抑制血管内皮生长因子受体基因表达的脱氧核酶的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抑制血管内皮生长因子受体基因表达的脱氧核酶。所述脱氧核酶包括一个催化功能序列GGCTAGCTACAACGA，及连接在其两端的5’端和3’端结合序列；催化功能序列切割靶序列的任一嘌呤核苷酸与嘧啶核苷酸的连接键，而5’端和3’端结合序列与靶序列切割位点两侧的序列互补。本发明的脱氧核酶以血管表皮生长因子受体1（VEGFR-1）为靶基因，通过特异性切割VEGFR-1的mRNA或pre-mRNA，降低VEGFR-1基因的表达，抑制肿瘤新生血管生成和肿瘤生长。
【专利说明】抑制血管内皮生长因子受体基因表达的脱氧核酶
【技术领域】
[0001]本发明涉及一类靶向肿瘤血管新生血管基因的脱氧核酶，具体地说涉及一类可抑制血管内皮生长因子受体VEGFRl基因表达，抑制肿瘤新生血管生成和肿瘤生长的脱氧核酶。
【背景技术】
[0002]新生血管生成是指从既存的脉管系统上经过多步骤、在多因素的作用下形成的新的血管系统，是促血管形成因子和血管生成抑制因子相互调控的结果。正常情况下二者处于平衡状态，一旦此平衡打破就会激活血管系统，促进血管生成或抑制血管系统。正常的血管生成只在某些特定的生理过程中出现，如胚胎发育、伤口愈合、月经周期等，而异常的血管生成则是肿瘤、免疫系统疾病、动脉粥样硬化等疾病的病理表现之一。
[0003]肿瘤血管不同于正常组织的血管[I]，生长不具可控性，结构异常，分布紊乱，缺乏正常的微循环的功能，但仍具旺盛的提供营养和氧气、排泄废物的能力，是肿瘤生长和转移的病理基础，在肿瘤发生发展中具有重要地位。目前，肿瘤血管已成为肿瘤分子靶向治疗中最重要的靶点。自Folkman首次提出靶向血管生成可以抑制肿瘤生长成为一种治疗方式以来[2]，大量的实验研究与临床实验证实抑制肿瘤介导的血管生成可以有效地抑制肿瘤的生长和转移[3-5]，已有数十个靶向血管的抗癌药物进入临床，他们与放化疗的联合应用显示出良好的应用前景。针对肿瘤血管的靶向治疗主要分为两类[6]，一是抗血管新生制剂(ant1-angiogenic inhibitors, Al),即抑制肿瘤血管的生成,主要作用于肿瘤的早期治疗阶段或者用来预防有转移潜能的肿瘤治疗；二是肿瘤血管阻断制剂(vascular-disruptingagents, VDA)，即破坏已生成的血管，利用该制剂特异性结合肿瘤血管的配体或者选择性破坏异常的血管相关因子，主要用来治疗已经形成的体积较大肿瘤。基于Al和VDA的不同作用特点，两者联用可以有效提高疗效[7]。
[0004]在众多的促血管生成因子中，血管内皮生长因子(VEGF)是最早发现的作用最强的促血管生长和增加血管通透性的因子，越来越多的研究显示[8]，血管内皮生长因子家族(vascular endothelial growth factor family,VEGFs)通路在肿瘤的生长和转移中起着重要作用。VEGF通过与血管内皮生长因子受体(VEGFR)的结合使VEGFR 二聚体化，形成同源二聚体或异源二聚体，磷酸化的酪氨酸残基可以调控激酶的活力，参与内皮细胞的分化、增殖和迁移，也可为胞浆中的信号分子提供结合结构域，参与下一级的细胞信号传导[9]。
[0005]VEGFR-1属三个酪氨酸蛋白激酶受体家`族之一 [10]，分子量约为180kDa，其蛋白质结构分为胞内区、跨膜区和胞外区三个部分，其中胞外区负责与配体结合，具有7个免疫球蛋白样袢，配体结合域位于氨基端3个loop内口。在人类，编码VEGFR-1的基因位于染色体13ql2_ql3，基因全长7680bp，编码1338个氨基酸。VEGFR-1是VEGF的三个酪氨酸激酶受体之一，是结合VEGF-A的细胞膜锚定的酪氨酸激酶受体，也是结合VEGF-B和PlGF的唯一酪氨酸激酶受体[11]。VEGFR-1介导的信号通路，尤其是与配体PIGF结合引起的信号主要介导病理性血管的形成。大量研究发现该激酶域对于单核巨噬细胞调节血管的渗透性以及PIGF诱导的血管新生是必不可少的，靶向VEGFR-1的小分子抑制剂均能有效抑制肿瘤的血管新生[12]。
[0006]VEGFR-1阳性的骨髓造血祖细胞能调节VEGFR-2阳性内皮祖细胞的招募和外渗，促进VEGFR-2进入血管参与新生血管的形成，为肿瘤细胞的传播共同建立转移微环境
[13]。选择性抑制VEGFR-1消除了肿瘤微小转移龛的形成，从而降低了肿瘤的微转移。综上所述，VEGFR-1信号通路在炎症和转移、调节和促进肿瘤血管生成方面有至关重要的作用，以VEGFR-1为靶点的抗肿瘤治疗是一个应用前景可观的领域。
[0007]脱氧核酶是利用体外分子进化技术获得的一种具有催化功能的短片段单链DNA，具有高效的催化活性和结构识别能力。脱氧核酶将高效的催化降解能力与反义的靶向识别能力结合，能够特异地针对靶标从mRNA水平关闭靶基因，从而调控目标蛋白质的表达，是一种高效特异的靶向基因治疗的新策略[14]。脱氧核酶独特的化学本质为脱氧寡核苷酸，性质相对稳定；分子量小，结构相对简单，对底物的趋近性好；催化效率及特异性高，副作用低；靶位点选择的限制更少；易于合成，价格低廉。利用脱氧核酶靶向VEGFR-1将提供一种新型抗肿瘤血管生成并抑制肿瘤生长的制剂。
[0008]参考文献
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【发明内容】
[0023]本发明的目的是提供一类下调血管内皮生长因子受体I (VEGFR-1)表达的，通过抑制肿瘤血管生成治疗肿瘤的脱氧核酶靶向药物。
[0024]本发明所提供的脱氧核酶是通过下调血管内皮生长因子受体I的表达，从而抑制肿瘤的生长。脱氧核酶是一种新型的基因抑制剂，其具有反义寡核苷酸的化学稳定性，同时又具有核酶的催化切割RNA的功能，且其合成费用很低。基于这些独特的优点，该技术已被广泛用于体内和体外的基因调控。
[0025]所述脱氧核酶是一种DNA分子，可特异性地识别并切割靶mRNA或pre-mRNA，其结构如图1所示。其中N=G, U，C，A ;R*Y为切割位点；R=A或G ；Y=U或C。脱氧核酶包括:
[0026](I)一个催化功能序列GGCTAGCTACAACGA，以此切割靶基因mRNA或pre-mRNA的任一嘌呤核苷酸与嘧啶核苷酸的连接键；
[0027](2)5’端和3 ’端结合序列，各为5~12个核苷酸，分别与靶序列切割位点两侧的序列互补；5’端和3’端结合序列由催化功能序列连接。
[0028]脱氧核酶的5’端和3’端结合序列又称为其两臂，优选的，在选择靶向切割位点时，调整脱氧核酶两臂的长度使每条臂与靶序列结合的？G° ( -lOkcal/mol。
[0029]本发明脱氧核酶的靶基因是人VEGFR-1基因。VEGFR-1在众多肿瘤中高表达，对VEGFR-1的基因表达的抑制可有效抑制肿瘤生长。
[0030]脱氧核酶由27~39个核苷酸残基组成，自5'到3'的方向，由磷酸酯键连接。为增强脱氧核酶的稳定性，可对其磷酸酯键进行化学修饰以提高脱氧核酶的抗酸和抗酶降解的能力，例如，以硫代磷酸酯键代替磷酸酯键，形成锁核酸(Locked nucleic acids,LNA)或肽核酸(peptide nucleic acids, PNA)。优选硫代磷酸酯键修饰,在所述脱氧核酶的5’端和/或3’端结合序列中可含有1-6个硫代磷酸酯键。
[0031]稳定性的增强还可以通过其他化学修饰实现，包括:
[0032]I)对碱基、糖基和主干结构的修饰。对碱基的修饰，例如，甲基化碱基、羟甲基化的碱基等。对糖基的修饰，例如2’位3’位取代脱氧核糖核酸。核糖基和单核苷酸之间的连接键称为核酸的主干结构。对主干结构的修饰包括连接键以及其它可以增强稳定性和亲和性的修饰，及增加一些取代基，例如，二胺(diamine)、胆固醇或其它亲脂性基团，2’ -O-甲基磷酸二酯键，2’-0-(CH2)n-0CH3，2’-氟，杂合连接键，其它主干结构的修饰。具体的例子有，在碱基相对于天然右旋异构体糖为反向时，可使用左旋(L-)异构体脱氧核糖；或将糖基的2’ -位以2’ -卤素兀素,2’ -0-烷基,2’ -0-(亚烷基)n_0-烷基取代；或者使用下列连接键:2’ -0-甲基磷酸二酯键。本发明的脱氧核酶可具有部分修饰，或全部修饰，或是不同修饰的组合。优选的是糖基2’-0-甲基修饰。
[0033]2)末端保护:在分子的末端加入保护基因，以防止分子的降解。这种保护可以是5’端，也可以是3’端，或是两端均被保护。例如，反向连接碱基，双脱氧核苷酸，甲憐酸基，烷基、芳基，cordycepin, cytosine arabanoside, 2’ -甲氧基、乙氧基核苷酸、phosphorothioate连接键,3’ _0_甲基碱基,突光素,肽键连接,二氮苯基,胆固醇,生物素，acridine, rhodaminepsoralen, glyceryl, 丁醇基,丁基，已醇基和 3’ -0-烷基。优选的是3’端反向连接碱基。
[0034]在本发明的一个实施例中，靶向VEGFR-1的脱氧核酶的设计是通过分析靶基因的mRNA序列，筛选出AU和⑶位点，进一步分析自由能水平，选出靶向位点。针对这些位点设计出对应的脱氧核酶。应用DNA合成仪器，合成所设计的脱氧核酶，并进行体外切割实验，获得具有高切割活性的脱氧核酶。
[0035]靶向VEGFR-1脱氧核酶的抗血管生成的生物学活性可以利用体内外模型进行验证；抗肿瘤效应利用肿瘤细胞模型和小鼠移植瘤模型进行实验验证。
[0036]靶向VEGFR-1脱氧核酶的生物安全性通过常规药理学和毒理学方法进行评价。
[0037]实验证明，本发明的靶向VEGFR-1的脱氧核酶通过特异性地切割VEGFR-1的mRNA，降低VEGFR-1基因的表达，抑制肿瘤新生血管生成和肿瘤生长。
【专利附图】
【附图说明】
[0038]图1是脱氧核酶序列与结`构示意图。
[0039]图2显示了靶向VEGFR-1脱氧核酶的脱氧核酶体外切割活性分析结果。
[0040]图3显示了靶向VEGFR-1脱氧核酶对脱氧核酶对微管形成的影响。
[0041]图4显示了靶向VEGFRl脱氧核酶DT18及对照体外切割动力学。
[0042]图5显示了靶向VEGFRl脱氧核酶DT18及对照体外切割定量结果。
[0043]图6显示了脱氧核酶DT18抑制VEGFR-1在细胞中的表达。
[0044]图1显示了脱氧核酶DT18对体内对角膜血管形成的影响。
[0045]图8是脱氧核酶抑制角膜新生血管形成的定量分析结果。
[0046]图9显示了脱氧核酶DT18对新生黑色素瘤生长的抑制作用(n=8)。
[0047]图10显示了脱氧核酶DT18抑制裸鼠移植人鼻咽癌生长(n=5)。
[0048]图11显示了脱氧核酶DT18抑制肿瘤组织中VEGFR-1的表达。
[0049]图12显示了脱氧核酶DT18对移植瘤内血管通透性的影响。
[0050]图13显示了脱氧核酶DT18对主要脏器组织形态学的影响。
【具体实施方式】
[0051]以下通过实施例对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
[0052]实施例1:靶向VEGFR-1mRNA脱氧核酶切割位点的分析与设计
[0053]VEGFR-1在许多肿瘤组织中均为高表达，靶向抑制VEGFR-1表达可抑制肿瘤的新生血管生成，从而促进肿瘤细胞死亡。
[0054]本实施例中，将利用人HUVEC细胞筛选脱氧核酶，并在小鼠模型中加以分析与验证。为保证靶向VEGFR-1的脱氧核酶在鼠和人中都有效，必须设计针对小鼠/大鼠和人的VEGFR-1mRNA保守区域的脱氧核酶。在高度同源区选取潜在的靶位点，运用nearestneighbor方程计算候选脱氧核酶与靶序列结合的自由能(AG。)，略微调整核酶两臂的长度使每条臂与靶序列结合的AG。S-lOkcal/mol。另外因为小鼠/大鼠和人的序列同源性存在差异，所以脱氧核酶的两条臂序列可能为对称或者非对称链。根据以上原则共筛选到11个潜在的靶位点，并针对11个靶位点构建了靶向VEGFR-1的脱氧核酶(表1)。同时，将脱氧核酶的底物识别序列不变，而催化中心的碱基序列改变为5’AGCAACATCGATCGG3’ (SEQID如-口^构建成无酶活性的对照工附-以!^。为了提高脱氧核酶的稳定性，将脱氧核酶及对照分子的两端各2个碱基进行硫代磷酸化修饰；为了检测脱氧核酶的转染效率及其在细胞内的分布情况，将脱氧核酶5’端用FITC标记。进行细胞外实验的脱氧核酶均经PAGE纯化，进行细胞内实验的均经HPLC纯化。
[0055]表1:靶向VEGFR-1脱氧核酶的靶位点及核苷酸序列
[0056] 脱氧核酶~革巴位点结合臂脱氧核酶序列(5’—3’)# 序列号
DT102509/7 agctgaccaggctagctacaacgaggtgagc SEQID No: I
DT113539/7 ccttttaaaggctagctacaacgatcagttc SEQID No； 2
DT128438/9 tcttt^au^cta^ctacaac^a^tt^cattt SEQID No: 3
DT139438/5 tatttggaggctagctacaacgaatctaSEQID No: 4
DT1413247/6 gccttcaggctagctacaacgatttcatSEQID No: 5
DT1515927/7 ttgtctgggctagctacaacgatgcccagSEQ ID No: 6
DT1617539/9 tgctctcaaggctagctacaacgatctgtttcc SEQID No: 7
DT1719106/6 ggcacaggctagctacaacgactgtgaSEQID No: 8
DT1820987/5 agagtgaggctagctacaacgaggagtSEQID No: 9
DT1921617/6 ttcctggggctagctacaacgatctgcaSEQID No: 10
DT2023239/7 accaagtgaggctagctacaacgactuaguc SEQID No: 11
[0057]#根据同源序列长短和自由能计算，脱氧核酶分别包含对称或不对称结合臂。催化活性序列以下划线标注。
[0058]实施例2:祀向VEGFR-1脱氧核酶的体外切割活性
[0059]脱氧核酶具有自身催化和高效、靶向序列特异性的功能，因此，体外的切割反应直接反应它在体外的活性。使用I7RNA聚合酶进行体外转录翻译来准备体外切割实验所需要的模板。体外转录反应使用HAmpliscribe体外转录试剂盒(Epicentre, Wisconsin),操作按试剂盒说明书进行。以带T7启动子编码VEGFR-1的可溶性部分的线性化质粒(PI7-VEGFR1)为模板，I7RNA聚合酶转录出VEGFR-1RNA片段，作为脱氧核酶切割反应的底物。切割反应体系含MgC12 (IOmM)，Tris-Cl (50mM，pH=7.5)，体外转录的底物RNAl ill (Ipmol)，脱氧核酶I ill (Ipmol)，0.1%DEPC水补足至10 yl。反应体系放置于85°C，30秒；37°C，5分钟；再次温育60分钟，然后加入等体积的终止缓冲液终止反应(98%甲酰胺，IOmM的EDTA和0.1%上样染料)。产物通过6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳I小时，75W。将凝胶在PhosphorImager (磷屏)曝光，条带使用ImageQuant软件进行分析。
[0060]通过图2可以看出，除DT20外，脱氧核酶DT10、DT11、DT12、DT13、DT14、DT15、DT16、DT17、DT18、DT19均出现条带明显的切割产物，切割产物大小集中在0.30-2.32kb之间。
[0061]实施例3:祀向VEGFR-1脱氧核酶体外抑制血管形成[0062]内皮细胞在经过长期培养后会自行排列成微血管样结构，可通过相位差显微镜以及穿透式电子显微镜来进行观察。微管形成实验是目前常用于肿瘤血管生成的一种体外实验的方法，研究中常利用此现象来观察和评估药物及生长因子对于血管生成的影响。该方法是在原有的二维培养系统中加入细胞外基质。使得内皮细胞生长在基质中形成三维培养，以便于进行组织学切片与观察微管的结构。
[0063]为了筛选靶向VEGFR-1mRNA效果最佳的脱氧核酶，通过微管形成实验分别分析已设计合成的11种脱氧核酶抑制小管形成的能力。转染前一天，HUVEC以1-1.4*104/孔均匀铺板，六孔板置于37°C过夜，次日细胞密度接近80-90%。脱氧核酶通过转染试剂TMP进行转染，脱氧核酶:TMP以1:3的比例在转染前混合15min，无血清培养基培养3小时后换成完整培基过夜，转染后48小时，胰酶消化，完整培基终止消化后2000rpm离心6min，完全培基洗一遍再次离心一遍，大约以30000个细胞/孔种植于96孔板内，下面铺有100 u I的基底膜胶，2小时候后培基换成低血清培基，37°C培养过夜，4-6小时至次日拍照。
[0064]通过图3及表2可以看出，靶向VEGFR-1mRNA脱氧核酶DT18处理的内皮细胞几乎没有看见完整的微管形成^了川^了口^”么口了^^”了^了…处理的内皮细胞可见微管形成部分被阻断；DT11、DT13、DT16、DT20组均可见相对完整的微管形成，但相对于未处理组，微管的形态稍差。因此，DT18被选为先导分子(Lead molecule),进一步加以研究。
[0065]表2:脱氧核酶影响微管形成结果汇总*
[0066]
【权利要求】
1.一种特异性抑制血管内皮生长因子受体基因表达的脱氧核酶，该脱氧核酶以血管内皮生长因子受体VEGFR-1基因的mRNA或pre-mRNA为靶序列，包括:一个催化功能序列GGCTAGCTACAACGA，及连接在其两端的5’端结合序列和3’端结合序列；其中，所述催化功能序列用于切割靶序列的任一嘌呤核苷酸与嘧啶核苷酸的连接键；5’端结合序列和3’端结合序列各为5~12个核苷酸，分别与靶序列切割位点两侧的序列互补。
2.根据权利要求1所述的脱氧核酶，其特征在于，所述脱氧核酶由27~39个核苷酸残基组成。
3.根据权利要求1所述的脱氧核酶，其特征在于，所述脱氧核酶的5’端结合序列和3’端结合序列各自与靶序列结合的AG。^-10kcal/molo
4.根据权利要求1所述的脱氧核酶，其特征在于，所述靶序列的切割位点是AU或GU的连接键。
5.根据权利要求1所述的脱氧核酶，其特征在于，所述脱氧核酶选自序列表中SEQIDNo:1 至 SEQ ID No:11 之一。
6.根据权利要求1所述的脱氧核酶，其特征在于，所述脱氧核酶的5’端结合序列和/或3’端结合序列中含有1-6个硫代磷酸酯键。
7.根据权利要求1所述的脱氧核酶，其特征在于，所述脱氧核酶具有以下一种或多种化学修饰:3’ -3’反向连接碱基、锁核酸、肽核酸和糖基2’ -甲氧基修饰。
8.根据权利要求1所述的脱氧核酶，其特征在于，所述脱氧核酶靶向的VEGFR-1基因是人和/或鼠的VEGFR-1基因。
9.权利要求1~8任一 所述脱氧核酶在制备抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长的药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK103627709SQ201310655835
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年12月6日 优先权日:2013年12月6日
【发明者】孙仑泉, 杨力芳 申请人:孙仑泉, 杨力芳