物，其中细胞结合剂经连接子化学偶合于细胞毒性剂，（ii）游离细胞毒性剂，以及（iii）反应副产物；（b）猝灭步骤（a）中所制备的混合物以猝灭任何未反应的细胞毒性剂和/或未反应的双官能交联剂；以及（c）纯化混合物以提供经过纯化的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物。在一个实施方案中，通过使混合物与猝灭剂接触来猝灭混合物。如本文中所用的“猝灭剂”是指与游离细胞毒性剂和/或双官能交联剂反应的试剂。在一个实施方案中，马来酰亚胺或卤乙酰胺猝灭剂，如4-马来酰亚胺基丁酸、3-马来酰亚胺基丙酸、N-乙基马来酰亚胺、碘乙酰胺或碘乙酰胺基丙酸，可以用于确保细胞毒性剂中的任何未反应的基团（如硫醇）都被猝灭。猝灭步骤可以有助于防止细胞毒性剂，特别是具有未反应的硫醇基的细胞毒性剂（如DM1）发生二聚。经过二聚的细胞毒性剂可能难以去除。猝灭步骤也可以使得与天然抗体二硫基发生的任何不需要的硫醇-二硫基互换反应减到最小。用极性的、带电荷的硫醇猝灭剂（如4-马来酰亚胺基丁酸或3-马来酰亚胺基丙酸）猝灭后，过量未反应的细胞毒性剂被转化成极性的、带电荷的水溶液加合物，它可以在纯化步骤期间容易地与经过共价连接的缀合物分离。也可以使用非极性和中性的硫醇猝灭剂进行猝灭。在一个实施方案中，通过使混合物与猝灭剂接触来猝灭混合物，这种猝灭剂与未反应的双官能交联剂反应。举例来说，可以将亲核试剂加入到混合物中以猝灭任何未反应的双官能交联剂。亲核试剂优选地为含氨基的亲核试剂，如赖氨酸、氨基乙磺酸和羟胺。在一个优选实施方案中，使反应（即，细胞结合剂与细胞毒性剂接触、然后与双官能交联剂接触）进行到完成，随后使混合物与猝灭剂接触。就这一点而言，在包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物与双官能交联剂接触之后约1小时到约48小时（例如，约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时，或约25小时到约48小时）将猝灭剂加入到混合物中。本发明方法可以任选地包括将蔗糖加入到反应步骤（即，使细胞结合剂与细胞毒性剂和双官能交联剂接触）以增加细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的溶解度和回收率。理想地，蔗糖以约0.1%（重量/体积）到约20%（重量/体积）（例如，约0.1%（重量/体积）、1%（重量/体积）、5%（重量/体积）、10%（重量/体积）、15%（重量/体积）或20%（重量/体积））的浓度加入。优选地，蔗糖以约1%（重量/体积）到约10%（重量/体积）（例如，约0.5%（重量/体积）、约1%（重量/体积）、约1.5%（重量/体积）、约2%（重量/体积）、约3%（重量/体积）、约4%（重量/体积）、约5%（重量/体积）、约6%（重量/体积）、约7%（重量/体积）、约8%（重量/体积）、约9%（重量/体积）、约10%（重量/体积）或约11%（重量/体积））的浓度加入。另外，反应步骤还可以包含加入缓冲剂。可以使用本领域中已知的任何适合的缓冲剂。适合的缓冲剂包括（例如）柠檬酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂以及磷酸盐缓冲剂。在一个实施方案中，缓冲剂选自由以下组成的组：HEPPSO（N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-羟基丙烷磺酸)）、POPSO（脱水哌嗪-1,4-双(2-羟基-丙烷-磺酸)）、HEPES（4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸）、HEPPS（EPPS）（4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙烷磺酸）、TES（N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙烷磺酸）以及其组合。在反应步骤之后，对细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物进行纯化步骤。就这一点而言，可以使用切向流过滤（tangentialflowfiltration，TFF）（它是基于膜的切向流过滤工艺）、非吸附性色谱、吸附性色谱、吸附性过滤、选择性沉淀，或任何其他适合的纯化工艺，以及其组合来从混合物的其他组分（例如，游离细胞毒性剂和反应副产物）中纯化细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物。在本发明的一个实施方案中，使用单一纯化步骤（例如，TFF）纯化细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物。优选地，使用单一纯化步骤（例如，TFF）将缀合物纯化并交换到适当制剂中。在本发明的另一个实施方案中，使用两个依序纯化步骤来纯化细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物。举例来说，首先通过选择性沉淀、吸附性过滤、吸附性色谱或非吸附性色谱来纯化缀合物，之后用TFF纯化。本领域技术人员应了解，纯化细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物能够分离包含化学偶合于细胞毒性剂的细胞结合剂的稳定缀合物。任何适合的TFF系统都可以用于纯化，包括Pellicon型系统（Millipore,Billerica,MA）、SartoconCassette系统（SartoriusAG,Edgewood,NY）以及Centrasette型系统（PallCorp.,EastHills,NY）。任何适合的吸附性色谱树脂都可以用于纯化。优选的吸附性色谱树脂包括羟磷灰石色谱、疏水性电荷诱导色谱（hydrophobicchargeinductionchromatography，HCIC）、疏水性相互作用色谱（hydrophobicinteractionchromatography，HIC）、离子交换色谱、混合模式离子交换色谱、固定化金属亲和色谱（immobilizedmetalaffinitychromatography，IMAC）、染料配体色谱、亲和色谱、反相色谱以及其组合。适合的羟磷灰石树脂的实例包括陶瓷羟磷灰石（I型和II型CHT；Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)、HAUltrogel羟磷灰石（PallCorp.,EastHills,NY）以及陶瓷氟磷灰石（I型和II型CFT；Bio-RadLaboratories,Hercules,CA）。适合的HCIC树脂的一个实例为MEPHypercel树脂（PallCorp.,EastHills,NY）。适合的HIC树脂的实例包括丁基-琼脂糖、己基-琼脂糖、苯基-琼脂糖以及辛基琼脂糖树脂（全部来自GEHealthcare,Piscataway,NJ），以及Macro-prep甲基和Macro-Prep叔丁基树脂（BioradLaboratories,Hercules,CA）。适合的离子交换树脂的实例包括SP-琼脂糖、CM-琼脂糖以及Q-琼脂糖树脂（全部来自GEHealthcare,Piscataway,NJ），和UnosphereS树脂（Bio-RadLaboratories,Hercules,CA）。适合的混合模式离子交换剂的实例包括BakerbondABx树脂（JTBaker,PhillipsburgNJ）。适合的IMAC树脂的实例包括螯合琼脂糖树脂（GEHealthcare,Piscataway,NJ）和ProfinityIMAC树脂（Bio-RadLaboratories,Hercules,CA）。适合的染料配体树脂的实例包括蓝色琼脂糖树脂（GEHealthcare,Piscataway,NJ）和亲和蓝胶树脂（Bio-RadLaboratories,Hercules,CA）。适合的亲和树脂的实例包括蛋白质A琼脂糖树脂（例如MabSelect,GEHealthcare,Piscataway,NJ），其中细胞结合剂为抗体；和凝集素亲和树脂，例如扁豆凝集素琼脂糖树脂（GEHealthcare,Piscataway,NJ），其中细胞结合剂带有适当的凝集素结合位点。或者，可以使用对细胞结合剂具有特异性的抗体。这种抗体可以被固定于（例如）琼脂糖4快速流动树脂（GEHealthcare,Piscataway,NJ）。适合的反相树脂的实例包括C4、C8以及C18树脂（GraceVydac,Hesperia,CA）。任何适合的非吸附性色谱树脂都可以用于纯化。适合的非吸附性色谱树脂的实例包括（但不限于）SEPHADEXTMG-25、G-50、G-100、SEPHACRYLTM树脂（例如S-200和S-300）、SUPERDEXTM树脂（例如SUPERDEXTM75和SUPERDEXTM200）、树脂（例如P-6、P-10、P-30、P-60以及P-100），以及本领域技术人员已知的其他树脂。在一个实施方案中，本发明方法进一步包含保持步骤以从细胞结合剂中释放不稳定结合的连接子。保持步骤包含在纯化细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物之前（例如，在反应步骤之后、在反应步骤与猝灭步骤之间，或在猝灭步骤之后）保持混合物。举例来说，本发明方法包括（a）使细胞结合剂与细胞毒性剂接触以形成包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物；然后在pH值为约4到约9的溶液中使包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物与提供连接子的双官能交联剂接触以提供包含以下的混合物：（i）细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物，其中细胞结合剂经连接子化学偶合于细胞毒性剂，（ii）游离细胞毒性剂，以及（iii）反应副产物；（b）保持步骤（a）中所制备的混合物以从细胞结合剂中释放不稳定结合的连接子；以及（c）纯化混合物以提供经过纯化的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物。在另一个实施方案中，本发明方法包括（a）使细胞结合剂与细胞毒性剂接触以形成包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物；然后在pH值为约4到约9的溶液中使包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物与提供连接子的双官能交联剂接触以提供包含以下的混合物：（i）细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物，其中细胞结合剂经连接子化学偶合于细胞毒性剂，（ii）游离细胞毒性剂，以及（iii）反应副产物；（b）猝灭步骤（a）中所制备的混合物以猝灭任何未反应的细胞毒性剂和/或未反应的双官能交联剂；（c）保持步骤（b）中所制备的混合物以从细胞结合剂中释放不稳定结合的连接子；以及（d）纯化混合物以提供经过纯化的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物。或者，保持步骤可以在纯化细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物之后进行，之后进行额外的纯化步骤。在一个优选实施方案中，使反应（即，细胞结合剂与细胞毒性剂接触、然后与双官能交联剂接触）进行到完成，随后进行保持步骤。就这一点而言，可以在包含细胞结合剂和细胞毒性剂的混合物与双官能交联剂接触之后约1小时到约48小时（例如，约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时，或约24小时到约48小时）进行保持步骤。保持步骤包含将溶液在适合的温度（例如，约0℃到约37℃）下维持适合的时间段（例如，约1小时到约1周、约1小时到约24小时、约1小时到约8小时，或约1小时到约4小时）以从细胞结合剂中释放不稳定结合的连接子，而不会从细胞结合剂中实质上释放稳定结合的连接子。在一个实施方案中，保持步骤包含将溶液维持于约20℃或更低温度（例如，约0℃到约18℃、约4℃到约16℃）下、室温（例如，约20℃到约30℃或约20℃到约25℃）下或高温（例如，约30℃到约37℃）下。在一个实施方案中，保持步骤包含将溶液维持于约16℃到约24℃（例如，约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃或约25℃）的温度下。在另一个实施方案中，保持步骤包含将溶液维持于约2℃到约8℃（例如，约0℃、约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃或约10℃）的温度下。在另一个实施方案中，保持步骤包含将溶液维持于约37℃（例如，约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃或约40℃）的温度下。保持步骤的持续时间取决于进行保持步骤所处的温度和pH值。举例来说，保持步骤的持续时间可以实质上通过在高温下进行保持步骤而缩短，其中最高温度受细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的稳定性限制。保持步骤可以包含将溶液维持约1小时到约1天（例如，约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约22小时或约24小时）、约10小时到约24小时、约12小时到约24小时、约14小时到约24小时、约16小时到约24小时、约18小时到约24小时、约20小时到约24小时、约5小时到约1周、约20小时到约1周、约12小时到约1周（例如，约12小时、约16小时、约20小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天），或约1天到约1周。在一个实施方案中，保持步骤包含将溶液在约2℃到约8℃的温度下维持至少约12小时、至多1周的时段。在另一个实施方案中，保持步骤包含将溶液在约2℃到约8℃的温度下维持过夜（例如，约12到约24小时，优选地约20小时）。保持步骤的pH值优选地为约4到约10。在一个实施方案中，保持步骤的pH值为约4或更大，但小于约6（例如，4到5.9）；或者为约5或更大，但小于约6（例如，5到5.9）。在另一个实施方案中，保持步骤的pH值在约6到约10（例如，约6.5到约9、约6到约8）的范围内。举例来说，保持步骤的pH值可以为约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5或约10。在具体实施方案中，保持步骤可以包含在25℃下于约6-7.5的pH值下孵育混合物约12小时到约1周，在4℃下于约4.5-5.9的pH值下孵育混合物约5小时到约5天，或在25℃下于约4.5-5.9的pH值下孵育混合物约5小时到约1天。本发明提供一种制备包含化学偶合于细胞毒性剂的细胞结合剂的稳定缀合物的组合物的方法，其中所述组合物实质上不含不稳定的缀合物。在这方面，本发明提供一种制备实质上高纯度和高稳定性的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的方法。所述组合物由于缀合物的高纯度和高稳定性而可以用于治疗疾病。包含化学偶合于细胞毒性剂（如类美登素（maytansinoid））的细胞结合剂（如抗体）的组合物描述于（例如）美国专利7,374,762中，所述专利的全部教导内容以其全文引用的方式并入本文中。在本发明的一个方面，实质上高纯度的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物具有一个或多个下列特征：（a）大于约90%（例如，大于或等于约91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）、优选地大于约95%的缀合物种类为单体；（b）缀合物制剂中未结合的连接子的水平小于约10%（例如，小于或等于约9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或0%）（相对于总连接子）；（c）小于10%的缀合物种类经过交联（例如，小于或等于约9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或0%）；（d）缀合物制剂中的游离细胞毒性剂的水平小于约2%（例如，小于或等于约1.5%、1.4%、1.3%、1.2%、1.1%、1.0%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%或0%）（mol/mol，相对于总细胞毒性剂）；和/或（e）存储后（例如，约1周、约2周、约3周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约1年、约2年、约3年、约4年或约5年后）游离细胞毒性剂的水平没有实质性增加。游离细胞毒性剂水平的“实质性增加”意味着在一定存储时间（例如，1周、约2周、约3周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约1年、约2年、约3年、约4年或约5年）之后，游离细胞毒性剂水平的增幅小于约0.1%、约0.2%、约0.3%、约0.4%、约0.5%、约0.6%、约0.7%、约0.8%、约0.9%、约1.0%、约1.1%、约1.2%、约1.3%、约1.4%、约1.5%、约1.6%、约1.7%、约1.8%、约1.9%、约2.0%、约2.2%、约2.5%、约2.7%、约3.0%、约3.2%、约3.5%、约3.7%或约4.0%。如本文中所用的术语“未结合的连接子”是指与双官能交联剂共价连接的细胞结合剂，其中细胞结合剂并未经双官能交联剂的连接子共价偶合于细胞毒性剂（即，“未结合的连接子”可以由CBA-L表示，其中CBA表示细胞结合剂并且L表示双官能交联剂。相比之下，细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物可以由CBA-L-D表示，其中D表示细胞毒性剂）。在一个实施方案中，细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物中细胞毒性剂与细胞结合剂的平均摩尔比为约1到约10、约2到约7、约3到约5、约2.5到约4.5（例如，约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5）、约3.0到约4.0、约3.2到约4.2，或约4.5到5.5（例如，约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4或约5.5）。本发明提供一种制备包含化学偶合于细胞毒性剂的细胞结合剂的稳定缀合物的组合物的更有效方法。在一个实施方案中，与制备细胞结合剂和细胞毒性剂的缀合物的传统方法相比，达到缀合物的细胞毒性剂与细胞结合剂的相同平均摩尔比所需的细胞毒性剂的量较少。细胞结合剂可以是结合于细胞，通常并且优选地为动物细胞（例如人类细胞）的任何适合的试剂。细胞结合剂优选地为肽或多肽。适合的细胞结合剂包括（例如）抗体（例如，单克隆抗体和其片段）、干扰素（例如，α、β、γ）、淋巴因子（例如，IL-2、IL-3、IL-4、IL-6）、激素（例如，胰岛素、TRH（促甲状腺素释放激素，thyrotropinreleasinghormone）、MSH（黑素细胞刺激激素，melanocyte-stimulatinghormone）、类固醇激素（如雄激素和雌激素））、生长因子和集落刺激因子（如EGF、TGF-α、FGF、VEGF、G-CSF、M-CSF和GM-CSF（Burgess,ImmunologyToday5:155-158(1984)））、营养素转运分子（例如转铁蛋白）、维生素（例如叶酸），以及特异性地结合细胞表面上的靶分子的任何其他试剂或分子。在细胞结合剂为抗体的情况下，它结合于一种抗原，所述抗原为多肽或糖链（glycotope）并且可以是跨膜分子（例如受体）或配体，如生长因子。示范性的抗原包括分子，如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；...