亲吻肽拮抗剂及其用途

亲吻肽拮抗剂及其用途
【专利摘要】本发明涉及亲吻肽拮抗剂在制备用于治疗个体中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症的药物中的用途。本发明还提供了某些定义的肽分子，其可以作为亲吻肽拮抗剂，用于治疗个体中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症。此外，本发明提供鉴定和/或使用亲吻肽拮抗剂和/或所述定义的肽及其药物组合物的方法。
【专利说明】亲吻肽拮抗剂及其用途
[0001]本申请为申请号为200880116666.6，申请日为2008年10月8日，发明名称为“亲吻肽拮抗剂及其用途”的分案申请。
[0002]本发明涉及亲吻肽(kisspeptin)拮抗剂及其在用于治疗个体中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症中的用途。此外，本发明还涉及用于鉴定亲吻肽拮抗剂的方法。
[0003]RFamide是在其C-末端具有通常的Arg-Phe-NH2基序一组肽激素，并且都与G蛋白偶联受体结合。已表明RFamide参与全身的许多过程，包括炎症反应、对食物摄入和发育的控制。RFamide发挥作用的一个主要方面是生殖，其涉及两种RFamide:促性腺激素抑制激素(GnIH)和亲吻肽。
[0004]KiSS-1基因位于人染色体lq32上，由四个外显子-两个非翻译和两个部分翻译的外显子组成，产生145个氨基酸(aa)的肽[I]。前体肽被剪切成54个氨基酸的长度，还可以进一步被截短至14、13或10个氨基酸；这些截短物被统称为亲吻肽，并且在哺乳动物中高度保守。目前已知这些肽是孤儿G蛋白偶联受体(GPCR)(在大鼠中被称为GPR54，在人中被称为AX0R12)的配体[2-4]。IOaa的肽，YNWNSFGLRF-NH2M以激活受体。
[0005]GPR54受体具有396aa的开放阅读框架，并与甘丙肽(galanin)受体家族相关，但是其并不与甘丙肽结合。大鼠GPR54在且哺乳动物中高度保守，与人受体有81%的同源性，与小鼠有85%的同源性[2，4，5]。在脑和外周组织中的受体和配体已得到充分表征，其中GPR54和KiSS-1位于下丘脑、主动脉、卵巢、前列腺和胎盘，GPR54还表达于垂体中[2,4,6, 7]。
[0006]考虑到受体和配体表达的位置，假设了它们在生殖中起作用，并且通过证明GPR54因杂合和纯合突变性功能缺失而引起特发性低促性腺激素性性腺功能减退症(iHH)而得到证实，在iHH患者中表现青春期延迟或无青春期(failed puberty),以低或无血衆促黄体激素(LH)脉冲为特征[8-13]。这也在GPR54-/-小鼠中观察到，其具有小的睾丸/卵巢，小的外生殖器和输精管，发育不全的Leydig细胞和子宫角，与在iHH人患者中看到的非常相似[14]。这就使得关注KiSS-1和GPR54在控制青春期尤其是其时机中起作用的假设。之后，发现青春期猴子的KiSS-1mRNA水平比幼年期猴子更高[15]。小鼠在第10日(dlO)没有KiSS-1神经元,从第25日开始在前腹侧室旁核(Anterioventral Paraventricularnucleus,AVPV)中出现KiSS-1神经元，并且雄性小鼠大约在第45日而雌性小鼠在第61日增加至成年水平。这与这些动物的青春期时机相一致[16]。然而，GPR54mRNA水平在出生后的整个青春期保持恒定，因此，亲吻肽输注可在所有阶段刺激LH释放。因此，亲吻肽被认为青春期始发中GnRH分泌的主要调节剂[17]。
[0007]亲吻肽和GPR54在下丘脑中的表达产生了亲吻肽可能参与调控下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴的假设。已通过证明亲吻肽在雄性大鼠和人中以剂量依赖的方式快速增加血浆促黄体激素(LH)、促卵泡激素(FSH)和睾丸素(其中其对LH的强效作用是对FSH的10倍)[18-20]而证实了这种假设。还进一步证明可以通过施用促性腺激素释放激素受体(GnRHR)拮抗剂而消除所述促性腺激素的增加。这表明亲吻肽在下丘脑水平发挥作用以刺激GnRH释放[15]。有关下丘脑的中间隆起处的GnRH神经元具有GPR54受体，而90%的KiSS-1神经元纤维与GnRH-免疫反应性神经元共定位的发现进一步证实了这一点[21，22]。另外，GT1-7下丘脑细胞也表达KiSS-1和GPR54mRNA，其因对雌二醇反应而增加，而亲吻肽在24小时后刺激这些细胞释放GnRH[23]。以上数据还表明亲吻肽并不在垂体水平起作用，但是尚未排除直接在垂体水平起作用。其他研究小组还证明亲吻肽在垂体中的促性腺激素细胞和生长激素细胞中表达，并且亲吻肽可以直接刺激LH和生长激素的释放[24，25]。
[0008]KiSS-1神经元定位于啮齿动物和灵长动物下丘脑的弓状核(ARC)和AVPV。然而在羊和大鼠中，仅在ARC中发现KiSS-1神经元[16，26，27]。现在已确定ARC参与类固醇的负调节，而AVPV参与促性腺激素释放的正反馈控制。首次注意到，在将雄性小鼠阉割之后，观察到在ARC中，KiSS-1细胞数量和mRNA表达水平增加，并且雌激素替代使其降低至正常水平，而在AVPV中，KiSS-1细胞数量减少，并且雌激素给药使其升高回正常水平[26]。现在已证明KiSS-1细胞体表达雌激素受体a (ERa )和黄体酮受体，表明KiSS-1在类固醇反馈环中的作用[27，28]。这表明ARC在负控制下调节LH脉冲，而AVPV在正控制下可能刺激LH激增和诱导排卵。这通过亲吻肽抗血清甚至在高雌激素存在下也抑制大鼠LH激增而得到证明，此外，还因为雌鼠AVPV中的KiSS-1神经元比雄鼠多10倍。该类固醇控制在整个发情周期是起作用的，因为在AVPV中的KiSS-1-阳性细胞数量在动情前期最高，而在动情间期最低，而在ARC中的情形则与其相反[16，29]。对于羊，作用于ARC上的正和负反馈产生与其它哺乳动物尾部区域促进LH激增相同的反应。除了类固醇控制，KiSS-1还通过褪黑素受到光周期的调节，而且KiSS-1神经元在其细胞体上具有Mellc受体。与保持在长日照条件下的雌性西伯利亚仓鼠相比，保持在短日照下的雌性西伯利亚仓鼠对外源性亲吻肽的反应也降低[30-33]。瘦素(Ieptin)似乎也具有影响作用，因为严格禁食的啮齿动物具有降低的KiSS-lmRNA、GnRH, LH和FSH以及延迟的青春期[34，35]。
[0009]还在HPG轴外部的诸如心脏血管系统的外周组织中发现亲吻肽，已证明亲吻肽-10/13作为主动脉平滑肌的血管收缩剂起作用[7，36] JPR54还高度表达于中枢神经系统(CNS)，脑海马区域中，已证明其通过涉及MAP激酶的机理可逆地增强海马齿状回颗粒细胞中的突触传递，其中所述机理似乎受到钙-激活激酶和酪氨酸激酶的调控[37]。KiSS-1和GPR54mRNA还定位于大鼠卵巢中，其在大鼠卵巢中的表达同样与动情周期相关。在卵巢中，KiSS-1定位于卵巢表面上皮细胞、间质腺、黄体以及在卵泡中，直至动情前期都存在于膜细胞中，而动情前期时表达移至卵泡细胞层[6]。最近，在子宫输卵管中发现KiSS mRNA,并且假设其参与防止异位妊娠[38]。然而，KiSS-1和GPR54的最高水平在胎盘中。
[0010]在胎盘中，KiSS-1和GPR54定位于小鼠[39]和人[40]的合体滋养层细胞；和大鼠的巨细胞[41]。GPR54还定位于外绒毛滋养层细胞，表明其可能有旁分泌作用[42]。在人中，妊娠前三个月配体和受体都以高水平存在，但是足月仅有KiSS-1存在，而在大鼠中到E18.5期二者都不存在。这与滋养层的侵入相一致，而KiSS-1由于其抗转移性质而被假设为该侵入的抑制剂[39，41]。
[0011]还已知亲吻肽是许多癌症组织例如胰腺癌、甲状腺癌和肝细胞癌中的抗转移因子[43-45]。已假设了此功能的不同机制，包括基质细胞衍生因子-1(SDF-1)的拮抗作用，以抑制其趋化因子受体CXCR4的转移性质，以及上调调节性钙依赖磷酸酶-相作蛋白-1 (modulatory calcineurin-1nteractin protein-1, MCIP-1), MCIP-1 是能够抑制?丐依赖磷酸酶信号传导途径的趋化激素[46，47]。另一个假设是亲吻肽受到特异性蛋白I(SPl)和位于染色体区域6ql6.3q23的其共激活因子DRIP130的调控。当此区域出现杂合性缺失(LOH)时，肿瘤常缺失KiSS-Ι，而这允许转移发生。这可由抑制侵入和迁移的SPl和DRIP130补救[48，49]。
[0012]在培养的细胞中也证明了这种抑制，并且作为输出(output)以研究亲吻肽所使用的信号传导途径。在中国卵巢仓鼠(CHO)细胞中，亲吻肽-1O(KplO)可以抑制趋化性、迁移、集落形成和生长以及可以引起细胞变圆。Kp-1O还可以通过粘着斑激酶(FAK)和paxillin蛋白的磷酸化作用而引起粘着斑和应力纤维的形成[3，50, 51]。已证明亲吻肽和GPR54提高肌醇-3-磷酸、细胞内钙和pERK，表明GPR54激活Gq/11信号传导途径[4]。这与抗转移性质不完全一致，因为这种途径通常刺激生长和迁移。因此，表明亲吻肽可能激活其它途径,如Rho和Rac/Cdc42途径[5，51]。
[0013]在这个背景下，本发明的发明人惊奇地发现，亲吻肽拮抗剂可以用于治疗个体中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症。
[0014]因此，在第一方面，本发明提供了亲吻肽拮抗剂在制备用于治疗个体中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症的药物中的用途。第二方面，本发明提供了亲吻肽拮抗剂，其用于治疗个体中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症。
[0015]具体而言，发现GPR54受体的拮抗剂通过在下丘脑抑制GnRH释放，而可用于调控与促性腺激素和性类固醇相关的疾病。因此，亲吻肽拮抗剂是一个重要的发现，因为它们可能替代用于抑制促性腺激素的GnRH激动剂和拮抗剂，并且它们的作用更快速和完全。
[0016]GnRH类似物以抑制型形态被用于抑制促性腺激素和性激素，并且它们已经在激素依赖性疾病(如前列腺癌、乳癌和卵巢癌)的治疗中获得广泛的治疗应用，并在体外受精用于诱导排卵，以及作为新一 代的避孕药。
[0017]因此，由于亲吻肽是GnRH的主要刺激物(例如，已知亲吻肽受体GPR54的突变引起不育)，本发明的发明人发现亲吻肽拮抗剂可能与GnRH拮抗剂有相似的应用范围；此外，由于亲吻肽操纵GnRH神经元的上游，预期亲吻肽拮抗剂的作用应该比基于GnRH的治疗法更快速和有效。
[0018]本文中，“个体中的亲吻肽活性”包括亲吻肽在体外和/或体内的任何特性、活性或特征。因而，本文中的“亲吻肽拮抗剂”的含义包括能够防止和/或降低亲吻肽在体外和/或体内的任何特性、活性或特征的分子。例如，亲吻肽拮抗剂可以防止和/或降低亲吻肽物理性地与亲吻肽受体或其它细胞成分缔合或结合的能力。
[0019]因而，本发明的分子和拮抗剂能够可逆地或不可逆地结合亲吻肽受体和/或选择性地结合亲吻肽受体。所述“选择性地结合”包括本发明的分子和拮抗剂与亲吻肽受体结合的能力比与其它多肽结合的能力强至少10倍；优选地强至少50倍，和更优选地强至少100倍。优选地，本发明的分子和拮抗剂在生理条件下，例如在体内与亲吻肽受体结合。测量肽与其配体或受体结合或缔合的方法(无论是在体内或是在体外)是生物化学和细胞生物学领域的技术人员所熟知的。
[0020]例如，如以下实施例中所显示的，本发明的拮抗剂可以是亲吻肽的竞争性拮抗剂，其结合但并不激活亲吻肽同源受体(如GPR54)。
[0021]亲吻肽拮抗剂还可以阻止和/或降低亲吻肽刺激具体细胞行为的能力，例如细胞中(例如在转化或原代细胞系如CHO、HEK、COS、GnRH GTI神经元细胞系以及正常滋养层和细胞系如JEG中)亲吻肽介导的刺激肌醇磷酸生成。本领域中熟知用于肌醇磷酸生成的细胞测量的生物化学测定法。
[0022]在尤其优选的方面，拮抗剂为亲吻肽的肽类似物。亲吻肽的肽类似物的结构/活性关系(SAR)受到的关注相对较少，直到现在仍完全集中于激动作用[52，53]。亲吻肽的氨基酸序列(又被称为亲吻肽1-54)为:
[0023]GTSLSPPPESSGSRQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNSFGLRF.NH2。
[0024]因而，第三方面，本发明提供了包含以下序列或由以下序列组成的肽分子或者其片段或变体用于治疗患者中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症的用途，或者在制备用于治疗患者中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症的药物中的用途，所述序列为:
[0025]X1-G∕W-X2-R/ (D) R-X3
[0026]其中:
[0027]X1为F或A或任意D-氨基酸残基；
[0028]X2为L或A或任意D-氨基酸残基；
[0029]X3 为 F 或 W ;且
[0030]其中所述肽分子的C-末端氨基酸残基包含去除该残基上的电荷的基团z ；
[0031]并且所述肽序列不为:
[0032]F-G-L-R-F ；
[0033]F-G-L-R-W ;或
[0034]F-G-(D) F-R-F。
[0035]优选地，本发明肽分子的C-末端氨基酸残基包含基团z的情况下，该C-末端残基上的负电荷被去除。
[0036]应理解，在本文中使用常规的用于表示氨基酸的单字母代码来定义本发明所述的肽分子。术语“氨基酸”包括水溶性有机化合物中具有与α-碳原子连接的羧基(-C00H)和氨基(-NH2)基团的任何基团。氨基酸可以用通式R-CH(NH2)COOH表示；R基团为氢或有机基团，并且决定了任意具体氨基酸的性质。α-碳原子周围的四个不同基团的四面体排列使氨基酸具有光学活性。两种镜像形式被称为L-异构体和D-异构体。通常，仅有L-氨基酸是蛋白质(如真核蛋白质)的组成成分。
[0037]除非另作说明，本发明的肽分子包含L-氨基酸。当D-氨基酸存在于本发明的肽分子时，用带有前缀“ (D) ”的常规单字母氨基酸代码表示。
[0038]如所述，本发明的分子可以包含在特定位置具有“任意D-氨基酸”的肽序列或由在特定位置具有“任意D-氨基酸”的肽序列组成。所述“任意D-氨基酸”包括在序列中在特定位置的任意天然或非天然(例如化学修饰的)D-氨基酸。天然D-氨基酸的实例如下:D-丙氨酸；D-天冬氨酸；D-半胱氨酸；D-谷氨酸；D-苯丙氨酸；D-甘氨酸；D-组氨酸；D-异亮氨酸；D_赖氨酸；D-亮氨酸；D-蛋氨酸；D-天冬酰胺；D-脯氨酸；D-谷氨酰胺；D-精氨酸；D_丝氨酸；D-苏氨酸；D-缬氨酸；D-色氨酸；D-酪氨酸。
[0039]非天然D-氨基酸的实例如下:萘基丙氨酸；D-吡啶基丙氨酸；D-叔丁基丝氨酸；D-鸟氨酸；D-ε氨基赖氨酸；D-高精氨酸；D- α甲基亮氨酸以及用卤素取代(如F)这些和其它非天然氨基酸中的质子。[0040]通过形成肽键，氨基酸结合形成短链(肽)或较长的链(多肽)。已知蛋白质和/或肽由不同比例的大约20种常见氨基酸组成，其序列决定了蛋白质和/或肽的形状、性质和生物学作用。这种肽或多肽链中的氨基酸残基通常用它们在链上的排列位置来表示，第一位(即位点I)指定为链N-末端的氨基酸。
[0041]可以通过Lu et al (1981) J.0rg.Chem.46，3433和其中的参考文献中公开的Fmoc-聚酰胺式固相肽合成法来合成本发明分子的肽序列。用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)基团提供临时的N-氨基保护。使用含20%哌啶的N，N- 二甲基甲酰胺进行该高度碱不稳定的保护基团的重复去除。可以将侧链官能团保护成其丁基醚(对于丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的情况)、丁基酯(对于谷氨酸和天冬氨酸的情况)、丁基氧羧基衍生物(对于赖氨酸和组氨酸的情况)、三苯甲基衍生物(对于半胱氨酸的情况)和4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰衍生物(对于精氨酸的情况)。当C-末端残基为谷氨酰胺或天冬酰胺时，使用4，4’-二甲氧基二苯甲基基团保护侧链氨基官能团。固相载体基于由二甲基丙烯酰胺(主链单体)、双丙烯酰乙二胺(交联剂)和丙烯酰肌氨酸甲酯(功能化试剂)三种单体组成的聚二甲基-丙烯酰胺聚合物。所使用的肽-树脂可断裂连接剂为酸不稳定的4-羟甲基-苯氧基乙酸衍生物。除了天冬酰胺和谷氨酰胺之外，全部氨基酸衍生物均作为它们预制的对称酐衍生物加入，而使用反向N，N-二环己基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑介导的偶联方法加入天冬酰胺和谷氨酰胺。使用茚三酮、三硝基苯磺酸或吲哚醌(isotin)检测方法来监测所有的偶联和去保护反应。合成完成时，从树脂载体切下肽，同时用含有50%清除剂混合物的95%三氟乙酸处理去除侧链的保护基团。常用的清除剂为乙二硫醇、苯酚、苯甲醚和水，准确的选择取决于所合成的肽的氨基酸组成。通过真空蒸发去除三氟乙酸，接着通过用乙醚研磨而提供粗肽。通过简单的萃取步骤来去除存在的任何清除剂，其中通过冷冻干燥水相提供不含清除剂的粗肽。用于肽合成的试剂通常可购自Calbiochem-Novabiochem(UK) Ltd, NottinghamNG72QJ，UK。纯化可以通过例如体积排阻色谱法、离子交换色谱法和(主要地)反相高效液相色谱法等技术中的任意一种或组合来实现。肽的分析可以使用薄层色谱法、反相高效液相色谱法、酸水解后的氨基酸分析以及快速原子轰击(FAB)质谱分析来进行。
[0042]还可以使用化学和生物化学`领域技术人员所熟知的液相法来合成本发明分子的肽序列。
[0043]本发明分子的肽序列可以包含肽模拟物化合物或由肽模拟物化合物组成。术语“肽模拟物”是指模拟作为治疗剂的特定肽的结构和理想特征，同时避免了不期望特征的化合物。例如，可以口服给药的化合物吗啡，是脑啡肽和/或内啡肽的肽模拟物。
[0044]一般而言，由于缺乏口服生物利用度和蛋白水解的降解，涉及肽的治疗应用是受限的，并且通常通过注射给药。通常，例如肽在体内被外肽酶和内肽酶快速降解，以致其生物半衰期通常非常短。肽作为潜在的治疗剂的另一个缺陷是它们缺乏口服给药生物利用度。肽在胃肠道被蛋白水解酶降解很可能是重要的影响因素。然而，因为已认识到即使是不易被快速代谢失活的小环形肽或包括D-氨基酸的肽，仍然显示出较差的口服生物利用度，而使得问题更加复杂。这可能是由于跨肠膜转运较差和通过肝提取而从血液快速清除并且接着排泄到肠中而造成的。这些结果表明，多个酰胺键可能干扰口服生物利用度。由此认为当肽药物被口服给药时，肽链中连接氨基酸残基的肽键可能断裂或被切割。
[0045]有许多不同的方法用于设计和合成肽模拟物。在一种方法中，例如Sherman和Spatola, J.Am.Chem.Soc., 112:433 (1990)所公开的方法中，以基本等排(isoteric)的方式由多种化学官能团替代一个或更多个酰胺键。这种分步的方法在获得活性类似物方面取得一些成绩。在一些例子中，这些类似物显示比它们天然存在的对应物具有更长的生物半衰期。尽管如此，这种方法有些局限性。很少能成功替代多于一个的酰胺键。因而，所得到的类似物在分子的其它部位仍然对酶促失活敏感。替代肽键时，优选新的接头部分具有与肽键基本上相同的电荷分布和基本上相同的平面。
[0046] 反转肽模拟物(Retro-1nverso peptidomimetics),其中的肽键是反向的，可以用本领域中已知的方法合成，例如V10ziere et al(1997)J.1mmunol.1593230-3237中所描述的方法。该方法包括制备含有涉及主链变化，但不涉及侧链定向变化的伪肽。反转肽包含NH-CO键而不是CO-NH肽键，对蛋白酶解具有更强的抗性。之前已合成了某些GnRH肽的反转妝模拟物(Fromme, 2003, Endocrinology, 144:3262-9)。
[0047]在另一种方法中，将各种非编码或修饰的氨基酸如D-氨基酸和N-甲基氨基酸用于修饰哺乳动物肽。可选择地，通过共价修饰如环化，或者通过加入Y-内酰胺或其他类型的桥而稳定假定的生物活性构象。参见例如，Veber et al, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 75:2636 (1978)和 Thursell et al, Biochem.Biophys.Res.Comm.,111:166(1983)?
[0048]许多合成策略的共同主题是向基于肽的骨架中引入一些环化部分(moiety)。环化部分限制肽结构的构象空间，并且这常常产生对特定生物受体的亲合力增加的肽。这种策略的其他优势在于，向肽中引入环化部分还可获得对细胞肽酶的敏感性减小的肽。
[0049]合成环化稳定的肽模拟物的一种策略是闭环置换反应(RCM)。这种方法包括合成肽前体并使其接触RCM催化剂，从而产生限定构象的肽的步骤。合适的肽前体可以包含两个或更多个不饱和的C-C键。该方法可使用固相肽合成技术来进行。在这个实施方案中，锚定至固相载体的前体与RCM催化剂相接触，然后将产物从固相载体切下，从而产生限定构象的肽。
[0050]另一种方法，由D.H.Rich 在 Protease Inhabitors, Barrett 和 Selveson eds.,Elsevier (1986)中公开，已通过在酶抑制剂设计中应用过渡态类似物概念设计肽模拟物。例如，已知辛伐他汀(staline)的仲醇模拟胃蛋白酶底物中易断裂的酰胺键的四面体过渡态。然而，过渡态类似物概念与激素激动剂/拮抗剂设计没有明显关联。
[0051]为避免怀疑，用标准肽键连接肽序列中的氨基酸残基并不是必需的。例如，如上所述，可以用反向肽键连接氨基酸残基，或者可以通过模拟标准肽键的键长和空间定向的其它键将它们连接在一起。
[0052]在合成之后，可以使用本领域中已知的方法，如HPLC和色谱法纯化本发明的活性剂(agent)的肽序列。
[0053]本文所述的“分子”包括包含本发明的肽序列或由本发明的肽序列组成的分子的盐(如有机或无机酸加成盐)、酯和溶剂化物。应理解，该术语还包括与相关分子具有相同生物功能和/或活性的衍生物。此外，为了本发明的目的，该术语还包括相关分子的前药(例如，酯)。术语“前药”包括任意物质组分，其在口服或肠胃外给药后并且在给药后的预定时间内，在体内代谢形成相关活性剂，该活性剂的量是用实验方法可检测的。
[0054]本发明的分子还可以由能够使本发明的分子靶向和/或定位至靶细胞(如癌细胞)和/或能够增加本发明分子的半衰期(tl/2)的一个或更多部分组成，或者包含能够使本发明的分子靶向和/或定位至靶细胞(如癌细胞)和/或能够增加本发明分子的半衰期(tl/2)的一个或更多部分。因此，所述部分可以提高本发明分子的功效。优选地，当该分子包括包含D-氨基酸或由D-氨基酸组成的肽序列或者由包含D-氨基酸或由D-氨基酸组成的肽序列组成时，本发明的分子中可包含一个或更多所述部分，这是因为D-氨基酸残基尤其易于被修饰。
[0055]本发明的分子还可以由能够使本发明的分子靶向和/或定位至靶细胞(如癌细胞)和/或能够增加本发明分子的半衰期(tl/2)的一个或更多部分组成，或者包括能够使本发明的分子靶向和/或定位至靶细胞(如癌细胞)和/或能够增加本发明分子的半衰期(tl/2)的一个或更多部分。因此，所述部分可以提高本发明的分子的功效。优选地，当该活性剂包括包含D-氨基酸的肽序列或由包含D-氨基酸的肽序列组成时，本发明的分子中可包含一个或更多所述部分，这是因为那些D-氨基酸残基尤其易于被修饰。
[0056]优选地，所述一个或更多部分为类固醇激素分子(包括例如黄体酮、睾丸酮、雌二醇或皮质醇)，并且与D-氨基酸的侧链结合。类固醇激素分子能够结合血浆蛋白，且已被证明能降低肽的代谢清除率(Ratcliffe et al., 2006, Endocrinology, 147:571-9)。例如，在W02004/08725中描述了与类固醇激素结合的GnRH肽，该篇文献引入本文作为参考。可选择地，所述一个或更多部分为维生素，如维生素B12或维生素D，并且与亲吻肽类似物的NH2端或者天然或D-氨基酸的合适侧链结合。已证明维生素提高肽的口服生物利用度(Russell-Jones et al., 1995, Bioconjug.Chem., 6:34-42; Russell-Jones etal., 1995, Bioconjug.Chem., 6:459-465)。
[0057]优选地，本发明的分子作为亲吻肽拮抗剂的能力不受所述一个或更多部分影响和
/或显著影响。
[0058]优选地，本发明提供用途，其中所述肽序列不为:`[0059]F-G-A-R-W ；
[0060]F-G-L- (D) R-W ；
[0061]F-G-(D)L-R-Wj
[0062](D) F-G-L-R-W。
[0063]方便地，本发明提供用途，其中X1为⑶F。优选地，X2为选自⑶F、(D) L和⑶W
的D-氨基酸残基。
[0064]更优选地，所述肽序列选自:
[0065](D)F-W-L-R-W ;或
[0066]F-G-(D) W-R-F。
[0067]在一个实施方案，本发明提供用途，其中所述N-末端残基包含去除该残基上的电荷的基团y。通常，X1包含去除该残基上的电荷的基团y。
[0068]所述基团y可选自:乙酰基(在本申请全文中以“ac”表示)；三氟乙酰基；环化氨基酸；或N-末端不带电荷的合成氨基酸(例如氨基通过加入其它化合物(如焦谷氨酸)或化学基团例如烷基(例如甲酰基、乙酰基、丙基、丁基和更长的烷基)而被修饰的氨基酸)。
[0069]优选地，本发明提供用途，其中X3包含去除该残基上的电荷的基团z。
[0070]在一个实施方案中，本发明提供用途，其中所述序列选自:
[0071 ] I) ac.F-G- (D) F-R-ff.z ；[0072]II)ac.F_G_(D)L-R-ff.z ；
[0073]III)ac.F-G-L-(D)R-ff.z ；
[0074]IV) ac.F-G-A-R-W.z ；
[0075]V) ac.A-G-L-R-ff.z ；
[0076]VI) ac.(D) F-ff-L-R-ff.z ;或
[0077]VII)ac.F_G_(D)ff-R-F.z。
[0078]在一个实施方案中，用去除该残基上的电荷的基团y替代以上⑴至(VI)的任意一种肽的N-末端残基上的乙酰基(以上和本申请中全文以“a^表示)，并且所述基团y优选选自:乙酰基；三氟乙酰基；环化氨基酸；或N-末端不带电荷的合成氨基酸。
[0079]在一个实施方案中，本发明第三方面的用途涉及在本发明第三方面的肽序列的N-和/或C-末端包含额外氨基酸残基或肽的肽序列分子，从而将肽序列加入较大的多肽或蛋白质分子中。因而，本发明第三方面的肽序列在N-和/或C-末端可以包含O至10个氨基酸；或10至20个氨基酸；或20至30个氨基酸；或30至40个氨基酸；或40至50个氨基酸；或50至60个氨基酸；或60至70个氨基酸；或70至80个氨基酸；或80至90个氨基酸；或90至100个氨基酸；或多于100个氨基酸。
[0080]在优选的实施方案中，本发明第三方面的用途涉及在肽序列N-末端包含额外肽序列R-R-M-K-W-K-K-Y或ac.R-R-M-K-W-K-K-Y的分子，或者由在肽序列N-末端的额外肽序列 R-R-M-K-W-K-K-Y 或 ac.R-R-M-K-ff-K-K-Y 组成的分子。
[0081]所述R-R-M-K-W-K-K-Y序列为来自果蚬触足肽(Antennapedia)的七肽序列，所述果蝇触足肽促进和/或提高细胞中肽序列的递送，从而提高本发明的肽的治疗用途。所述果妮触足妝七妝描述于 Fisher et al., 2003, J.Peptides Res.，55:163-72 ;和 Wang etal.，2006，Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters， 16:2628-2631。
[0082]因此，本发明的肽可以包含以下序列或由以下序列组成:
[0083]R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-(D)F-R-ff.z ；
[0084]R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-(D)L-R-ff.z ；
[0085]R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-L-(D)R-ff.z ；
[0086]R-R-M-K-ff-K-K-Y-F-G-A-R-ff.z ；
[0087]R-R-M-K-ff-K-K-Y-A-G-L-R-ff.z ；
[0088]R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)F-ff-L-R-ff.z ；或
[0089]R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-(D)ff-R-F.z。
[0090]任选地，如上所定义，所述N-末端残基在N-末端可以包含基团y，并且优选为乙酰基(ac)。
[0091]优选地，本发明第三方面的肽序列加入全长亲吻肽的一部分或全部序列中。更优选地，本发明第三方面的肽序列的N-末端可以延长至包含亲吻肽1-54的肽序列(即亲吻肽序列的I至54个氨基酸残基)和/或亲吻肽1-45的肽序列(即亲吻肽序列的I至45个氨基酸残基)的任意长度。例如，本发明第三方面的肽序列可以在其N-末端具有以下的序列:
[0092]GTSLSPPPESSGSRQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNS。
[0093]可选择地，本发明第三方面的肽序列可以加入蛋白质例如白蛋白和/或免疫球蛋白中。加入这些分子中被认为增加本发明肽分子在个体中的半衰期并降低代谢清除率。
[0094]在第四方面，本发明提供肽分子或者其片段或变体在治疗患者中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症，或者在制备用于治疗患者中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症的药物中的用途，所述肽分子包含以下序列或由以下序列组成:
[0095]Xa-Xb-Xc-N-Xd-Xe-G-Xf-R-F
[0096]其中:
[0097]XaS Y或任意的D-氨基酸残基；
[0098]Xb为N或任意的D-氨基酸残基；
[0099]Xg为W或任意的D-氨基酸残基；
[0100]Xd为G或S或任意的D-氨基酸残基；
[0101]Xe 为 F 或(D) W 或(D)L ;
[0102]Xf为W或L或任意的D-氨基酸残基；且
[0103]其中所述肽分子的C-末端氨基酸残基包含去除该残基上的电荷的基团z ；
[0104]并且所述肽序列不为:
[0105]Y-N-W-N-S-F-G-L-R-F ；`
[0106](D) Y-(D)N-W-N-S-F-G-W-R-F ；
[0107](D) Y-(D)N-W-N-G-F-G-W-R-F ；
[0108](D) Y- (D) N-W-N-S-F-G- (D) ff-R-F ；或
[0109](D) Y-(D)N-W-N-G-F-G-(D)ff-R-F。
[0110]优选地，Xa为选自以下的D-氨基酸残基:(D)F和(D)Y和0>)A。通常，Xb为选自以下的D-氨基酸残基:(D)A和(D) N。在一方面，当Xa或Xb中的一个为(D)Y时，另一个不为Φ)Ν。在另一方面，Xa和Xb不都为D-氨基酸残基。优选地，当Xf为(D)W时，Xa为(D)
F0
[0111]优选地，本发明提供用途，其中Xe为选自以下的D-氨基酸残基:⑶A和⑶W。
[0112]在一个实施方案中，Xd为选自以下的D-氨基酸残基:(D)A和⑶W。优选地，当Xd为S时，XfS (D)W和/或Xa不为⑶Y，更优选地，当Xd为S时，XfS (D)W和/或XaS (D)A0
[0113]优选地，Xf为选自以下的D-氨基酸残基:(D)UP 0))W.[0114]在一个实施方案中，当Xe和Xf都为(D)W时，Xa不为(D)Y0优选地，当Xe和Xf都为(D)W 时，XaS (D)A0
[0115]典型地，本发明提供用途，其中所述N-末端残基包含去除该残基上的电荷的基团I。优选地，X1包含去除该残基上的电荷的基团y。所述基团y选自:乙酰基；三氟乙酰基；环化氨基酸；或N-末端不带电荷的合成氨基酸。
[0116]在一个优选实施方案中，本发明提供用途，其中所述肽分子的C-末端F残基包含去除该残基上的电荷的基团z。
[0117]在一个实施方案，所述肽序列选自:
[0118]a) Y-N-W-N-G-F-G-L-R-F.z ；
[0119]b)Y-N-W-N-G-F-G-(D)L—R—F.z ；
[0120]c) Y-N-W-N-G-F-G- (D) ff-R-F.z ；[0121 ] d) Y-N-W-N-G- (D) ff-G-L-R-F.z ；
[0122]e) ac.Y-N-W-N-G-F-G- (D) ff-R-F.z ；
[0123]f) ac.Y-N-W-N- (D) W-F-G- (D) ff-R-F.z ；
[0124]g) ac.(D) Y-N-W-N-G-F-G- (D) ff-R-F.z ；
[0125]h) ac.Y-N- (D) ff-N-G-F-G- (D) ff-R-F.z ；
[0126]i) ac.Y- (D) N-ff-N-G-F-G- (D) ff-R-F.z ；
[0127]j) ac.Y-N-W-N- (D) A-F-G- (D) ff-R-F.z ；
[0128]k) ac.(D) A-N-ff-N-G-F-G- (D) ff-R-F.z ；
[0129]I) ac.Y-N- (D) A-N-G-F-G- (D) ff-R-F.z ；
[0130]m) ac.Y- (D) A-ff-N-G-F-G- (D) ff-R-F.z ；
[0131 ] n) ac.(D) ff-N-ff-N-G-F-G- (D) ff-R-F.z ；
[0132]o) ac.(D) F-N-W-N-G-F-G- (D) ff-R-F.z ；
[0133]p) ac.(D) Y-N-ff-N-G- (D) ff-G- (D) ff-R-F.z ；
[0134]q) ac.(D) A-N-ff-N-G- (D) ff-G- (D) ff-R-F.z ；
[0135]r) ac.(D) A-N-ff-N-S-F-G- (D) ff-R-F.z ；
[0136]s) ac.(D) -A-N-ff-N-G-F-G-ff-R-F.z ；
[0137]t) ac.(D) A-N-ff-N- (D) S-F-G- (D) ff-R-F.z ;或
[0138]u) ac.(D) A-N-ff-N-G-F-G- (D) L—R—F.z。
[0139]在一个实施方案中，本发明第四方面的用途涉及在本发明第四方面的肽序列的N-和/或C-末端包含额外氨基酸残基或肽的肽序列分子，从而将肽序列加入较大的多肽或蛋白质分子中。因而，本发明第四方面的肽序列在N-和/或C-末端可以包含O至10个氨基酸；或10至20个氨基酸；或20至30个氨基酸；或30至40个氨基酸；或40至50个氨基酸；或50至60个氨基酸；或60至70个氨基酸；或70至80个氨基酸；或80至90个氨基酸；或90至100个氨基酸；或多于100个氨基酸。
[0140]在一个优选实施方案中，本发明第四方面的用途涉及在肽序列的N-末端包含额外肽序列R-R-M-K-W-K-K-Y或ac.R-R-M-K-W-K-K - Y的分子，或者由在肽序列的N-末端的额外肽序列 R-R-M-K-W-K-K-Y 或 ac.R-R-M-K-ff-K-K-Y 组成的分子。
[0141]如前所述，所述R-R-M-K-W-K-K-Y序列为来自果蝇触足肽的七肽序列。因此，本发明第四方面的肽可以包含以下序列或由以下序列组成:
[0142]R-R-M-K-ff-K-K-Y-Y-N-ff-N-G-F-G-L-R-F.z ；
[0143]R-R-M-K-ff-K-K-Y-Y-N-ff-N-G-F-G-(D)L-R-F.z ；
[0144]R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
[0145]R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-G-(D)W-G-L-R-F.z ；
[0146]R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
[0147]R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-(D)W-F-G-(D)ff-R-F.z ；
[0148]R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)Y-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z ；
[0149]R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-(D)ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z ；
[0150]R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-(D)N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z ；
[0151]R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-(D)A-F-G-(D)ff-R-F.z ；[0152]R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)A-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z ；
[0153]R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-(D)A-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z ；
[0154]R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-(D)A-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z ；
[0155]R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)ff-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R- F.z ；
[0156]R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)F-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z ；
[0157]R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)Y-N-ff-N-G-(D)ff-G-(D)ff-R-F.z ；
[0158]R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)A-N-ff-N-G-(D)ff-G-(D)ff-R-F.z ；
[0159]R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)A-N-ff-N-S-F-G-(D)ff-R-F.z ；
[0160]R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)A-N-ff-N-G-F-G-ff-R-F.z ；
[0161]R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)A-N-ff-N-(D)S-F-G-(D) ff-R-F.z ；或
[0162]R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)A-N-ff-N-G-F-G-(D)L-R-F.z。
[0163]任选地，如上所定义，所述N-末端残基在N-末端可以包含基团y，并且优选为乙酰基(ac)。
[0164]在特别优选的实施方案中，本发明第四方面的肽序列选自:
[0165]R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)A-N-`ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z ；或
[0166]ac.R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)A-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z。
[0167]如以下实施例中所显示的，本发明的肽包含保持亲吻肽拮抗剂功能的N-末端果蝇触足肽七肽。
[0168]优选地，本发明第四方面的肽序列加入全长亲吻肽的一部分或全部序列中。更优选地，本发明第四方面的肽序列的N-末端可以延长至包含亲吻肽1-54的肽序列(即亲吻肽序列的I至54个氨基酸残基)和/或亲吻肽1-45的肽序列(即亲吻肽序列的I至45个氨基酸残基)的任意长度。例如，本发明第四方面的肽序列可在其N-末端具有以下的序列:
[0169]GTSLSPPPESSGSRQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLP。
[0170]可选择地，本发明第四方面的肽序列可以加入蛋白质如白蛋白和/或免疫球蛋白中。加入这些分子中被认为增加本发明肽分子在个体中的半衰期和降低代谢清除率。
[0171]本文所述“个体中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症”包括个体中的此病症的症状和/或进展和/或结局是由亲吻肽活性引起、诱导、提高、增强和/或使加重的病症。
[0172]优选地，个体中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症选自:增殖性疾病；子宫内膜异位症；子宫肌瘤；性早熟；先兆子痫；胎儿宫内生长迟缓(IUGR);异位妊娠；月经过多；高血压；冠心病；中枢神经系统(CNS)、胰腺和/或免疫系统疾病；阻抑或抑制排卵；生育病；化疗引起和/或放疗引起的生殖组织损伤；阻抑和/或抑制创伤愈合；阻抑和/或抑制生长激素生成。
[0173]例如，在由促性腺激素和性类固醇激素刺激的生殖组织中，亲吻肽拮抗剂将抑制GnRH分泌，从而抑制对生殖组织和生殖系统癌症的刺激。因此，亲吻肽拮抗剂可用于抑制内源性促性腺激素，使得外源性促性腺激素可以以受控的方式给药，以治疗患有阻抑或抑制排卵的个体，从而诱导或提高个体的排卵。因此，亲吻肽拮抗剂还可被用于降低或抑制生育力，从而获得男性和女性都适用的避孕方式。此外，亲吻肽拮抗剂对刺激生殖组织的抑制将允许它们应用于防止化疗引起或放疗引起的生殖组织损伤，从而保护接受化疗和/或放疗的癌症个体的生殖组织。
[0174]如以下实施例中所显示的，本发明的拮抗剂能够抑制和/或减小亲吻肽对细胞迁移的抑制作用。由于在创伤愈合中需要出现细胞迁移，因此，亲吻肽在抑制创伤愈合中发挥作用。因此，在一个实施方案中，本发明的拮抗剂可用于有此需要的个体以诱导和/或促进创伤愈合。
[0175] 如以下实施例中所显示的，令人惊奇地，本发明的拮抗剂提高测试个体中的生长激素水平。因此，本发明的拮抗剂可用于有此需要的个体以促进和/或诱导生长激素生成。例如，本发明的拮抗剂可以与使用生长激素的现有疗法一起使用，例如用于肾衰竭的治疗。
[0176]亲吻肽独立地抑制滋养层侵入子宫壁(即植入)，如在先兆子痫或IUGR中所发生的。对于先兆子痫，已证明KiSS-1mRNA增加，抑制母体血液供应的正确的滋养层侵入[54]。因而，亲吻肽拮抗剂可被用于减轻所述抑制，并且例如，允许在病态妊娠，如先兆子痫期间发生滋养层侵入。
[0177]已知亲吻肽独立地诱导血管收缩，并且因此亲吻肽拮抗剂可以被用于治疗高血压，例如在外周组织中作为高血压药物以降低血管的血管收缩。GPR54表达于CNS中，并且亲吻肽拮抗剂可用于调节CNS功能(如在海马齿状回颗粒细胞中)。
[0178]在一个实施方案中，由去除该残基上的电荷的基团y替代以上(e)至(S)的任意一种肽的N-末端残基上的乙酰基，并且所述基团I优选选自:乙酰基；三氟乙酰基；环化氨基酸；或N-末端不带电荷的合成氨基酸。
[0179]已知亲吻肽以高水平在胎盘中表达，并且参与植入。植入不良可能导致先兆子痫和胎儿宫内生长迟缓，对于这些疾病至今(在本发明以前)未有有效的治疗。
[0180]亲吻肽及其受体(GPR54)还表达于滋养层和子宫细胞中(Hiden etal., 2007, Rev.Endocr.Metab.Disord., 8:31-39)，如以下实施例所显示的，本发明的发明人证明亲吻肽导致胎儿生长迟缓。因此，亲吻肽输入的调节将可应用于先兆子痫、胎儿宫内生长迟缓(IUGR)和异位妊娠。
[0181]此外，亲吻妝和GPR54诱导血管收缩增强(Meadet al., 2007, Endocrinology, 148:140-147)，并且存在于动脉粥样硬化斑块中，因此亲吻肽拮抗剂可以用于治疗高血压和冠心病。
[0182]亲吻肽和它的受体(GPR54)还广泛表达于中枢神经系统、胰腺和免疫系统中(Muir et al., 2001, J.Biol.Chem., 276: 28969-28975 ; Kotani et al., 2001, J.Biol.Chem.，276:34631-34636)，因此拮抗剂可以应用于这些组织的疾病。
[0183]优选地，由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症为动物的病症。所述动物可以是人，或可以是任何哺乳动物，如驯养哺乳动物(优选有农业或商业重要性的动物，包括鸡；猫；狗；猪；羊；牛；马)。
[0184]更优选地，所述增殖性疾病选自或包括:良性前列腺增生症；癌症；生殖组织的癌症；妇科癌症；前列腺癌；乳癌；卵巢癌；子宫癌；宫颈癌；子宫内膜癌；黑色素瘤；胰腺癌；胃癌。
[0185]使用本发明的分子可能治疗所有表达亲吻肽受体的癌症。优选地，所述癌症为生殖系统癌症(包括前列腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌和乳癌)，这些病症全都表达亲吻肽受体。[0186]用于检测细胞蛋白表达的方法是本领域中所熟知的。合适用于检测亲吻肽受体的方法包括:用于检测编码亲吻肽受体的mRNA存在的原位杂交和/或PCR ;用于检测亲吻肽受体蛋白存在的放射性配体结合法；以及使用能够特异性结合亲吻肽受体的抗体的方法(例如免疫印迹法、免疫组织化学法、免疫荧光法和ELISA)。
[0187]优选在本发明的第三和/或第四方面定义的肽分子为亲吻肽拮抗剂，或者其片段或变体为亲吻肽拮抗剂。
[0188]优选地，本发明提供根据本发明第一和/或第二方面的拮抗剂，或者本发明第三或第四方面定义的肽分子，其用于药物。更优选地，所述肽分子为亲吻肽拮抗剂。
[0189]在第五个实施方案中，本发明提供了包含以下序列或由以下序列组成的的肽分子，或者其片段或变体:
[0190]X1-GZW-X2-R/ (D) R-X3
[0191]其中:
[0192]X1为F或A或任意的D-氨基酸残基；
[0193]X2为L或A或任意的D-氨基酸残基；
[0194]X3 为 F 或 W ;且
[0195]其中所述肽分子的C-末端氨基酸残基包含去除该残基上的电荷的基团z ；
[0196]并且所述肽序列不为:
[0197]F-G-L-R-F ；
[0198]F-G-L-R-W ；
[0199]F-G- (D) F-R-F ；
[0200]F-G-A-R-W ；
[0201]F-G-L- (D) R-W ；
[0202]F-G- (D) L-R-W ；
[0203]A-G-L-R-W ;或
[0204](D) F-G-L-R-W。
[0205]优选地，本发明提供肽分子，其中X1为⑶F。通常，X2为选自以下的D-氨基酸残基:(D) F、(D) L 和(D) W。
[0206]方便地，根据本发明的第五方面的肽分子选自:
[0207](D)F-W-L-R-W ;或
[0208]F-G-(D) W-R-F。
[0209]在一个优选实施方案中，所述N-末端残基包含去除该残基上的电荷的基团y。优选地，X1包含去除该残基上的电荷的基团y。尤其优选基团y选自:乙酰基；三氟乙酰基；环化氨基酸；或N-末端不带电荷的合成氨基酸。
[0210]在一个实施方案中，X3包含去除该残基上的电荷的基团z。
[0211]优选地，所述肽序列选自:
[0212]I) ac.F-G- (D) F-R-ff.z ；
[0213]II)ac.F_G_(D)L-R-ff.z ；
[0214]III)ac.F-G-L-(D)R-ff.z ；
[0215]IV) ac.F-G-A-R-W.z ;[0216]V) ac.A-G-L-R-ff.z
[0217]VI) ac.(D) F-ff-L-R-ff.z ;或
[0218]VII)ac.F_G_(D)ff-R-F.z。
[0219]在一个实施方案中，以上(I)至(VI)的任意一种肽的N-末端残基的乙酰基被去除该残基上的电荷的基团y替代，并且优选y基团选自:乙酰基；三氟乙酰基；环化氨基酸；或N-末端不带电荷的合成氨基酸。
[0220]在一个实施方案中，本发明第五方面的肽分子涉及在本发明第五方面的肽序列N-和/或C-末端包含额外氨基酸残基或肽的分子，或者由在本发明第五方面的肽序列N-和/或C-末端的额外氨基酸残基或肽组成的分子，从而将所述肽序列加入较大的多肽或蛋白质分子中。因而，本发明第五方面的肽序列在N-和/或C-末端可以包含O至10个氨基酸；或10至20个氨基酸；或20至30个氨基酸；或30至40个氨基酸；或40至50个氨基酸；或50至60个氨基酸；或60至70个氨基酸；或70至80个氨基酸；或80至90个氨基酸；或90至100个氨基酸；或多于100个氨基酸。
[0221]在优选实施方案中，本发明第五方面的肽分子包含在N-末端的额外肽序列R-R-M-K-W-K-K-Y或ac.R-R-M-K-ff-K-K-Y,或者由在N-末端的额外肽序列R-R-M-K-ff-K-K-Y 或 ac.R-R-M-K-ff-K-K-Y 组成。
[0222]如上所述，所述R-R-M-K-W-K-K-Y序列为来自果蝇触足肽的七肽序列。因此，本发明第五方面的肽分子可以包含以下序列或由以下序列组成:
[0223]R-R-M-K-ff- K-K-Y-(D)F-ff-L-R-ff ；
[0224]R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-(D)ff-R-F ；
[0225]R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-(D)F-R-ff.z ；
[0226]R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-(D)L-R-ff.z ；
[0227]R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-L-(D)R-ff.z ；
[0228]R-R-M-K-ff-K-K-Y-F-G-A-R-ff.z ；
[0229]R-R-M-K-ff-K-K-Y-A-G-L-R-ff.z
[0230]R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)F-ff-L-R-ff.z ；或[0231 ] R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-(D)ff-R-F.z。
[0232]任选地，如上所定义，所述N-末端残基可以在N-末端包含基团y，并且优选为乙酰基(ac)。
[0233]优选地，本发明第五方面的肽序列加入全长亲吻肽的一部分或全部序列中。更优选地，本发明第五方面的肽序列的N-末端可以延长至包含亲吻肽1-54的肽序列(即亲吻肽序列的I至54个氨基酸残基)和/或亲吻肽1-45的肽序列(即亲吻肽序列的I至45个氨基酸残基)的任意长度。例如，本发明第五方面的肽序列可在其N-末端具有以下的序列:
[0234]GTSLSPPPESSGSRQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNS。
[0235]可选择地，本发明第五方面的肽序列可以加入蛋白质例如白蛋白和/或免疫球蛋白中。加入这些分子中被认为增加本发明肽分子在个体中的半衰期并降低代谢清除率。
[0236]在第六方面，本发明提供了包含以下序列或由以下序列组成的肽分子，或者其片段或变体:[0237]Xa-Xb-Xc-N-Xd-Xe-G-Xf-R-F
[0238]其中:
[0239]Xa为Y或任意D-氨基酸残基；
[0240]Xb为N或任意D-氨基酸残基；
[0241 ] Xg为W或任意D-氨基酸残基；
[0242]Xd为G或S或任意D-氨基酸残基；
[0243]Xe 为 F 或(D) W 或(D) L ;
[0244]Xf为W或L或任意D-氨基酸残基；且
[0245]其中所述肽分子的C-末端氨基酸残基包含去除该残基上的电荷的基团z ；
[0246]并且所述肽序列不为:
[0247]Y-N-W-N-S-F-G-L-R-F ；
[0248](D) Y- (D)N-W-N-S-F-G-W-R-F ；
[0249](D) Y-(D) N-W-N-G-F-G-W-R-F ；
[0250](D) Y- (D) N-W-N-S-F-G- (D) ff-R-F ；或[0251 ] (D) Y-(D)N-ff-N-G-F-G-(D)W-R-F。
[0252]优选地，在本发明第六方面肽分子提供Xa为选自以下的D-氨基酸残基:(D)F和(D) Y和⑶A。优选Xb为选自以下的D-氨基酸残基:(D)A和⑶N。
[0253]在一个实施方案中，本发明提供肽分子，其中当Xa或Xb中的一个为(D)Y时，另一个不为(D)N。一个尤其优选的实施方案是其中Xa和Xb不都为D-氨基酸残基。在一个实施方案中，当Xf为(D)W时，Xa为(D)F。
[0254]优选地，Xe为选自以下的D-氨基酸残基:(D)A和⑶W。方便地，Xd为选自以下的D-氨基酸残基:(D) A和⑶W。通常，Xf为选自以下的D-氨基酸残基:(D) L和⑶W。
[0255]在一个实施方案中，当Xd为S时，XfS (D)W和/或Xa不为⑶Y。优选地，当Xd为S 时，XfS (D)W和 / 或XaS (d)a。
[0256]在一个实施方案中，当Xe和Xf都为(D)W时，Xa不为(D) Y。优选地，当Xe和Xf都为(D)W 时，XaS (D)A0
[0257]方便地，本发明提供了肽分子，其中所述N-末端残基包含去除该残基上的电荷的基团y。在一个实施方案中，X1包含去除此该残基上的电荷的基团y。通常，基团y选自:乙酰基；三氟乙酰基；环化氨基酸；或化末端不带电荷的合成氨基酸。
[0258]在优选实施方案中，肽分子的C-末端F残基包含去除此该残基上的电荷的基团Zo
[0259]本发明第六方面的肽分子最优选包含选自以下的肽序列或由选自以下的肽序列组成:
[0260]a)Y-N-W-N-G-F-G-L-R-F.z ；
[0261]b)Y-N-ff-N-G-F-G-(D)L-R-F.z ；
[0262]c) Y-N-ff-N-G-F-G- (D) ff-R-F.z ；
[0263]d) Y-N-ff-N-G- (D) ff-G-L-R-F.z ；
[0264]e) ac.Y-N-ff-N-G-F-G- (D) ff-R-F.z ；
[0265]f) ac.Y-N-W-N- (D) ff-F-G- (D) ff-R-F.z ；[0266]g) ac.(D)Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
[0267]h) ac.Y-N- (D) ff-N-G-F-G- (D) ff-R-F.z ；
[0268]i) ac.Y- (D) N-ff-N-G-F-G- (D) ff-R-F.z ；
[0269]j) ac.Y-N-W-N- (D) A-F-G- (D) ff-R-F.z ；
[0270]k) ac.(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
[0271 ] I) ac.Y-N- (D) A-N-G-F-G- (D) ff-R-F.z ；
[0272]m) ac.Y- (D) A-ff-N-G-F-G- (D) ff-R-F.z ；
[0273]n) ac.(D) ff-N-ff-N-G-F-G- (D) ff-R-F.z ；
[0274]o)ac.(D) F-N-ff-N-G-F-G- (D) ff-R-F.z ；
[0275]p) ac.(D) Y-N-ff-N-G- (D) ff-G- (D) ff-R-F.z ；
[0276]q) ac.(D) A-N-ff-N-G- (D) ff-G- (D) ff-R-F.z ；
[0277]r) ac.(D) A-N-ff-N-S-F-G- (D) ff-R-F.z ;或
[0278]s) ac.(D) -A-N-ff-N-G-F-G-ff-R-F.z ；
[0279]t) ac.(D) A-N-ff-N- (D) S-F-G- (D) ff-R-F.z ;或
[0280]u) ac.(D) A-N-ff-N-G-`F-G- (D) L-R-F.z。
[0281]在一个实施方案中，由去除该残基上的电荷的基团y替代以上(e)至(S)的任意一种肽N-末端残基的乙酰基，并且基团y优选选自:乙酰基；三氟乙酰基；环化氨基酸；或N-末端不带电荷的合成氨基酸。
[0282]在一个实施方案中，本发明第六方面的肽分子涉及在本发明第六方面的肽序列N-和/或C-末端包含额外氨基酸残基或肽的分子，或者由在本发明第六方面的肽序列N-和/或C-末端的额外氨基酸残基或肽组成的分子，从而将肽序列加入较大的多肽或蛋白质分子中。因而，本发明第六方面的肽序列在N-和/或C-末端可以包含O至10个氨基酸；或10至20个氨基酸；或20至30个氨基酸；或30至40个氨基酸；或40至50个氨基酸；或50至60个氨基酸；或60至70个氨基酸；或70至80个氨基酸；或80至90个氨基酸；或90至100个氨基酸；或多于100个氨基酸。
[0283]在优选实施方案中，本发明第六方面的肽分子涉及在肽序列N-末端包含额外肽序列R-R-M-K-W-K-K-Y或ac.R-R-M-K-ff-K-K-Y的分子，或者由在肽序列N-末端的额外肽序列 R-R-M-K-W-K-K-Y 或 ac.R-R-M-K-ff-K-K-Y 组成的分子。
[0284]如前所述，所述R-R-M-K-W-K-K-Y序列为来自果蝇触足肽的七肽序列。因此，本发明的肽可以包含以下序列或由以下序列组成:
[0285]R-R-M-K-ff-K-K-Y-Y-N-ff-N-G-F-G-L-R-F.z ；
[0286]R-R-M-K-ff-K-K-Y-Y-N-ff-N-G-F-G-(D)L-R-F.z ；
[0287]R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
[0288]R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-G-(D)W-G-L-R-F.z ；
[0289]R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
[0290]R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-(D)ff-F-G-(D)ff-R-F.z ；
[0291]R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)Y-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z ；
[0292]R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-(D)ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z ；
[0293]R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-(D)N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z ；[0294]R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-(D)A-F-G-(D)ff-R-F.z ；
[0295]R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)A-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z ；
[0296]R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-(D)A-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z ；
[0297]R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-(D)A-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z ；
[0298]R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)ff-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R- F.z ；
[0299]R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)F-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z ；
[0300]R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)Y-N-ff-N-G-(D)ff-G-(D)ff-R-F.z ；
[0301 ] R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)A-N-ff-N-G-(D)ff-G-(D)ff-R-F.z ；
[0302]R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)A-N-ff-N-S-F-G-(D)ff-R-F.z ；
[0303]R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)A-N-ff-N-G-F-G-ff-R-F.z ；
[0304]R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)A-N-ff-N-(D)S-F-G-(D)ff-R-F.z ；或
[0305]R-R-M-K-ff-K-K-Y-(D)A-N-ff-N-G-F-G-(D)L-R-F.z。
[0306]任选地，如上文所定义，所述N-末端残基在N-末端可以包含基团y，并且优选为乙酰基(ac)。
[0307]在尤其优选的实 施方案中，所述肽序列选自:
[0308]R-R-M-K-ff-K-K-Y- (D) A-N-ff-N-G-F-G- (D) ff-R-F.z ;或 ac.R-R-M-K-ff-K-K-Y- (D)A-N-ff-N-G-F-G-(D)ff-R-F.z。
[0309]如以下实施例所显示的，本发明的肽包含保持亲吻肽拮抗剂功能的N-末端果蝇触足肽七肽。
[0310]优选地，本发明第六方面的肽序列加入全长亲吻肽的一部分或全部序列中。更优选地，本发明第六方面的肽序列的N-末端可以延长至包含亲吻肽1-54的肽序列(即亲吻肽序列的I至54个氨基酸残基)和/或亲吻肽1-45的肽序列(即亲吻肽序列的I至45个氨基酸残基)的任意长度。例如，本发明第六方面的肽序列在其N-末端可具有以下的序列:
[0311]GTSLSPPPESSGSRQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLP。
[0312]可选择地，本发明第六方面的肽序列可以加入蛋白质例如白蛋白和/或免疫球蛋白中。加入这些分子中被认为增加本发明肽分子在个体中的半衰期和降低代谢清除率。
[0313]在一个实施方案中，本发明提供了肽分子，其中所述z为NH2或N-丙基酰胺或N-乙基酰胺(NHEt)或N-甲基酰胺或N- 丁基酰胺。
[0314]优选地，z具有的分子量小于200，优选小于150，优选小于100。优选地，z为NHR’，其中R’为H或C1至C4烷基或z为0R’ ’，其中R’ ’为C1至C4烷基。优选地，z为酰胺。优选地，z为NH2或N-丙基酰胺或N-乙基酰胺(NHEt)或N-甲基酰胺或N- 丁基酰胺。
[0315]在第七实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含有效量的本发明的拮抗剂或本发明的肽分子和药学上可接受的赋形剂或稀释剂，或者由有效量的本发明的拮抗剂或本发明的肽分子和药学上可接受的赋形剂或稀释剂组成。
[0316]本文所述“有效量”是指本发明分子的量足够减轻和/或缓解和/或防止个体中与由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症相关的症状。例如，“有效量”可以通过在动物(并且，如果可能，人)中进行用于抑制促性腺激素和/或类固醇激素的剂量研究而确定；剂量范围可以是通过皮下或腹膜内或口服递送每日l-100mg。[0317]还可以通过使用实施例中所描述的方法在体外确定有效量(例如，用于监测细胞中对亲吻肽与亲吻肽受体结合的拮抗作用和/或对亲吻肽介导的刺激肌醇磷酸生成的拮抗作用的方法)或通过监测个体中(如动物)与由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症相关的症状的减轻和/或缓解和/或防止而在体内确定所述有效量，其中所述症状是相关医药领域的技术人员所熟知的。
[0318]关于在体外监测亲吻肽拮抗作用的方法，本领域技术人员理解，可以监测其它或另外的细胞和酶活性来测量亲吻肽介导的刺激。例如，已知Gq G蛋白激活磷脂酶(其生成IP和二酰基甘油，进而分别动员Ca2+和激活蛋白激酶C)和蛋白激酶C磷酸化并激活细胞外调节激酶(ERK)和/或丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联及其成员；因此，技术人员可监测那些细胞成分中任意一种或全部成分的活性和/或存在来确定亲吻肽介导的刺激。
[0319]在第八个实施方案中，本发明提供治疗个体中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症的方法，所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成:向所述个体施用本发明第七方面的药物组合物，或有效量的本发明第一或第二方面的亲吻肽拮抗剂，或有效量的本发明第二、第三、第四和/或第五方面的肽分子。
[0320]可以使用注射型缓释药物递送系统递送本发明的分子、药物和药物组合物。这些特别设计用于减少注射频率。所述系统的实例为Nutropin D印ot，其将重组人生长激素(rhGH)封装在生物可降解的微粒中，一旦注射，在持续时间内缓慢释放rhGH。优选地，进行肌内(1.m.)和/或皮下(s.c.)和/或静脉内(1.V.)递送。
[0321]可以通过将药物直接释放至所需位置的手术植入器械施用本发明的分子、药物和药物组合物。例如，Vitrasert直接释放更昔洛韦(ganciclovir)至眼睛，以治疗CMV视网膜炎。将该有毒活性剂直接施用至患病部位，来实现有效治疗而没有药物的明显全身副作用。
[0322]还可以利用电穿孔治疗(EPT)系`统来施用本发明的活性剂、药物和药物组合物。向细胞递送脉冲电场的设备提高了细胞膜对药物的渗透性，导致细胞中的药物递送显著增强。
[0323]本发明的分子、药物和药物组合物还可以通过电导入(electroincorporation, EI)递送。当皮肤表面上直径至多30微米的小微粒经历与电穿孔中所使用的电脉冲相同或类似的电脉冲时，出现EI。在EI中，这些微粒被驱动通过角质层并进入更深层的皮肤。所述微粒可以负载或包被药物或基因，或者可以简单地作为“子弹”而在皮肤上产生药物可以进入的孔。
[0324]本发明的分子、药物和药物组合物的另外的递送方法是热敏的ReGel可注射系统。低于体温时，ReGel是可注射液体，而在体温下，其立即形成缓慢消蚀并溶解成已知安全的生物可降解聚合物的凝胶储库。活性物质随着生物聚合物溶解而被递送。
[0325]本发明的分子、药物和药物组合物还可以口服递送。所述过程利用体内口服摄入维生素B12和/或维生素D的自然过程来共递送蛋白质和肽。借助于维生素B12和/或维生素D的摄入系统，本发明的核酸、分子和药物制剂可以通过肠壁。在维生素B12类似物和/或维生素D类似物与药物之间形成复合物，其既保持复合物中维生素B12部分/维生素D部分对内因子(IF)的有效亲合力，又保持了复合物中活性物质的有效生物活性。
[0326]本发明的分子、药物和药物组合物可以通过“木马肽(Trojan p印tide)”引入细胞。这些是一类称为穿透肽(penetratin)的多肽,其具有转位性质,并且能够携带亲水化合物穿过质膜。该系统允许将寡肽直接靶向细胞质和核，并且可以是非细胞类型特异性的和高度有效的。参见 Derossi et al.(1998)，Trends Cell Biol8, 84-87。
[0327]优选地，本发明的药物和/或药物组合物为单位剂型，该单位剂型包含日剂量或单位、日亚剂量或其适当部分的活性成分。
[0328]本发明的分子、药物和药物组合物通常以包含活性成分的药物组合物的形式，以药学上可接受的剂型，通过口服或通过任何肠胃外途径施用，所述活性成分任选为无毒的有机或无机酸或碱、加成盐的形式。所述组合物可以以不同剂量施用，这取决于待治疗的疾病和患者以及给药途径。
[0329]在人治疗中，本发明的分子、药物和药物组合物可以单独给药，但是通常与根据要给药途径和标准药物实践而选择的合适的赋形剂、稀释剂或载体混合给药。
[0330]例如，本发明的分子、药物和药物组合物可以以可包含调味剂或着色剂的片剂、胶囊、卵形栓剂(ovule)、酏剂、溶液或混悬剂的形式口服、口含或舌下给药，用于速释、延时释放或控释。本发明的分子、药物和药物组合物还可以通过海绵体中注射给药。
[0331]所述片剂可以包含赋形剂，如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸；崩解剂如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、羟基乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐，以及颗粒粘合剂如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。此外，可以包含润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸、甘油二十二烷酸酯和滑石。
[0332]相似类型的固体成分还可以用作明胶胶囊的填料。在这方面优选的赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、乳糖或 高分子量聚乙二醇。对于含水混悬剂和/或酏剂，本发明的活性剂可以与各种甜味剂或调味剂、着色剂或染料组合，与乳化剂和/或助悬剂组合，以及与稀释剂如水、乙醇、丙二醇和甘油组合，及其组合物组合。
[0333]本发明的分子、药物和药物组合物还可以肠胃外给药，例如，静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、胸内、颅内、肌内或皮下，或它们可以通过输注技术给药。它们最好以无菌水溶液的形式使用，所述无菌水溶液可包含其他物质，例如，足够的盐或葡萄糖以使溶液与血液等渗。若有必要，水溶液应当适当缓冲(优选PH3至9)。在无菌条件下制备合适的肠胃外制剂易于通过本领域技术人员所熟知的标准制药技术完成。
[0334]适合用于肠胃外给药的药物和药物组合物包括水和非水无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得制剂与预定接受者的血液等渗的溶质；并且含水和非水无菌混悬剂可以包含助悬剂和增稠剂。所述药物和组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以在冻干条件下保存，在使用前仅需直接加入无菌液体载体例如用于注射的水。可以由之前描述的各种无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备即用型注射溶液和混悬剂。
[0335]对于向人患者的口服和肠胃外给药，本发明的分子、药物和药物组合物的日剂量水平通常为每成人每日单次或分次剂量给药0.1至lOOmg。
[0336]因而，本发明分子的片剂或胶囊例如可以包含0.1mg至IOOmg的活性剂，根据需要用于一次单片(粒)或两片(粒)或更多给药。无论如何，医生可确定最合适任何个体患者的实际剂量，并且随着具体患者的年龄、体重和反应而变化。以上剂量是示例性的平均情况。当然也可以有更高或更低剂量范围的个体实例，并且这些都在本发明的范围之内。
[0337]本发明的分子、药物和药物组合物还可以鼻内或通过吸入给药，并且以干粉末吸入器的形式或以从具有使用合适抛射剂的压力容器、泵、喷雾或雾化器提供的气雾剂喷雾的形式方便地被递送，所述抛射剂如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷烃如1, 1, 1, 2-四氟乙烷(HFA134A)或1, 1, 1, 2，3，3，3-七氟丙烷(HFA227EA)、二氧化碳或其它合适的气体。对于压力气雾剂来说，可以通过提供递送计量的量的阀来确定剂量单位。所述压力容器、泵、喷雾或雾化器可以包含活性剂的溶液或混悬剂，例如使用乙醇和抛射剂的混合物作为溶剂，其可以另外包含润滑剂，如失水山梨糖醇三油酸酯。用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(例如由明胶制成)可以配制成包含本发明的活性剂和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
[0338]优选配制气雾剂或干粉制剂，使得每个计量的剂量或“吸(puff) ”包含至少0.1mg
本发明的分子，用于递送至患者。应理解气雾剂的每日总剂量将因患者不同而改变，并且可以以单次剂量给药，或更常见是全天分次剂量给药。
[0339]可选择地，本发明的分子、药物和药物组合物可以以栓剂或阴道栓的形式给药，或它们可以以洗剂、溶液、乳膏、凝胶、软膏或扑粉(dusting powder)的形式局部应用。本发明的分子、药物和药物组合物还可以以透皮给药，例如，通过利用皮肤贴膏给药。它们还可以通过眼部途径给药，尤其是用于治疗眼部疾病的情况下。
[0340]对于眼科使用，本发明的分子、药物和药物组合物可以配制成在等渗的、pH经调节的无菌生理盐水中的微粒化混悬剂，或优选地，配制成在等渗的、pH经调节的无菌生理盐水中的溶液，任选地，与诸如苯扎氯铵的防腐剂组合。可选择地，它们可以配制于软膏，如矿脂中。
[0341]对于向皮肤的局部应用，本发明的分子、药物和药物组合物可以配制成合适的包含所述活性剂的软膏，所述活性剂悬浮或溶解于例如一种或多种以下的混合物中:矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯剂、乳化蜡和水。可选择地，它们可以配制成合适的洗剂或乳膏，悬浮或溶解于例如一种或多种以下的混合物中:矿物油、山梨糖醇酐单硬脂酸酯、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨糖醇酯60、十六烷基酯蜡、十六醇、2-辛基十二醇、苯甲醇和水。
[0342]适合用于口腔局部给药的制剂包括糖锭，其包含在调味基质中的活性成分，所述调味基质通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶；锭剂，其包含在惰性基质中的活性成分，所述惰性基质如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶；以及漱口水，其包含在合适的液体载体中的活性成分。
[0343]通常， 对于人，优选的途径是口服或肠胃外给药本发明的活性剂的分子、药物和药物组合物，这样最为方便。
[0344]对于兽医使用，可根据标准兽医实践将本发明的分子、药物和药物组合物作为合适的可接受的制剂施用，并且兽医将确定最适合具体动物的给药方案和给药途径。
[0345]方便地，所述制剂为药物制剂。
[0346]有利地，所述制剂为兽医用制剂。
[0347]尤其优选的是，使用医学和制药领域已知的肽制剂配制本发明的分子，如在GnRH肽激动剂制剂中使用的那些(例如，包括聚甘氨酰丙交酯共聚物和/或聚乙二醇和/或油和/或微晶悬浮液或由聚甘氨酰丙交酯共聚物和/或聚乙二醇和/或油和/或微晶悬浮液或由其组成的制剂，可以用于注射本发明的分子)。
[0348]在本发明的第九方面，本发明提供用于鉴定亲吻肽拮抗剂的方法，所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成:
[0349]i)提供待测试的化合物；
[0350]ii)确定(i)中的化合物结合亲吻肽受体的能力；
[0351]iii)确定(i)中的化合物拮抗细胞中亲吻肽介导的刺激肌醇磷酸生成的能力；和
[0352]iv)在所述化合物能够结合亲吻肽受体并能够拮抗细胞中亲吻肽介导的刺激肌醇磷酸生成的情况下鉴定该化合物作为亲吻肽拮抗剂。
[0353]因而，本发明第九方面的方法可以用于确定具体测试化合物或测试分子(例如，包含以下肽序列或由以下肽序列组成的测试化合物或测试分子:亲吻肽的部分或全部肽序列的类似物)是否具有结合亲吻肽受体和功能性拮抗细胞内(例如用人亲吻肽受体GPR54瞬时或稳定转染的细胞系，如CHO、HEK或COS细胞系)亲吻肽介导的刺激肌醇磷酸生成的能力。以下实施例描述适合用于确定化合物结合亲吻肽受体的能力和用于测量细胞中亲吻肽介导的刺激肌醇磷酸生成的方法。本领域技术人员已知其它适当的方法。
[0354]例如，如上所述，本领域技术人员将理解可以监测其它或另外的细胞和酶活性来测量亲吻肽介导的刺激。例如，已知Gq G蛋白激活磷脂酶(其生成IP和二酰基甘油，进而分别动员Ca2+和激活蛋白激酶C)和蛋白激酶C磷酸化并激活细胞外调节激酶(ERK)和/或丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联及其成员；因此，技术人员可监测那些细胞成分的任意或全部成分的活性和/或存在来确定亲吻肽介导的刺激。
[0355]优选地，若是其具有〈ΙΟΟηΜ的`结合亲合力(即Kd)，则确认所述测试化合物或分子能够结合亲吻肽受体。
[0356]优选地，如以下实施例所描述，可根据能够拮抗IOnM亲吻肽刺激细胞内肌醇磷酸生成的能力而鉴定所述测试化合物或分子。优选地，根据能够达到至少40%抑制IOnM亲吻肽刺激而鉴定所述测试化合物或分子；更优选地，可达到至少50%或60%或70%或80%或90%或100%抑制。
[0357]例如，能够达到40%或以下地抑制IOnM亲吻肽刺激的化合物不被认为是拮抗剂。能够达到40%至80%地抑制IOnM亲吻肽刺激的化合物可以被认为是“弱”拮抗剂。能够达到80%或以上地抑制IOnM亲吻肽刺激的化合物可以被认为是“强”拮抗剂。
[0358]优选地，本发明第九方面的方法还包括以下步骤或由以下步骤组成:根据本文描述的方法或本领域中已知的方法，制备或合成在步骤(iv)中鉴定为亲吻肽拮抗剂的化合物或分子。
[0359]更优选地，所述方法还包括以下步骤或由以下步骤组成:根据在此描述的方法或本领域中已知的方法，将本发明第九方面鉴定的化合物或分子(或合成的化合物或分子)配制成药物组合物或药物。
[0360]本发明更涉及以下1-72项:
[0361]1.亲吻肽拮抗剂在制备用于治疗个体中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症的药物中的用途。
[0362]2.亲吻肽拮抗剂，其用于治疗个体中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症。[0363]3.包含以下序列的肽分子或者其片段或变体用于治疗患者中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症的用途，或者在制备用于治疗患者中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症的药物中的用途，所述序列为:
[0364]X1-GZW-X2-R/ (D) R-X3
[0365]其中:
[0366]X1为F或A或任意D-氨基酸残基；
[0367]X2为L或A或任意D-氨基酸残基；
[0368]X3 为 F 或 W ;且
[0369]其中所述肽分子的C-末端氨基酸残基包含去除该残基上的电荷的基团z ；
[0370]并且其中所述肽序列不为:
[0371]F-G-L-R-F ；
[0372]F-G-L-R-W ;或
[0373]F-G-(D) F-R-F。
[0374]4.根据项3所述的用途，其中所述肽序列不为:
[0375]F-G-A-R-W ；
[0376]F-G-L- (D) R-W ；
[0377]F-G-(D)L - R-W ;或
[0378](D) F-G-L-R-W。
[0379]5.根据项3或4所述的用途，其中X1为⑶F。
[0380]6.根据项3至5中任一项所述的用途，其中X2为选自由⑶F、(D) L和(D) W组成的组中的D-氨基酸残基。
[0381]7.根据项3至6中任一项所述的用途，其中所述肽序列选自由下述序列组成的组:
[0382](D)F-W-L-R-W ;或
[0383]F-G-(D) W-R-F。
[0384]8.根据项3至7中任一项所述的用途，其中所述N-末端残基包含去除该残基上的电荷的基团Y。
[0385]9.根据项8所述的用途，其中X1包含去除该残基上的电荷的基团y。
[0386]10.根据项8或9所述的用途，其中基团y选自由下述基团组成的组:乙酰基；三氟乙酰基；环化氨基酸；或在N-末端不带电荷的合成氨基酸。
[0387]11.根据项3至10中任一项所述的用途，其中X3包含去除该残基上的电荷的基团
Zo
[0388]12.根据项3至11中任一项所述的用途，其中所述序列选自由下述序列组成的组:
[0389]I) ac.F-G- (D) F-R-ff.z ；
[0390]11) ac.F_G_ (D) L-R-ff.z ；
[0391 ]III)ac.F-G-L-(D)R-ff.z ；
[0392]IV) ac.F-G-A-R-ff.z ；
[0393]V) ac.A-G-L-R-ff.z ；[0394]VI) ac.(D) F-ff-L-R-ff.z ;或
[0395]VII)ac.F_G_(D)ff-R-F.z。
[0396]13.包含以下序列的肽分子或者其片段或变体用于治疗患者中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症的用途，或者在制备用于治疗患者中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症的药物中的用途，所述序列为:
[0397]Xa-Xb-Xc-N-Xd-Xe-G-Xf-R-F
[0398]其中:
[0399]Xa为Y或任意D-氨基酸残基；
[0400]Xb为N或任意D-氨基酸残基；
[0401 ] Xe为W或任意D-氨基酸残基；
[0402]Xd为G或S或任意D-氨基酸残基；
[0403]Xe 为 F 或(D) W 或(D) L ;
[0404]Xf为W或L或任意D-氨基酸残基；且
[0405]其中所述肽分子的C-末端氨基酸残基包含去除该残基上的电荷的基团z ；
[0406]并且其中所述肽序列不为: [0407]Y-N-W-N-S-F-G-L-R-F ；
[0408](D) Y-(D)N-W-N-S-F-G-W-R-F ；
[0409](D) Y-(D)N-W-N-G-F-G-W-R-F ；
[0410](D) Y- (D) N-W-N-S-F-G- (D) ff-R-F ；或[0411 ] (D) Y-(D)N-ff-N-G-F-G-(D)W-R-F。
[0412]14.根据项13所述的用途，其中XaS选自由(D)F和(D)Y和(D)A组成的组中的
D-氨基酸残基。
[0413]15.根据项13或14所述的用途，其中Xb为选自由(D)A和(D) N组成的组中的D-氨
基酸残基。
[0414]16.根据项13至15中任一项所述的用途，其中当Xa或Xb中的一个为(D)Y时，另一个不为(D) N。
[0415]17.根据项13至16中任一项所述的用途，其中Xa和Xb不都为D-氨基酸残基。
[0416]18.根据项13至17中任一项所述的用途，其中当Xf为(D)W时，Xa为(D)F。
[0417]19.根据项13至18中任一项所述的用途，其中XeS选自由(D) A和(D)W组成的
组中的D-氨基酸残基。
[0418]20.根据项13至19中任一项所述的用途，其中Xd为选自由(D) A和(D)W组成的
组中的D-氨基酸残基。
[0419]21.根据项13至20中任一项所述的用途，其中当Xd为S时，XfS (D)W和/或Xa不为Φ)Υ。
[0420]22.根据项13至20中任一项所述的用途，其中当Xd为S时，Xf为(D)W和/或Xa为 Φ)Α。
[0421]23.根据项13至22中任一项所述的用途，其中Xf为选自由(D) L和(D)W组成的
组中的D-氨基酸残基。
[0422]24.根据项13至23中任一项所述的用途，其中当XlP Xf都为(D)W时，Xa不为φ) 。
[0423]25.根据项13至23中任一项所述的用途，其中当Xe和Xf都为(D)W时，Xa为(D)A0
[0424]26.根据项13至25中任一项所述的用途，其中所述N-末端残基包含去除该残基上的电荷的基团y。
[0425]27.根据项26所述的用途，其中X1包含去除该残基上的电荷的基团y。
[0426]28.根据项26或27所述的用途，其中基团y选自由以下基团组成的组:乙酰基；三氟乙酰基；环化氨基酸；或在N-末端不带电荷的合成氨基酸。
[0427]29.根据项13至28中任一项所述的用途，其中所述肽分子的C-末端F残基包含去除该残基上的电荷的基团z。
[0428]30.根据项13至29中任一项所述的用途，其中所述序列选自由以下序列组成的组:
【权利要求】
1.亲吻肽拮抗剂在制备用于治疗个体中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症的药物中的用途。
2.亲吻肽拮抗剂，其用于治疗个体中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症。
3.包含以下序列的肽分子或者其片段或变体用于治疗患者中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症的用途，或者在制备用于治疗患者中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症的药物中的用途，所述序列为:
X1-GZW-X2-R/ (D) R-X3
其中: X1为F或A或任意D-氨基酸残基； X2为L或A或任意D-氨基酸残基； X3为F或W ;且 其中所述肽分子的C-末端氨基酸残基包含去除该残基上的电荷的基团z ； 并且其中所述肽序列不为:
F-G-L-R-F ； F-G-L-R-W ;或 F-G-(D)F-R-F。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述肽序列不为:`
F-G-A-R-W ；
F-G-L-(D)R-W ；
F-G- (D) L - R-W ;或
(D)F-G-L-R-W。
5.根据权利要求3或4所述的用途，其中X1为(D)F。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的用途，其中X2为选自由⑶F、(D)L和(D)W组成的组中的D-氨基酸残基。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的用途，其中所述肽序列选自由下述序列组成的组:
(D) F-W-L-R-W ;或
F-G-(D)W-R-F0
8.根据权利要求3至7中任一项所述的用途，其中所述N-末端残基包含去除该残基上的电荷的基团y。
9.根据权利要求8所述的用途，其中X1包含去除该残基上的电荷的基团y。
10.根据权利要求8或9所述的用途，其中基团y选自由下述基团组成的组:乙酰基；三氟乙酰基；环化氨基酸；或在N-末端不带电荷的合成氨基酸。
【文档编号】A61P35/00GK103495154SQ201310349596
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2008年10月8日 优先权日:2007年10月8日
【发明者】罗伯特·彼得·米勒, 安东尼娅·凯瑟琳·罗思韦尔 申请人:医药研究委员会