一种通经草提取物的制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种通经草提取物的制备方法及其应用。其制备方法是将通经草提取后，通过高速逆流色谱、大孔吸附树脂等色谱纯化技术，得到通经草提取物B、通经草提取物C，将上述通经草提取物B和通经草提取物C按一定比例混合，即为通经草提取物。该通经草提取物，可与药学上可接受的载体或其他适宜赋形剂相结合，按照常规方法制成口服给药剂型，可用于制备预防和治疗糖尿病的药物。
【专利说明】一种通经草提取物的制备方法及其应用
【技术领域】[0001]本发明属于生物医药领域，涉及一种中药材提取物的制备方法及应用，具体是涉及一种通经草提取物的制备方法及其在制备预防和治疗糖尿病药物中的应用。
【背景技术】[0002]随着世界人口的老龄化，糖尿病已经成为一种常见病、多发病，在工业发达国家其发病率呈上升趋势。据统计，全世界约有1.5亿糖尿病患者，80%为非胰岛素依赖型糖尿病(2型)，其中我国约有3000万。由糖尿病并发症引起的死亡人数在发达国家已是继心脑血管疾病、癌症之后列第三位，引起了世界各国的高度重视，纷纷对糖尿病的发病机制、药物防治等进行研究。由于I型糖尿病病因已基本明确，只需补充胰岛素即可，而2型糖尿病则较复杂，目前我国医学界对其采取的是包括饮食疗法、药物治疗与其它辅助疗法的综合治疗措施。西药虽然层出不穷，但不能从根本上解决问题，而且西药治疗具有一定的副作用及“治疗失效”。中医药治疗糖尿病历史悠久，临床经验丰富，疗效显著，已成为近年来国内外研究热点。中医学对糖尿病的认识与西医不同，中医强调整体观，以阴、阳二者的变化反映疾病的本质。正常机体是“阴平阳秘”，阴阳平衡，即机体内环境维持稳态，糖代谢也维持稳定；并且中药的毒副作用相对较小，病人可长期服用，这是西药所不能比拟的独特的优势。[0003]通经草系中国蕨科植物银粉背蕨(Aleuritopteris argentea (Gmel.) Fee)的干燥全草。秋季采收，除去杂质晒干。收载于1998年《中华人民共和国卫生部药品标准蒙药分册》。其性平，味微苦，具有明目、愈伤、止血、活血调经、止咳、利湿、解毒消肿等功效，可用于目赤、视力减退、胸伤、骨伤、肺痨咳嗽、吐血。为我国藏蒙等少数民族地区的常用药物。但有关通经草的基础研究尚十分有限，使该药材的后续推广和应用受到限制。现代研究表明，通经草含有粉背蕨酸(alepterolic acid),鹿糖(sucrose)和黄酮类化合物,其他化学成分不详；药理作用研究表明，通经草黄酮是一种天然有效的自由基清除剂通经草黄酮对羟基自由基、超氧阴离子自由基、过氧化氢具有很强的清除作用，其EC5tl分别为0.0099,0.0060和0.0190mg/mL，且呈浓度依赖关系，其他药理作用未见报道。[0004]专利申请号为CN96102241.8的专利公开了一种治疗肝胆结石和抗复发的特效药物组方，其中含有通经草。专利申请号为CN200310110176.4的专利申请公开了公开了一种治疗鼻窦炎的药物组方，其中含有通经草。专利申请号为CN200310110531.8的专利公开了一种用于治疗再生障碍性贫血的中草药剂，其由回生草、神仙草、通经草等近20种中草药经水熬煮加白酒配制而成。专利申请号为CN97107327.9的专利公开了一种治疗妇女痛经的中草药，配方的组成包括:通经草、苍术、鸡内金等。专利申请号为CN201210440734.2的专利公开了一种治疗儿童急性良性肌炎的药物，其原料配方和重量配比为:通经草6~10份，丝瓜络8~15份，走马风8~15份等。专利申请号为CN201210462718.3的专利公开了一种治疗乳房疾病的药物，其特征在于组分和重量配比是:通经草1:灯笼草2:白术1.5等。[0005]上述文献及专利等，尚未见通经草或通经草提取物用于制备预防和治疗糖尿病药物的报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种通经草提取物的制备方法及其应用，尤其是在制备预防和治疗糖尿病药物中的应用。
[0007]本发明所用通经草为中国蕨科植物银粉背蕨(Aleuritopteris argentea(Gmel.)Fee)的干燥全草。
[0008]通经草提取物的制备方法，其特征在于按以下步骤制备:
(1)通经草，用浓度0-90%乙醇作为溶剂，在20°C-80°C温浸提取，提取次数为1-3次，每次提取时间为1-4小时，每次溶剂用量为通经草重量的6-15倍；滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，得通经草提取物A ；
(2)将步骤(1)得到的通经草提取物A加5-20倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A；将沉淀A，采用高速逆流色谱法，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(2:2:3:2)为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，即得到通经草提取物B ；
(3)将步骤(2)得到的药液A，通过大孔吸附树脂，用水洗脱，再用浓度10%-70%的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集不同浓度乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩干燥，即得通经草提取物C ；
(4 )将上述通经草提取物B和通经草提取物C按一定比例混匀，即得本发明的通经草提取物。
[0009]本发明所述的通经草提取物的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)所采用的大孔吸附树脂为X-5大孔吸附树脂、LSA-40大孔吸附树脂、AB-8大孔吸附树脂、HPD600大孔吸附树脂、D301R大孔吸附树脂、NKA大孔吸附树脂、ADS-8大孔吸附树脂。
[0010]通经草提取物的制备方法，其特征在于按以下步骤制备:
(1)通经草，用浓度70%乙醇作为溶剂，在70°C温浸提取，提取次数为2次，每次提取时间为I小时，每次溶剂用量为通经草重量的10倍；滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，得通经草提取物A ;
(2)将步骤(1)得到的通经草提取物A加20倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A;将沉淀A，采用高速逆流色谱法(HSCCC)，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(2:2:3:2)为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，即得到通经草提取物B ；
(3)将步骤(2)得到的药液A，通过HPD600大孔吸附树脂柱，用水洗脱，再用浓度10%-70%的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集不同浓度乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩干燥，即得通经草提取物C ；
(4)将上述通经草提取物B和通经草提取物C混匀，即得本发明的通经草提取物。[0011]本发明所述的通经草提取物的制备方法，其特征在于:所述的通经草提取物B在通经草提取物中的含量为质量分数10%-90%。所述的通经草提取物B主要含有:昆虫蜕皮激素(insect moulting hormones);粉背厳酸(alepterolic acid) ;ent_2_β-hydroxyl-16-ene-kaurdn-19-oic acid ；8 (17),13 (E)-labdadien-15,19-dioic acid ；methyl 8(17),13(E)-labdadien-19-oic acid-15-oate ; 15_acetoxy-8 (17),13 (E)-labdad1-en-19-oicacid ；15-hydroxy-8(17),13(E)-labdadien-19-oic acid；8(17),13(E)-labdadien-15,19-diol ；19-hydroxy-8(17),13(E)-labdadien-15-al ；19-hydroxy-8(17),13 (Z)-labdadien-15-al ;8 (17)，13 (E)-labdadien-19_oic acid-15-al ；8 (17),13 (Z)-labda-dien-19-oie acid-15-al ； 16 β-hydroxy-17-[(Z)-p-cotunaroyl] -ent-kauran-19—oic acid ； 19-hydroxyl-17-nor-16-ene_kauranone ;ent_16a， 17 ,19-trihydroxylkaurane ;ent_16 a，17-dihydroxy l-kauran-19-oic acid 等成分。其中半日花烷型二萜类成分在通经草提取物B中的含量为质量分数30%-70%。
[0012]本发明所述的通经草提取物的制备方法，其特征在于:所述的通经草提取物C在通经草提取物中的含量为质量分数15%-80%。所述的通经草提取物C主要含有:金粉蕨素(Onychin);金粉蕨素 _2’ -O-葡萄糖苷(onychin-2’ _0_β -D-glucoside)；金粉蕨素_2’-O-阿洛糖苷(onychin-2’-O-β-D-al1side);高山金粉蕨甲素；高山金粉厳乙素；浅裂鱗毛厳素 A (2 (R) -5, 7, 3’ - trihydroxy-6, 8-dimethyl_5’ -methoxynavanone-7-O- β -D-glucopyranosid);浅裂鱗毛厳素 B (2 (R) -5, 7, 3，-trihydroxy-6, 8_dimethyl-5'-methoxvnavanone-7-0-[6’ ’ -0-(3’ ’ ’-hydroxy-3' ’ ’-methylglutaryI)]-β -D-glucopyranoside);浅裂鱗毛厳素 C (2 (R) -5, 7, 3，-trihydroxy-6, 8-dimethyl_5，_methoxvnavanone-7-0-[6' ' _0[5，' ' -butoxyl-(3'' ' -hydroxy-3' '' -methylglutaryl)]]-β-D-glucopyranoside);荚果蕨素(5，7- 二羟基_6，8- 二甲基-4-甲氧基-二氢黄酮)，去甲氧基荚果蕨素(5，7- 二羟基-6，8- 二甲基-二氢黄酮)；橙皮苷；柚皮苷；圣草素；木犀草素-7-0- β -D-葡萄糖 苷；2，7- 二甲氧基桷皮素；槲皮素-3-0- β -D-葡葡萄糖苷；槲皮素-7，3-二-O-β-D-葡葡萄糖苷；木犀草素。其中金粉蕨素等二氢黄酮及二氢黄酮苷类成分在通经草提取物C中的含量为质量分数40%-80%。
[0013]本发明的通经草有提取物，通过加入药剂学允许的各种辅料，制成药剂学上的片剂、颗粒剂、胶囊剂等口服剂型。
[0014]本发明的通经草提取物在制备预防和治疗糖尿病药物中的应用。
[0015]本发明的通经草提取物Α、通经草提取物B、通经草提取物C，在制备预防和治疗糖尿病药物中的应用。
[0016]本发明是以中国蕨科植物银粉背蕨(Aleuritopteris argentea (Gmel.) Fee)的干燥全草为原料提取制备的提取物。本发明首次探索研究并分离得到了通经草具有降糖活性的提取物，包括通经草提取物B和通经草提取物C，二者按一定比例混合即得本发明的通经草提取物。制备工艺操作简便，生产成本低，适于工业化大生产。本发明制备降血糖的中药制剂，质量可控，疗效确切，安全性高。
[0017]本发明提供的通经草提取物，通过观察对链脲霉素性大鼠糖尿病的治疗作用，结果表明，通经草提取物对STZ-DM大鼠糖代谢有明显的改善作用，对葡萄糖引起的血糖升高有明显的拮抗作用；对STZ-DM大鼠血脂代谢障碍有明显的改善作用，表现在血CH0，TG，LDL水平的降低，HDL水平的升高；对STZ-DM大鼠血MDA水平有显著的降低作用，表明本品有一定的抗氧化作用；对链脲霉素造成胰岛细胞损伤有一定的修复作用。通经草提取对正常大鼠的空腹血糖和血清胰岛素没有明显的影响，对正常大鼠的血脂代谢亦没有显著的影响。
[0018]本发明提供的通经草提取物制成的片剂，临床治疗糖尿病患者，有效率84.4%。
【具体实施方式】
[0019]下面通过具体实验例和实施例对通经草提取物的制备方法及其应用做进一步说明但不限于本发明。
[0020]实施例1:通经草提取物及单体化合物制备
通经草20kg，置提取罐中，加70%乙醇10倍量，70°C提取二次，每次I小时，合并提取液，回收乙醇，滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，得通经草提取物AeiOOg ;将通经草提取物A6100g，加20倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A。将沉淀A，采用高速逆流色谱法(HSCCC)，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(2:2:3:2)为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，即得到通经草提取物B250g ;药液A，通过HPD600大孔吸附树脂柱，用水洗脱2BV (树脂柱体积)，再用浓度10-70%的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得通经草提取物C1250g。将通经草提取物B20g和通经草提取物ClOOg混匀，即得通经草提取物。
[0021]如上所述方法制备通经草提取物B，再经200-300目硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱(10:1-3:1)，薄层跟踪检测，合并相同流份，静置析晶，抽滤，石油醚-丙酮(1:2)重结晶，分别得到昆虫脱皮激素(insect moultinghormones)；粉背厳酸(alepterolic acid) ;ent_2_β-hydroxyl-16-ene_kaurdn-19-oic acid ;8 (17), 13 (E)-labdadien_15,19-dioic acid ；methyl 8(17),13 (E)-labdadien-19-oic acid-15-oate ; 15_acetoxy-8 (17),13(E)-labdad1-en-19-oicacid ； 15-hydroxy-8(17)，13(E)-labdadien-19-oic acid ;8 (17)，13 (E)-labdadien-15,19-diol ；19-hydroxy-8(17), 13 (E)-labdadien-15-al ；19-hydroxy-8(17),13 (Z)-labdadien-15-al ;8 (17)，13 (E)-labdadien-19_oic acid-15-al ；8 (17),13 (Z)-labda-dien-19-oie acid-15-al ； 16 β-hydroxy-17-[(Z)-p-cotunaroyl] -ent-kauran-19—oic acid ； 19-hydroxyl-17-nor-16-ene_kauranone ;ent_16a， 17 ,19-trihydroxylkaurane ;ent_16 a，17-dihydroxy l-kauran-19-oic acid 等成分，以上各化合物的化学结构均经质谱和核磁共振等波谱手段确证，纯度经高效液相色谱检测均大于98%。含量经高效液相色谱检测粉背蕨酸等半日花烷型二萜类成分在通经草提取物B中的含量为质量分数55%。
[0022]如上所述方法制备通经草提取物C，再经200-300目硅胶柱层析，以三氯甲烷_甲醇梯度洗脱(100:1-3:1)，薄层跟踪检测，合并相同流份，静置析晶，抽滤，甲醇重结晶，分别得到金粉蕨素(Onychin);金粉蕨素 _2’-O-葡萄糖苷(onychin-2’-O-β-D-glucoside)；金粉蕨素_2’-O-阿洛糖苷(onychin-2’-O-β-D-al1side);高山金粉蕨甲素；高山金粉蕨乙素;浅裂鳞毛蕨素 A (2 (R) -5, 7, 3’ - trihydroxy-6, 8-dimethyl_5’ -methoxynavanone-7-0- β -D-glucopyranosid);浅裂鱗毛厳素 B (2 (R) -5, 7, 3，-trihydroxy-6, 8_dimethyl-5'-methoxvnavanone-7-0-[6''-0- (3' ' '-hydroxy-3'' ' -methylglutaryl)]-β -D-glucopyranoside);浅裂鱗毛厳素 C (2 (R) -5, 7, 3，-trihydroxy-6, 8-dimethyl_5，_methoxvnavanone-7-0-[6'，_0[5，，，-butoxyl-(3，，，-hydroxy-3'，，-methylglutaryl)]]-β-D-glucopyranoside);荚果蕨素(5，7- 二羟基_6，8- 二甲基-4-甲氧基-二氢黄酮)，去甲氧基荚果蕨素(5，7- 二羟基-6，8- 二甲基-二氢黄酮)；橙皮苷；柚皮苷；圣草素；木犀草素-7-0- β -D-葡萄糖苷；2，7- 二甲氧基桷皮素；槲皮素-3-0- β -D-葡葡萄糖苷；槲皮素-7，3- 二 -O-β -D-葡葡萄糖苷；木犀草素等成分，以上各化合物的化学结构均经质谱和核磁共振等波谱手段确证，纯度经高效液相色谱检测均大于98%。含量经高效液相色谱检测金粉蕨素等二氢黄酮及二氢黄酮苷类成分在通经草提取物C中的含量为质量分数50%。
[0023]实施例2:通经草提取物及单体化合物制备 (1)通经草2kg，置提取罐中，用水作为溶剂，在80°C温浸提取，提取次数为I次，提取时间为4小时，每次溶剂用量为药材重量的15倍；滤过，合并提取液，浓缩，干燥，得通经草提取物A;
(2)将步骤(1)得到的提取物A加5倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A。将沉淀A，采用高速逆流色谱法(HSCCC)，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(2:2:3:2)为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，即得到通经草提取物B ；
(3)将步骤(2)得到的药液A，通过NKA大孔吸附树脂柱，用水洗脱，再用浓度10-70%的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得通经草提取物C ；
(4 )将上述通经草提取物B和通经草提取物C按一定比例混匀，即得本发明的通经草提取物，其中通经草提取物B占20%，通经草提取物C占80%。
[0024]如上所述方法制备通经草提取物B，再经200-300目硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱(10:1-3:1)，薄层跟踪检测，合并相同流份，静置析晶，抽滤，石油醚-丙酮(1:2)重结晶，分别得到昆虫脱皮激素(insect moultinghormones)；粉背厳酸(alepterolic acid) ;ent_2_β-hydroxyl-16-ene_kaurdn-19-oic acid ；8(17),13 (E)-labdadien-15,19-dioic acid ；methyl 8(17),13 (E)-labdadien-19-oic acid-15-oate ; 15_acetoxy-8 (17),13(E)-labdad1-en-19-oicacid ； 15-hydroxy-8(17)，13(E)-labdadien-19-oic acid ;8 (17)，13 (E)-labdadien-15,19-diol ；19-hydroxy-8(17) , 13 (E)-labdadien-15-al ；19-hydroxy-8(17),13 (Z)-labdadien-15-aI ;8 (17)，13 (E)-labdadien-19_oic acid-15-al ；8 (17),13 (Z)-labda-dien-19-oie acid-15-al ； 16 β-hydroxy-17-[(Z)-p-cotunaroyl] -ent-kauran-19—oic acid ； 19-hydroxyl-17-nor-16-ene_kauranone ;ent_16a， 17 ,19-trihydroxylkaurane ；ent-16 a , 17-dihydroxy l-kauran-19-oic acid 等成分，以上各化合物的化学结构均经质谱和核磁共振等波谱手段确证，纯度经高效液相色谱检测均大于98%。含量经高效液相色谱检测粉背蕨酸等半日花烷型二萜类成分在通经草提取物B中的含量为质量分数30%。
[0025]如上所述方法制备通经草提取物C，再经200-300目硅胶柱层析，以三氯甲烷_甲醇梯度洗脱(100:1-3:1)，薄层跟踪检测，合并相同流份，静置析晶，抽滤，甲醇重结晶，分别得到金粉蕨素(Onychin);金粉蕨素 _2’-O-葡萄糖苷(onychin-2’-O-β-D-glucoside)；金粉蕨素_2’-O-阿洛糖苷(onychin-2’-O-β-D-al1side);高山金粉蕨甲素；高山金粉蕨乙素;浅裂鳞毛蕨素 A (2 (R) -5, 7, 3’ - trihydroxy-6, 8-dimethyl_5’ -methoxynavanone-7-0- β -D-glucopyranosid);浅裂鱗毛厳素 B (2 (R) -5, 7, 3，-trihydroxy-6, 8_dimethyl-5' -methoxvnavanone-7-0- [6' ' -0- (3' ' ' -hydroxy-3' ' ' -methylglutaryl)]-β -D-glucopyranoside);浅裂鱗毛厳素 C (2 (R) -5, 7, 3，-trihydroxy-6, 8-dimethyl_5，_methoxvnavanone-7-0-[6'，_0[5，，，-butoxyl-(3，，，-hydroxy-3'，，-methylglutaryl)]]-β-D-glucopyranoside);荚果蕨素(5，7- 二羟基_6，8- 二甲基-4-甲氧基-二氢黄酮)，去甲氧基荚果蕨素(5，7- 二羟基-6，8- 二甲基-二氢黄酮)；橙皮苷；柚皮苷；圣草素；木犀草素-7-0- β -D-葡萄糖苷；2，7- 二甲氧基桷皮素；槲皮素-3-0- β -D-葡葡萄糖苷；槲皮素-7，3- 二 -O-β -D-葡葡萄糖苷；木犀草素等成分，以上各化合物的化学结构均经质谱和核磁共振等波谱手段确证，纯度经高效液相色谱检测均大于98%。含量经高效液相色谱检测金粉蕨素等二氢黄酮及二氢黄酮苷类成分在通经草提取物C中的含量为质量分数80%。
[0026]实施例3:通经草提取物及单体化合物制备
(1)通经草5kg，置提取罐中，用浓度为90%作为溶剂，在20°C温浸提取，提取次数为3次，每次提取时间为I小时，每次溶剂用量为药材重量的6倍；滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，得通经草提取物A ；
(2)将步骤(1)得到的提取物A加20倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A。将沉淀A，采用高速逆流色谱法(HSCCC)，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(2:2:3:2)为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，即得到通经草提取物B ；
(3)将步骤(2)得到的药液A，通过AB-8大孔吸附树脂柱，用水洗脱，再用浓度10-70%的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得通经草提取物C ;
(4)将上述通经草提取物B和通经草提取物C按一定比例混匀，即得本发明的通经草提取物，其中通经草提取物B占85%，通经草提取物C占15%。
[0027]如上所述方法制备通经草提取物B，再经200-300目硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱(10:1-3:1)，薄层跟踪检测，合并相同流份，静置析晶，抽滤，石油醚-丙酮(1:2)重结晶，分别得到昆虫脱皮激素(insect moultinghormones)；粉背厳酸(alepterolic acid) ;ent_2_β-hydroxyl-16-ene_kaurdn-19-oic acid ；8(17),13 (E)-labdadien-15,19-dioic acid ；methyl 8(17),13 (E)-labdadien-19-o ic acid-15-oate ; 15_acetoxy-8(17),13(E)-labdad1-en-19-oicacid ； 15-hydroxy-8(17),13(E)-labdadien-19-oic acid ；8 (17),13 (E)-labdadien-15,19-diol ；19-hydroxy-8(17),13(E)-labdadien-15-al ；19-hydroxy-8(17),13 (Z)-labdadien-15-aI ;8 (17)，13 (E)-labdadien-19_oic acid-15-al ；8 (17),13 (Z)-labda-dien-19-oie acid-15-al ； 16 β-hydroxy-17-[(Z)-p-cotunaroyl] -ent-kauran-19—oic acid ； 19-hydroxyl-17-nor-16-ene_kauranone ;ent_16a， 17 ,19-trihydroxylkaurane ；ent-16 a , 17-dihydroxy l-kauran-19-oic acid 等成分，以上各化合物的化学结构均经质谱和核磁共振等波谱手段确证，纯度经高效液相色谱检测均大于98%。含量经高效液相色谱 检测粉背蕨酸等半日花烷型二萜类成分在通经草提取物B中的含量为质量分数70%。
[0028]如上所述方法制备通经草提取物C，再经200-300目硅胶柱层析，以三氯甲烷_甲醇梯度洗脱(100:1-3:1)，薄层跟踪检测，合并相同流份，静置析晶，抽滤，甲醇重结晶，分别得到金粉蕨素(Onychin);金粉蕨素 _2’-O-葡萄糖苷(onychin-2’-O-β-D-glucoside)；金粉蕨素_2’-O-阿洛糖苷(onychin-2’-O-β-D-al1side);高山金粉蕨甲素；高山金粉蕨乙素;浅裂鳞毛蕨素 A (2 (R) -5, 7, 3’ - trihydroxy-6, 8-dimethyl_5’ -methoxynavanone-7-0- β -D-glucopyranosid);浅裂鱗毛厳素 B (2 (R) -5, 7, 3，-trihydroxy-6, 8_dimethyl-5'-methoxvnavanone-7-0-[6' '-0- (3' ' ' -hydroxy-3'' ' -methylglutaryl)]-β -D-glucopyranoside);浅裂鱗毛厳素 C (2 (R) -5, 7, 3，-trihydroxy-6, 8-dimethyl_5，_methoxvnavanone-7-0-[6'，_0[5，，，-butoxyl-(3，，，-hydroxy-3'，，-methylglutaryl)]]-β-D-glucopyranoside);荚果蕨素(5，7- 二羟基_6，8- 二甲基-4-甲氧基-二氢黄酮)，去甲氧基荚果蕨素(5，7- 二羟基-6，8- 二甲基-二氢黄酮)；橙皮苷；柚皮苷；圣草素；木犀草素-7-0- β -D-葡萄糖苷；2，7- 二甲氧基桷皮素；槲皮素-3-0- β -D-葡葡萄糖苷；槲皮素-7，3- 二 -O-β -D-葡葡萄糖苷；木犀草素等成分，以上各化合物的化学结构均经质谱和核磁共振等波谱手段确证，纯度经高效液相色谱检测均大于98%。含量经高效液相色谱检测金粉蕨素等二氢黄酮及二氢黄酮苷类成分在通经草提取物C中的含量为质量分数40%。
[0029]实施例4:通经草提取物片剂的制备
取上述实施例1通经草提取物305g，加入60g淀粉，混匀，制粒，过筛，加15g微晶纤维素，0.5g硬脂酸镁，混匀，压制成1000片，即得通经草提取物片剂。
[0030]实施例5:通经草提取物颗粒剂的制备
取上实施例2通经草提取物285g，加入糊精150g，混匀，制粒，整粒，过筛，制成颗粒，即得通经草提取物颗粒剂。
[0031]实施例6:通经草提取物胶囊剂的制备
取上述实施例3通经草提取物300g，加入50g淀粉，混匀，制粒，过筛，加0.5g硬脂酸镁，混匀，装胶囊，即得通经草提取物胶囊剂。
[0032]实验例1:通经草提取物对链脲霉素糖尿病大鼠的治疗作用
链脲霉素糖尿病动物模型造模:将链脲霉素(STZ)溶于0.1 mol/L柠檬酸缓冲液(pH4.5)中，临用前配制。大鼠常用量为60-80 mg/kg (ip或iv)。一次足量给予动物链脲霉素，造成β细胞大量损 伤，胰岛素合成和分泌减少，引起糖代谢紊乱，导致糖尿病。将STZ溶液用0.1 mol/L无菌枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液新鲜配制成2%溶液，调节pH至4.5，滤菌器过滤除菌。大鼠禁食IOh按50-65 mg/kg体重腹腔内或尾静脉一次性注射STZ溶液，24h内随机血糖≥16.7 mmol/L,稳定5d即可作为成功模型。
[0033]药物:通经草提取物A、通经草提取物B、通经草提取物C、通经草提取物(实施例1方法制备，批号分别为:20120912、20120913、20120914、20120910)。药物配制:研成粉末，各取200mg溶于40ml蒸懼水中，制成混悬液。
[0034]阳性药:降糖灵，山东省医药工业研究所制药厂出品，批号120115.优降糖，山东省医药工业研究所制药厂出品，批号120136。链脲霉素(STREPTOZOCIN，STZ)，规格:lg/瓶，批号:015K1279, SIGMA 公司。
[0035]仪器:日本京都II型GLUC0CAR0血糖仪，全自动生化测定仪，美国产12孔gamma-放免测定仪。
[0036]试剂:京都血糖仪所用血糖电极片、全自动生化仪所用血脂试剂，天津德普公司(DPC)提供的胰岛素放免试剂盒。
[0037]动物:Wistar大鼠，购于山东省实验动物中心。合格证号:鲁动质120101。
[0038]链脲霉素糖尿病大鼠的试验:取上述Wistar大鼠280只，雌雄各半，体重160-200g。稳定饲料lw，期间取血测空腹血糖2次，以3.6-5.4mmol/L为入选动物标准。其中40只作为正常对照备用。其余240只用链脲霉素(STZ)造模，造模后7-10d复测空腹血糖，以大于13.8mmol/L作为模型成功大鼠。
[0039]将链脲霉素性糖尿病(STZ-DM)大鼠60只随机分为造模，通经草提取物A、通经草提取物B、通经草提取物C、通经草提取物、降糖灵共6组，每组各10只，并设正常对照组10只。通经草提取物A组、通经草提取物B组、通经草提取物C组、通经草提取物组，均按生药量0.5g/kg给药,降糖灵组9 mg/kg给药,连续口服葡萄糖耐量试验(1.5 g/kg),尾静脉取血分别测空腹、口服葡萄糖后30min,60min,90min, 120min的血糖水平,计算空腹血糖及葡萄糖灌胃后60min血糖区线面积(AUC)。
[0040]另取STZ-DM大鼠60只，分组、给药剂量和方法同前。试验前禁食8h，末次给药后12h,空腹眶静脉取血检测胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)水平。
[0041]另取STZ-DM大鼠60只，分组、给药剂量和方法同前。试验前禁食8h，末次给药后12h,空腹眶静脉取血，按文献TCA-TBA法，于波长535nm检测样品吸收值，以反映MDA水平。
[0042]另取STZ-DM大鼠60只，分组、给药剂量和方法同前。试验前禁食8h，末次给药后12h，按口服葡萄糖耐量试验(1.5 g/kg)方法进行，尾静脉取血分别测空腹、口服葡萄糖后30min,60min, 120min的胰岛素水平,之后将动物处死,迅速取胰腺固定,进行病理学检查。
[0043]正常大鼠的试验:取上述Wistar大鼠120只，雌雄各半，体重160_200g。稳定饲料lw，期间取血测空腹血糖2次，以3.6-5.4mmol/L为入选动物标准。然后随机分为正常，通经草提取物A、通经草提取物B、通经草提取物C、通经草提取物，降糖灵共6组。通经草提取物A组、通经草提取物B组、通经草提取物C组、通经草提取物组，均按生药量0.5g/kg给药，降糖灵组1.35mg/kg给药，连续给药20d。正常对照组给等体积水灌胃。试验前禁食8h，末次给药后12h，空腹每组各10只尾静脉取血测血糖、胰岛素水平；每组各10只眶静脉取血测血脂水平。
[0044]试验结果:
(I)通经草各提取物对STZ-DM大鼠糖代谢的影响表1结果可见，通经草各提取物对STZ-DM大鼠空腹血糖升高有明·显的降低作用，与造模组比较均有极显著差异。表1结果表明，通经草各提取物对STZ-DM大鼠糖代谢有显著的改善作用，对葡萄糖引起的血糖升高有显著的降低作用，明显降低血糖区线面积，与造模组比较均有极显著差异。其对STZ-DM大鼠葡萄糖耐量的影响见表2。
[0045]表1通经草各提取物对STZ-DM大鼠空腹血糖的影响(mmol/L)
【权利要求】
1.一种通经草提取物的制备方法及其应用，所述通经草提取物的制备方法，其特征在于按以下步骤制备: (1)通经草，用浓度0-90%乙醇作为溶剂，在20°C-80°C温浸提取，提取次数为1-3次，每次提取时间为1-4小时，每次溶剂用量为通经草重量的6-15倍；滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，得通经草提取物A ； (2)将步骤(1)得到的通经草提取物A加5-20倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A；将沉淀A，采用高速逆流色谱法，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(2:2:3:2)为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，即得到通经草提取物B ； (3)将步骤(2)得到的药液A，通过大孔吸附树脂，用水洗脱，再用浓度10%-70%的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集不同浓度乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩干燥，即得通经草提取物C ； (4)将上述通经草提取物B和通经草提取物C按一定比例混匀，即得本发明的通经草提取物。
2.根据权利要求1所述的通经草提取物的制备方法，其特征在于按以下步骤制备: (1)通经草，用浓度70%乙醇作为溶剂，在70°C温浸提取，提取次数为2次，每次提取时间为I小时，每次溶剂用量为通经草重量的10倍；滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，得通经草提取物A ; (2)将步骤(1)得到的通经草提取物A加20倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A;将沉淀A，采用高速逆流色谱法(HSCCC)，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(2:2:3:2)为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，即得到通经草提取物B ； (3)将步骤(2)得到的药液A，通过HPD600大孔吸附树脂柱，用水洗脱，再用浓度10%-70%的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集不同浓度乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩干燥，即得通经草提取物C ； (4)将上述通经草提取物B和通经草提取物C混匀，即得本发明的通经草提取物。
3.根据权利要求1所述的通经草提取物的制备方法，其特征在于:所述的通经草提取物B在通经草提取物中的含量为质量分数10%-90%。
4.根据权利要求1所述的通经草提取物的制备方法，其特征在于:所述的通经草提取物B主要含有:昆虫脱皮激素(insect moulting hormones);粉背蕨酸(alepterolic acid) ;ent_2_β-hydroxyl-16-ene-kaurdn-19_oic acid ；8(17),13(E)-labdadien-15,19-dioic acid ;methyl 8(17),13(E)-labdadien-19_oicacid-15-oate ;15_acetoxy-8 (17) , 13 (E)-labdad1-en-19-oic acid ；15-hydroxy-8(17)，13(E)-labdadien-19-oic acid ；8 (17)，13 (E)-labdadien-15，19-diol ；19-hydroxy-8(17),13(E)-labdadien-15-al ；19-hydroxy-8(17),13 (Z)-labdadien-15-al ;8 (17)，13 (E)-labdadien-19_oic acid-15-al ；8 (17),13(Z)-labda-dien-19-oie acid-15-al ； 16 β-hydroxy-17-[(Z)-p-cotunaroyl] _ent-kauran-19—oic acid ; 19-hydroxyl-17-nor-16-ene_kauranone ;ent_16a， 17 ,19-trihydroxy lkaurane ;ent_16 a，17-dihydroxy l-kauran-19-oic acid;其中半日花烧型二萜类成分在通经草提取物B中的含量为质量份数30%-70%。
5.根据权利要求1、权利要求2 所述的通经草提取物的制备方法，其特征在于:所述的通经草提取物C在通经草提取物中的含量为质量分数15%-80%。
6.根据权利要求1、权利要求2所述的通经草提取物的制备方法，其特征在于:所述的通经草提取物C主要含有:金粉蕨素(Onychin);金粉蕨素-2’-0-葡萄糖苷(onychin-2，-O-β-D-glucoside);金粉蕨素-2’-O-阿洛糖苷(onychin-2’-O-β-D-alloside);高山金粉蕨甲素；高山金粉蕨乙素；浅裂鳞毛蕨素A(2(R)-5, 7, 3’- trihydroxy-6, 8-dimethyl_5’-methoxynavanone-7-O-β -D-glucopyranosid);浅裂鱗毛厳素 B (2 (R) -5, 7, 3，-trihydroxy-6, 8-dimethyl_5，-methoxvnavanone-7-0-[6，，_0_(3，，，-hydroxy-3，，，-methylglutaryl)]_ β -D-glucopyranoside)；浅裂鱗毛厳素 C (2 (R) -5, 7, 3，-trihydroxy-6, 8-dimethyl_5，-methoxvnavanone-7-0- [6'，_0[5' ' ' -butoxyl-(3' ' ' -hydroxy-3' ' ' -methylglutaryl)]]-β -D-glucopyranoside)；荚果蕨素(5，7- 二羟基-6，8- 二甲基-4-甲氧基-二氢黄酮)，去甲氧基荚果蕨素(5，7- 二羟基-6，8- 二甲基-二氢黄酮)；橙皮苷；柚皮苷；圣草素；木犀草素-7-0-β -D-葡萄糖苷；2，7- 二甲氧基桷皮素；槲皮素-3-0- β -D-葡葡萄糖苷；槲皮素-7，3- 二 -O- β -D-葡葡萄糖苷；木犀草素；其中金粉蕨素等二氢黄酮及二氢黄酮苷类成分在通经草提取物C中的含量为质量份数40%-80%。
7.根据权利要求1所述的通经草提取物的制备方法，其特征在于:所采用的大孔吸附树脂为Χ-5大孔吸附树脂、LSA-40大孔吸附树脂、ΑΒ-8大孔吸附树脂、HPD600大孔吸附树月旨、D301R大孔吸附树脂、NKA大孔吸附树脂、ADS-8大孔吸附树脂。
8.根据权利要求1、权利要求2所述的通经草提取物，通过加入药剂学允许的各种辅料，制成药剂学上的片剂、颗粒剂、胶囊剂等口服剂型。
9.根据权利要求1所述的通经草提取物在制备预防和治疗糖尿病药物中的应用。
10.根据权利要求1所述的通经草提取物Α、通经草提取物B、通经草提取物C，在制备预防和治疗糖尿病药物中的应用。`
【文档编号】A61P3/10GK103585192SQ201310525384
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年10月31日 优先权日:2013年10月31日
【发明者】孔倩倩 申请人:济南星懿医药技术有限公司