登革病毒疫苗组分的开发的制作方法
【专利摘要】本发明涉及在3'非翻译区（3'-UTR）中包含突变的登革病毒或嵌合登革病毒，其中所述突变包括除去登革病毒血清型1、2、3和4的每一种中TL-2同源结构的Δ30突变和除所述Δ30突变外从3'-UTR中缺失核苷酸，所述缺失以5'方向除去序列最远至登革病毒血清型1、2、3和4的每一种中TL-3同源结构的5'边界；或用登革病毒第二血清型的3'-UTR，其任选地含有Δ30突变和除所述Δ30突变外从3'-UTR中缺失核苷酸，对登革病毒第一血清型的3'-UTR的替换；并且涉及免疫原性组合物、诱导免疫应答的方法和产生登革病毒或嵌合登革病毒的方法。
【专利说明】登革病毒疫苗组分的开发
[0001]本申请是原申请的申请日为2007年8月15日、申请号为200780034189.4、发明名称为《登革病毒疫苗组分的开发》的中国专利申请的分案申请。
[0002]相关申请
[0003]本申请要求保护2006年8月15日提交的美国临时申请号60/837，723的优先权，该申请的公开内容通过引用此处完整并入本文中。
【技术领域】[0004]本发明涉及在登革病毒血清型1、2、3和4的基因组3’非翻译区中的突变，所述突变用在减弱登革病毒疫苗的生长特征中。
[0005]相关技术的描述
[0006]存在登革病毒的四种血清型(登革病毒I型[DEN1]、DEN2、DEN3和DEN4)，它们每年造成估计五千万至一亿例登革热和500，000例登革病毒感染的更严重形式，公知即登革出血热/登革休克综合征(Gubler, D.J.和M.Meltzerl999病毒学研究进展(Adv Virus Res)53:35-70)。登革病毒广泛分布于世界热带和亚热带地区并且登革病毒感染病例数因登革病毒的蚊媒介-埃及伊蚊(Aedes aegypti)分布范围扩大而持续增加。尽管作为一种再发疾病，登革病具有重要意义，然而没有疫苗可用于其控制。免疫接种的目的是通过诱导针对全部四种血清型的长效中和抗体应答而保护免遭登革病毒病影响。需要针对全部四种血清型的同时保护作用，因为疾病严重性增加可能在具有针对异型登革病毒的预存抗体的人中出现。这种免疫接种可以用减毒活病毒疫苗经济地实现。
[0007]登革病毒是属于黄病毒属的正义RNA病毒。大约11，000碱基的该病毒基因组含有编码一种多聚蛋白的单个可读框，其中所述的多聚蛋白由病毒源和细胞源蛋白酶加工成3种结构蛋白(C、prM和E)和至少7种非结构蛋白(NS)蛋白。登革病毒基因组的两个末端含有非翻译区(UTR)并且完整的基因组构造是5’ UTR-C-prM-E-NSl-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-UTR-3’。3’UTR的长度接近400碱基并且预测其含有在登革病毒血清型中保守的几个茎环结构(Brinton，M.A.等.1986 病毒学(Virology) 153:113-121，Hahn, C S.等.1987分子生物学杂志(J Mol Biol )198:33-41, Proutski, V.等.1997 核酸研究(Nucleic AcidsRes) 25:1194-1202, Rauscher, S.等.1997RNA3:779-791，Shurtleff, A.等.2001 病毒学(Virology)281:75-87)。通过从DEN4基因组中缺失30个核苷酸(3’核苷酸第172至143位)而事先除去在所提出的3’ UTR 二级结构中确定为TL-2(Proutski，V.等.1997核酸研究(Nucleic Acids Res) 25:1194-51202)的一个这种茎环结构(Men, R.等.1996 病毒学杂志(J Virol)70:3930-3937)并且此茎环结构随后命名为Λ 30突变(Durbin, A.P.等.2001美国热带医学与卫生学杂志(Am J Trop Med Hy)65:405-413)。与含有完整TL-2序列的亲代病毒相比，所得的病毒rDEN4 Δ 30证实在称猴(rhesus monkey)中弱化并且它在人类中弱化(Durbin, A.P.等.2001 美国热带医学与卫生学杂志(Am J Trop Med Hy) 65:405-413)。
【发明内容】
[0008]本发明涉及在3’非翻译区(3’_UTR)中包含突变的登革病毒或嵌合登革病毒，其中所述突变选自由以下所组成的组中:
[0009](a)除去登革病毒血清型1、2、3和4的每一种中TL_2同源结构的Δ 30突变和除所述Λ 30突变外从3’-UTR中缺失核苷酸，所述缺失以5’方向除去序列最远至登革病毒血清型1、2、3和4的每一种中TL-3同源结构的5’边界；和
[0010](b)用登革病毒第二血清型的3’ -UTR，其任选地含有Λ 30突变和除所述Λ 30突变外从3’ -UTR中缺失核苷酸，对登革病毒第一血清型的3’ -UTR的替换；
[0011]并且涉及免疫原性组合物、诱导免疫应答的方法和制备登革病毒或嵌合登革病毒的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1.弱化登革病毒的两种方法。A) (a-c)从(DEN3野生型斯莱曼/78 (DEN3wtS leman/78), SEQ ID NO:1) 3’ -UTR中缺失额外的核苷酸。B)用登革病毒第二血清型的3’ -UTR替换登革病毒第一血清型的3’ -UTR。
[0013]图2-5.每种DEN血清型3’_UTR的TL_1、TL_2和TL-3区的预测二级结构。显示用于构建每种二级结构模型的序列的基因库(GenBank)登录号。仅分别使用DEN1、DEN2、DEN3和DEN4的包 含TL_1、TL_2和TL-3的最末278、281、276和281个核苷酸，以避免所述结构的环化以及已知并经实验验证的结构元件随后错误折叠。显示了对每个结构模型特异的mfold(根据最小自由能预测RNA 二级结构折叠的软件)程序约束条件(contraints)。圈定并编号划定主要缺失边界的核苷酸，核苷酸编号始于3’基因组末端(反向编号系统)。图2-SEQ ID N0:2 ;图 3-SEQ ID N0:3 ;图 4-SEQ ID N0:4 ;图 5-SEQ ID NO:5。
[0014]图6-9.对登革病毒血清型DEN1、DEN2、DEN3和DEN4的每一种所绘制的Λ 30缺失突变。所述Λ 30突变缺失采用反向编号系统标明的DENl的第174-145位核苷酸、DEN2的第173-144位核苷酸、DEN3的第173-143位核苷酸和DEN4的第172-143位核苷酸。缺失的区域由符号 Λ 标出。图 6-SEQ ID Ν0:6;图 7-SEQ ID N0:7;图8-SEQ ID Ν0:8;图 9-SEQID Ν0:9。
[0015]图10-13.对登革病毒血清型DEN1、DEN2、DEN3和DEN4的每一种所绘制的Λ 30/31缺失突变。除了缺失包括△ 30突变的核苷酸之外，所述△ 31突变缺失采用反向编号系统标明的DEN1、DEN2、DEN3和DEN4的第258-228位核苷酸。缺失的区域由符号Λ标出。图10-SEQ ID NO: 10 ;图1l-SEQ ID NO: 11 ;图 12-SEQ ID NO: 12 ;图 13-SEQ ID NO: 13。
[0016]图14-17.对登革病毒血清型DEN1、DEN2、DEN3和DEN4的每一种所绘制的Λ 86缺失突变。所述Λ 86突变缺失采用反向编号系统标明的DENl的第228-145位核苷酸、DEN2的第228-144位核苷酸、DEN3的第228-143位核苷酸和DEN4的第228-143位核苷酸。缺失的区域由符号 Λ 标出。图 14-SEQ ID NO: 14;图 15-SEQ ID NO: 15;图 16-SEQ ID NO: 16 ；图 17-SEQ ID NO:17。
[0017]图18.rDEN3 与 rDEN4 或 rDEN4 Δ 303’ -UTR 的嵌合化。A)重组 3’ -UTR 嵌合登革病毒通过用得自rDEN4或rDEN4 Δ 30的区域替换rDEN3的3’_UTR加以构建。Λ 30突变在3’ -UTR中的相对位置由箭头标出。将rDEN3和rDEN4的开放读码框(ORF)与UTR之间的接头分别标记为接头I和接头2。也对所得嵌合病毒标出型间接头3。B)显示接头区的核苷酸和氨基酸序列。对于接头3,以小写体(lower case)显示用来导入单一 HpaI限制酶识别位点的核苷酸置换。接头1-SEQ ID NO: 18 (核苷酸)和19 (氨基酸);接头2-SEQ ID NO:20(核苷酸)和21 (氨基酸)；接头3-SEQ ID NO:22 (核苷酸)和23 (氨基酸)。
[0018]图19.在Vero细胞和C6/36细胞中的复制。比较四种突变病毒与野生型rDEN3在VeiO细胞和C6/36细胞中的复制。75cm2培养瓶的汇合细胞以感染复数0.01进行感染。每日从培养瓶中取出0.5ml等分试样，持续7日。在添加SPG至IX浓度后，样品在干冰上冻结并贮存在_80°C。在Veix)细胞上通过蚀斑测定法对全部样品测定病毒滴度。检测限是1.01og10PFU/ml (蚀斑形成单位/毫升)。
【具体实施方式】
[0019]定义
[0020]除非另外定义，本文中所用技术及科学术语具有如本发明所述领域的普通技术人员通常所理解的相同意思。参见例如，Singleton P和Sainsbury D.，微生物学与分子生物学词典(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)第三版.，J.Wiley&Sons,奇切斯特(Chichester)，纽约(New York)，2001 和费氏病毒学(Fields Virology)第四版，Knipe D.M.和Howley P.M编辑，Lippincott ffilliams&ffilkins,费城(Philadelphia)2001。
[0021]术语“约”意指在1、2或3个核苷酸范围内。
[0022]突变登革病毒和嵌合登革病毒
[0023]本发明的目的是开发可以配制成安全、有效和经济的四价登革疫苗的一组型特异性活的减毒登革疫苗组分。所述Λ 30突变在猕猴中弱化DEN4 (Men, R.等.1996病毒学杂志(J Virol) 70:3930-3937)。Λ 30突变除去登革病毒血清型1、2、3和4的每一种中的同源结构(TL-2)(图2-5)。然而发现Λ 30突变在猕猴中不弱化DEN3。
[0024]本发明的实施方式提供具有一个或多个造成减毒作用的突变的登革病毒和嵌合登革病毒、产生此类登革病毒的方法和使用这些登革病毒以预防或治疗登革病毒感染的方法。在本发明登革病毒中的突变(或诸突变)存在于由病毒RNA的最下游大约384个核苷酸形成的3’非翻译区(3’-UTR)中，已经证明所述的3’非翻译区在决定减毒中发挥作用。如下文进一步描述本发明的病毒和方法。
[0025]可以用在本发明中的一个登革病毒实例是血清型3，斯莱曼/78 (Sleman/78)毒株。本发明对登革病毒分类群全部成员的适用性通过这样的观察结果进行推断，即，其它登革病毒毒株的属性与任何一个登革病毒毒株的属性相似。登革病毒已经划分为四个血清型(DEN1、DEN2、DEN3和DEN4)。已经在四个血清型的每一种中鉴定到众多毒株。在表A中提供基因库(GenBank)登录号的多个登革病毒毒株的完整基因组序列。
[0026]表A.登革病毒毒株的实例
【权利要求】
1.一种核酸，其编码在3’非翻译区中包含突变的登革病毒或嵌合登革病毒，所述的突变选自以下所组成的组中:Ca)除去登革病毒血清型1、2、3和4的每一种中TL-2同源结构的Λ 30突变和除所述Λ30突变外从3’非翻译区中缺失核苷酸，所述缺失以5’方向除去序列最远至登革病毒血清型1、2、3和4的每一种中TL-3同源结构的5’边界；和(b)用登革病毒第二血清型的3’非翻译区，其任选地含有Λ 30突变和除所述Λ 30突变外从3’非翻译区中缺失核苷酸，对登革病毒第一血清型的3’非翻译区进行替换。
2.根据权利要求1所述的编码登革病毒或嵌合登革病毒的核酸，其中，所述的突变是(a)。
3.根据权利要求2所述的编码登革病毒或嵌合登革病毒的核酸，其中，所述的突变除去TL-2同源结构，并且以与所述Λ 30突变连续的连续方式除去至多到和包含TL-3同源结构的序列。
4.根据权利要求3所述的编码登革病毒或嵌合登革病毒的核酸，其中，所述的突变是Δ 86突变，从而所述的Λ 86突变缺失采用反向编号系统标明的DENl的228至145位核苷酸、DEN2的228至144位核苷酸、DEN3的228至143位核苷酸和DEN4的228至143位核苷酸。
5.根据权利要求4所述的编码登革病毒或嵌合登革病毒的核酸，其中，所述的血清型是DEN3。
6.根据权利要求2所述的编码登革病毒或嵌合登革病毒的核酸，其中，所述的突变以与所述Λ 30突变不连续的非连续方式除去TL-2同源结构和TL-3同源结构二者。
7.根据权利要求6所述的编码登革病毒或嵌合登革病毒的核酸，其中，所述的突变是Δ 30/31突变，从而所述的Λ 30突变缺失采用反向编号系统标明的DENl的174至145位核苷酸、DEN2的173至144位核苷酸、DEN3的173至143位核苷酸和DEN4的172至143位核苷酸，并且所述的Λ 31突变缺失采用反向编号系统标明的DENl的258至228位核苷酸、DEN2的258至228位核苷酸、DEN3的258至228位核苷酸和DEN4的258至228位核苷酸。
8.根据权利要求7所述的编码登革病毒或嵌合登革病毒的核酸，其中，所述的血清型是DEN3。
9.根据权利要求1所述的编码登革病毒或嵌合登革病毒的核酸，其中，所述的突变是(b)。
10.根据权利要求9所述的编码登革病毒或嵌合登革病毒的核酸，其中，DENl的3’非翻译区替换为登革病毒血清型2、3或4的3’非翻译区，DEN2的3’非翻译区替换为登革病毒血清型1、3或4的3’非翻译区，DEN3的3’非翻译区替换为登革病毒血清型1、2或4的3’非翻译区或者DEN4的3’非翻译区替换为登革病毒血清型1、2或3的3’非翻译区。
11.根据权利要求10所述的编码登革病毒或嵌合登革病毒的核酸，其还包含所述Λ30突变。
12.根据权利要求10所述的编码登革病毒或嵌合登革病毒的核酸，其还包含所述Λ30突变和除所述Λ30突变外从3’非翻译区中缺失核苷酸。
13.根据权利要求9所述的编码登革病毒或嵌合登革病毒的核酸，其中，DEN3的3’非翻译区替换为登革病毒血清型1、2或4的3’非翻译区。
14.根据权利要求13所述的编码登革病毒或嵌合登革病毒的核酸，其还包含所述Λ30突变。
15.根据权利要求13所述的编码登革病毒或嵌合登革病毒的核酸，其还包含所述Λ30突变和除所述Λ30突变外从3’非翻译区中缺失核苷酸。
16.根据权利要求9所述的编码登革病毒或嵌合登革病毒的核酸，其选自以下所组成的组中:
17.—种免疫原性组合物,其包含权利要求1-16中任一项所述的编码登革病毒或嵌合登革病毒的核酸或包含所述核酸的登革病毒或嵌合登革病毒。
18.根据权利要求17所述的免疫原性组合物，其对于登革血清型1、2、3和4是四价的。
19.一种在患者中诱导针对登革病毒的免疫应答的方法，其包括向患者给药权利要求.17所述的免疫原性组合物以诱导针对登革病毒的免疫应答。
20.—种产生编码登革病毒或嵌合登革病毒的核酸的方法,其包括导入突变至3’非翻译区，所述的突变选自以下所组成的组中:Ca)除去登革病毒血清型1、2、3和4的每一种中TL-2同源结构的Λ 30突变和除所述Δ30突变外从3’非翻译区中缺失核苷酸，所述缺失以5’方向除去序列最远至登革病毒血清型1、2、3和4的每一种中TL-3同源结构的5’边界；和(b)用登革病毒第二血清型的3’非翻译区，其任选地含有Λ 30突变和除所述Λ 30突变外从3’非翻译区中缺失核苷酸，对登革病毒第一血清型的3’非翻译区进行替换。
21.—种登革病毒或嵌合登革病毒,其包含权利要求1-16中任一项所述的编码登革病毒或嵌合登革病毒的核酸。
22.权利要求1-16中任一项所述的核酸在制备用于在患者中诱导免疫应答目的的药物中的用途。
23.权利要求1-16中任一项所述的核酸在患者中诱导免疫应答的用途。
24.权利要求17或18中任一项所述的免疫原性组合物在制备用于在患者中诱导免疫应答目的的药物中的用途。
25.权利要求17或18中任一项所述的免疫原性组合物在患者中诱导免疫应答的用途。
【文档编号】A61K48/00GK103602689SQ201310349675
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2007年8月15日 优先权日:2006年8月15日
【发明者】斯蒂芬·S.·怀特黑德, 约瑟夫·E.·布莱尼, 布赖恩·R.·墨菲 申请人:美国国有健康与人类服务部(马里兰州)