一类新的抑制新生血管的多肽及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一类新的抑制新生血管的多肽及其应用。本发明还涉及所述多肽的制法和应用以及含所述多肽的药物组合物。本发明多肽具有多种优点，例如分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度等。
【专利说明】一类新的抑制新生血管的多肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及一类新的抑制新生血管的小肽，所述的小 肽是源于胎盘生长因子（Placenta Growth Factor,PlGF)的多肽。本发明还涉及所述多肽 的制法和应用以及含所述多肽的药物组合物。
【背景技术】
[0002] 新生血管的形成是一个极其复杂的过程，它包括：现存血管的扩张、血管通透性的 增加、血管周围基质的降解、内皮细胞的激活增殖、迁移以及新的毛细血管样管腔的形成。
[0003] 在眼部，约2/3的致盲性疾病均与病理性新生血管有关，例如：单纯疱疹性角膜 基质炎引起的角膜新生血管，年龄相关性黄斑变性中的脉络膜新生血管，以及糖尿病视网 膜病变或早产儿视网膜病变中的视网膜新生血管等。目前临床上，对于眼部病理性新生血 管常规运用激光光凝、光动力学疗法（Photodynamic therapy, F1DT)以及经瞳孔温热疗法 (Thermal transpupillary therapy, TTT)等进行治疗。然而，这些治疗手段不仅对局部组 织易造成破坏，其远期疗效也并不十分令人满意。因此，近年来人们不断尝试开发治疗眼部 病理性新生血管更有效的方法。
[0004] 在开发有效的血管新生抑制剂时，应充分考虑到眼科用药的特殊性。
[0005] 第一，眼部存在多个解剖性和功能性的屏障。全身给药常常由于血-房水屏障和 血-视网膜屏障而无法在眼组织局部达到足够的药物浓度；局部给药，如玻璃体腔注射，大 于76. 5kDa的大分子在理论上很难穿透视网膜作用于视网膜和脉络膜新生血管。对于眼表 给药，药物必须要先后穿透亲脂性的角膜上皮细胞紧密连接和亲水性的角膜基质，因此只 有具备适当脂溶性、低分子量或能与眼表组织内的转运体（如：氨基酸转运体、寡肽转运体 等）结合的药物才能到达前房发挥作用。
[0006] 第二，药物在亲水的泪液、房水、玻璃体液中溶解的程度与其有效性呈正相关。
[0007] 第三，基于上述主要原因，眼科用药的生物利用度很低；要使之提高，可加大给药 的浓度。用于治疗肿瘤新生血管的化合物毒副作用较为明显，全身和局部均无法高剂量给 药。此外，分子量较大的外源性蛋白质也是敏感的异物源，可对眼部组织（如：葡萄膜） 造成免疫损伤。
[0008] 第四，目前虽然已经有一系列相对安全的内源性血管新生抑制剂被先后证实，如 血管抑素（angiostatin)，它由纤溶酶原 Kringle 结构域 1-4(plasminogen Kringlel-4) 组成，可明显抑制血管依赖性肿瘤的生长，但由于其分子量较大且空间构象复杂，故在 制备过程中存在重组表达纯化工艺繁琐和内毒素残留等不足。正是由于上述种种条件 的限制，目前用于治疗眼部新生血管的药物十分有限，比如重组抗人VEGF单克隆抗体 bevacizumab (Avastin)、重组抗人 VEGF 单克隆抗体片段 ranibizumab (Lucentis)等，但它 们价格高昂，并且需反复经玻璃体腔给药，甚至可引起血管栓塞等风险。
[0009] 由此可见，寻找具有特异生物学活性和生物相容性的小分子抑制剂，经无创或微 创的给药途径透过各种眼组织屏障，提高眼局部的生物利用度，降低给药剂量，减少局部和 全身的副作用，对新生血管性眼病的临床防治具有十分重要的意义。因此，本领域迫切需要 开发一种适于眼球组织的有效安全的小分子新生血管抑制剂。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是提供一类适于眼球组织的有效安全的可抑制血管新生的小分子 多肽以及其片段、类似物和衍生物。
[0011] 本发明的另一目的是提供含所述多肽的制法和应用。
[0012] 在本发明的第一方面，提供了在本发明的第一方面，提供了一种下式I表示的多 肽，或其药学上可接受的盐
[0013] [XaaO]-[Xaal]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9] (I)
[0014] 式中，
[0015] XaaO是无，或1-3个氨基酸构成肽段；
[0016] Xaal是选自下组的氨基酸：Gly、Pro、或Ala ;
[0017] Xaa2是选自下组的氨基酸：Ala、Val、Leu、或Ile ;
[0018] Xaa3是选自下组的氨基酸：Ala、Val、Leu、或Ile ;
[0019] Xaa4是选自下组的氨基酸：Gly、Pro、或Ala ;
[0020] Xaa5是选自下组的氨基酸：Asp或Glu;
[0021] Xaa6是选自下组的氨基酸：Glu或Asp ;
[0022] Xaa7 是选自下组的氨基酸：Asn、Gln、His、Lys、或 Arg ;
[0023] Xaa8 是选自下组的氨基酸：Leu、Ile、Val、Met、Ala、*Phe;
[0024] Xaa9 是选自下组的氨基酸：His、Asn、Gln、Lys、或 Arg ;
[0025] XaalO是无，或1-3个氨基酸构成肽段；
[0026] 并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性。
[0027] 在另一优选例中，所述的多肽长度< 15个氨基酸，较佳地，< 12个，更佳地，< 11 个。
[0028] 在另一优选例中，所述的多肽是由SEQ ID NO. :1所示的多肽经过1-3个较佳地 1-2个，更佳地1个氨基酸取代；和/或
[0029] 经过1-2个氨基酸缺失；和/或
[0030] 所述多肽的两端分别经过1-7,较佳地1-6个或1-5个，更佳地1-4个，最佳地1-3 或1-2个氨基酸的添加形成的。
[0031] 在另一优选例中，所述的多肽长度> 7个氨基酸，较佳地，> 8个，更佳地，> 9个。
[0032] 在另一优选例中，所述的多肽为：
[0033] XaaO 是无；
[0034] Xaal是选自下组的氨基酸：Gly或Ala ;
[0035] Xaa2是选自下组的氨基酸：Ala或Val ;
[0036] Xaa3是选自下组的氨基酸：Ala或Val ;
[0037] Xaa4是选自下组的氨基酸：Gly或Ala ;
[0038] Xaa5是选自下组的氨基酸：Asp或Glu;
[0039] Xaa6是选自下组的氨基酸：Glu或Asp ;
[0040] Xaa7是选自下组的氨基酸：Asn或Gln;
[0041] Xaa8是选自下组的氨基酸：Leu或Ile ;
[0042] Xaa9是选自下组的氨基酸：His或Arg ;
[0043] XaalO 是无；
[0044] 并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性，且所述的多肽是由SEQ ID NO. : 1所 示多肽经过1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个氨基酸取代；和/或
[0045] 经过1-2个氨基酸缺失形成的。
[0046] 在另一优选例中，所述的XaaO是1?3个氨基酸构成的肽段。
[0047] 在另一优选例中，所述的XaalO是1?3个氨基酸构成的肽段。
[0048] 在另一优选例中，所述多肽选自下组：
[0049] (a)具有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的多肽；
[0050] (b)将SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列经过1-5个（较佳地1-3,更佳地1-2个）氨 基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制血管新生功能的由（a)衍生的多肽。
[0051] 在另一优选例中，所述的多肽是由SEQ ID NO. :1所示的多肽经过1-3个较佳地 1-2个，更佳地1个氨基酸取代、缺失；和/或
[0052] 经过1-5,较佳地1-4个，更佳地1-3个，最佳地1-2个氨基酸的添加形成的。
[0053] 在另一优选例中，所述的衍生多肽保留了 > 70%的SEQ ID NO: 1的所示多肽的抑 制血管新生活性。
[0054] 在另一优选例中，所述的衍生多肽与SEQ ID NO: 1的相同性彡80%，较佳地彡90% ; 更佳地> 95%。
[0055] 本发明还提供了抑制血管新生功能的、式I化合物的二聚体和多聚体形式。
[0056] 在本发明的第二方面，提供了一种分离的核酸分子，它编码本发明上述的多肽。
[0057] 在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，它含有：
[0058] (a)本发明上述的多肽或其药学上可接受的盐；和
[0059] (b)药学上可接受的载体或赋形剂。
[0060] 在另一优选例中，所述组合物的剂型为眼药水、针剂（如眼周和眼内注射液，尤其 是玻璃体腔内注射）、眼用凝胶或眼药膏。
[0061] 在另一优选例中，所述的组合物为缓释剂型。
[0062] 在本发明的第四方面，提供了一种本发明所述多肽或药学上可接受的盐的用途， 它们被用于制备抑制血管新生或防治与血管新生相关疾病的药物。
[0063] 在另一优选例中，所述的对象是人。
[0064] 在另一优选例中，所述的血管新生是与新生血管性眼病相关的血管新生。
[0065] 在另一优选例中，所述的与血管新生相关疾病的选自下组：新生血管性眼病、肿 瘤、缺血性心脏病、非炎症性心肌病、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化、动脉栓塞、动脉血栓、 Berger's病、慢性炎症、炎症性肠病、溃疡、风湿性关节炎、硬皮症、银屑病、不育症或肉瘤状 病等。
[0066] 在另一优选例中，所述的肿瘤为恶性实体肿瘤。
[0067] 在另一优选例中，所述的新生血管性眼病包括累及脉络膜、视网膜、角膜或虹膜， 包括老年性黄斑变性、增生性糖尿病视网膜病变、视网膜血管阻断性疾病、早产儿视网膜病 变、角膜感染、新生血管性青光眼等。
[0068] 在本发明的第五方面，提供了一种抑制哺乳动物血管新生的方法，包括步骤：给需 要的对象施用本发明所述的多肽或其药学上可接受的盐。
[0069] 在另一优选例中，所述的施用包括眼表施用或玻璃体腔内注射施用
[0070] 在另一优选例中，所述的对象是人。
[0071] 在另一优选例中，所述的血管新生是与新生血管性眼病相关的血管新生。
[0072] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0073] 下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的 本发明范围。
[0074] 图1显示了小肽CP912的高效液相色谱及质谱分析的纯度鉴定，其中，图IA为 CP912色谱图，图IB为CP-912 -级质谱图，图IC为CP-912二级质谱图。
[0075] 图2显示了小肽CP912对人脐静脉内皮细胞HUVECs增殖的影响。相对于VEGF组， VEGF+小肽CP912具有明显抑制HUVECs增殖的作用，#P〈0. 01，差异具有统计学意义。
[0076] 图3显示小肽CP912对鸡胚尿囊膜上新生血管的影响：小肽CP912明显具有抑制 新生血管的效应。
[0077] 图3a_3c显示滤纸片周2. 5mm范围内3-5级微血管计数。
[0078] 图 3a 为 PBS 组；图 3b 为 Avasin (50 μ 1/ 片）组；图 3c 为 CP912 (50 μ 1/ 片）组； 图3d为相对于PBS组，各个浓度的小肽CP912组均明显抑制鸡胚尿囊膜新生血管数，且抑 制作用呈浓度依赖性，**Ρ〈〇. 01，差异具有统计学意义。
[0079] 图4显示小肽CP912对大鼠角膜病理性新生血管的影响，可见小肽CP912明显具 有抑制新生血管的效应。
[0080] 图4显示大鼠角膜新生血管面积。相对于PBS组，小肽CP912组在术后第3、5、7 天具有明显抑制大鼠角膜病理性新生血管作用，*Ρ〈〇. 05, #Ρ〈0. 01，差异具有统计学意义。
【具体实施方式】
[0081] 本发明人经过广泛而深入的研究，首次制备了一类源自胎盘生长因子的、具有抑 制血管新生功能的，分子量小于5kD(如仅约l-2kD)的小分子多肽。具体而言，本发明人应 用生物信息学的方法，基于同源性分析和生物学特性等分析，设计了数个候选序列，采用固 相法将其合成，分离纯化获得高纯度的小肽CP912,并运用HPLC及MS对之进行鉴定，再经 VEGF诱导的人脐静脉内皮细胞增殖模型、鸡胚尿囊膜血管模型，以及大鼠角膜缝线模型筛 选，获得了一类新型的、具有预防和治疗血管新生功能的小分子多肽。
[0082] 本发明的小肽的分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房 水和玻璃体液中保持较高的浓度；安全性高，对生物组织毒副作用小；眼局部用药生物利 用度高，可减少剂量，从而减小全身副作用。在此基础上完成了本发明。
[0083] 胎盘生长因子
[0084] 胎盘生长因子（Placenta Growth Factor, PlGF)是VEGF家族中的一员，最早于 1991年由Maglione等人从人体胎盘cDNA文库中分离纯化而来。除了人体胎盘外，在心、 肺、甲状腺、骨骼肌中也可检测到PlGF的存在。根据PlGF基因的选择性拼接，可以产生4种 不同的异构体：P1GF-1 (P1GF131)，P1GF-2 (P1GF152)，P1GF-3 (P1GF203)，P1GF-4 (P1GF224)， 它们大小不同，相对分子量为55-60KDa)，分泌特性和受体亲和力也不一样。两个PlGF单体 通过形成分泌性同源二聚体糖蛋白，再和其受体结合，从而介导之后的信号转导，发挥生物 学效应。此外，PlGF还能和VEGF结合形成异源二聚体，影响VEGF的信号转导通路。PlGF 能促进血管内皮细胞尤其是微血管内皮细胞增殖，并可作为内皮细胞生长因子的趋化因子 来调节内皮细胞的生长，刺激血管生成。PlGF还能促进单核细胞和内皮细胞的迁移，增加内 皮细胞的通透性。尽管VEGF也能诱导新生血管形成，可由PlGF诱导产生的新生血管具有 正常的生理特性而无其他异常改变，这些新生血管不会发生如VEGF诱导产生的新生血管 所致的水肿、血管瘤、通透性增加等现象。
[0085] 活性多肽
[0086] 在本发明中，术语"本发明多肽"、"CP912多肽"、"CP912小肽"、"短肽CP912"或"肽 CP912"可互换使用，都指具有血管新生抑制活性的肽CP912氨基酸序列（GMGDENLH，如SEQ ID NO: 1所示）的蛋白或多肽。此外,所述术语还包括具有抑制血管新生功能的、SEQ ID NO: 1序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：1-3个（通常为1-2个，更佳地1个） 氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个（通常为 3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内）氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或 相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加 或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体 和多聚体形式本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽（如环肽）。
[0087] 本发明还包括CP912多肽的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语"片 段"、"衍生物"和"类似物"是指基本上保持抑制血管新生功能或活性的多肽。本发明的多 肽片段、衍生物或类似物可以是（i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基（优选保守 性氨基酸残基）被取代的多肽，或（ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽， 或（iii)CP912多肽与另一个化合物（比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇）融合 所形成的多肽，或（iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽（与前导序列、 分泌序列或6His等标签序列融合而形成的然后蛋白）。根据本文的教导，这些片段、衍生物 和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
[0088] 一类优选的活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2 个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变 异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
[0089] 表 1
[0090]
【权利要求】
1. 一种下式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐 [XaaO]-[Xaal]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[Xa alO] (I) 式中， XaaO是无，或1-3个氨基酸构成肽段； Xaal是选自下组的氨基酸：Gly、Pro、或Ala ; Xaa2是选自下组的氨基酸：Ala、Val、Leu、或lie ; Xaa3是选自下组的氨基酸：Ala、Val、Leu、或lie ; Xaa4是选自下组的氨基酸：Gly、Pro、或Ala ; Xaa5是选自下组的氨基酸：Asp或Glu ; Xaa6是选自下组的氨基酸：Glu或Asp ; 父&&7是选自下组的氨基酸48]1、6111、1118、1^8、或六找； Xaa8是选自下组的氨基酸：Leu、lie、Val、Met、Ala、或Phe ; 父&&9是选自下组的氨基酸：把8、4811、6111、1^8、或六找； XaalO是无，或1-3个氨基酸构成肽段； 并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性。
2. 如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的多肽是由SEQ ID NO. :1所示的多肽 经过1-3个氨基酸取代；和/或 经过1-2个氨基酸缺失；和/或 所述多肽的两端分别经过1-7个氨基酸的添加形成的。
3. 如权利要求1所述的多肽，其特征在于，XaaO是1?3个氨基酸构成的肽段；和/或 XaalO是1?3个氨基酸构成的肽段。
4. 如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽选自下组： (a) 具有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的多肽，且所述多肽的长度为9-15个氨基酸； (b) 将SEQ ID N0:1所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成 的，且具有抑制血管新生功能的衍生多肽。
5. -种分离的核酸分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的多肽。
6. -种药物组合物，其特征在于，它含有： (a) 权利要求1所述多肽或其药学上可接受的盐；和 (b) 药学上可接受的载体或赋形剂。
7. 如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为针剂、眼药水、 眼用凝胶或眼药膏。
8. 如权利要求1所述的多肽或药学上可接受的盐的用途，其特征在于，用于制备抑制 血管新生或防治与血管新生相关疾病的药物。
9. 如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的与血管新生相关疾病的选自下组：新 生血管性眼病、肿瘤、缺血性心脏病、非炎症性心肌病、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化、动 脉栓塞、动脉血栓、Berger's病、慢性炎症、炎症性肠病、溃疡、风湿性关节炎、硬皮症、银屑 病、不育症和肉瘤状病。
10. -种抑制哺乳动物血管新生的方法，其特征在于，包括步骤：给需要的对象施用权 利要求1所述的多肽或其药学上可接受的盐，且所述的施用包括眼表施用或玻璃体腔内注 射施用。
【文档编号】A61P9/10GK104341486SQ201310323014
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年7月29日 优先权日:2013年7月29日
【发明者】许迅, 柯潇, 郑颖, 罗德伦, 邬智刚 申请人:上海市第一人民医院, 成都康弘药业集团股份有限公司