本发明涉及稳定的液体制剂，其包含中和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)的化合物。制剂的成份优选提供经长期储存和冻融循环的稳定性。在优选方面，所述制剂用于治疗，优选用于炎性和自体免疫性障碍的治疗，优选包括过敏障碍和牛皮癣障碍，以及关节炎障碍和气喘障碍。此外，提供包括本发明制剂的试剂盒。
背景技术：
蛋白质用于医药、兽医产品、化妆品和其他消费产品、食物、饲料、诊断学、工业化学和除污的广泛领域。有时，此类用途已由蛋白质本身固有的束缚而受限制，或由其使用的环境或介质所影响。此类束缚可能导致蛋白质的不佳稳定性，性能的变化或高成本。归因于生物技术的出现，可制造用于治疗应用的多种蛋白质。在其制造后，蛋白质药品通常在使用前储存。由于蛋白质通常较“传统”药品大且更加复杂的事实，适合于储存的蛋白质药品的制剂和加工具体而言是具有挑战性的。关于蛋白质药品制剂和方法设计的综述，参见Carpenter等人.(1997),Pharm.Res.14:969-975；Wang(2000),Int.J.Pharmaceutics 203:1-60以及Tang和Pikal(2004),Pharm.Res.21:191-200。
在设计蛋白质药品的制剂和制造方法时可考虑数种因素。首要考虑为通过任何或所有制造、运输和处理步骤的蛋白质的稳定性，所述步骤可包括组合物的制备、冷冻、冷冻干燥、干燥、储存、运输、重构、冷冻/融化循环和最终使用者的重构后储存。其他潜在考虑包括简易和经济的制造、处理和分配；用于患者施用的最终产物的组合物；和最终使用者的容易使用，包括重构后冷冻干燥的制剂的溶解度。
液体制剂可满足某些目的。液体制剂可能的优点包括容易和经济的制造与对最终用户的便利性。通常，当储存延长的时间段时，多肽在溶液中为不稳定的(Manning等人(1989),Pham.Res.6:903-918)。因此，已开发另外的加工步骤以容许较长的保存期限，包括干燥，例如冷冻干燥。冷冻干燥的制剂也可提供某些优点。冷冻干燥的潜在益处包括改善的蛋白质稳定性以及运输与储存的便利性与经济性。然而，冷冻干燥的药物组合物对最终用户可能较为不便利。
除了选择组合物的基本形式(例如冷冻干燥的、液态、冷冻等)，蛋白质制剂的优化典型地涉及改变制剂的组份及其各自的浓度以最大化蛋白质稳定性。多种因素可影响蛋白质稳定性，包括离子强度、pH、温度、冷冻/融化循环、剪切力、冷冻、冷冻干燥、干燥、搅拌和重构。蛋白质不稳定性可能因物理降解(例如变性、聚集或沉淀)或化学降解(例如脱酰胺作用、氧化或水解)而造成。制剂组份和浓度的优化单独基于经验研究和/或理论近似以克服不稳定性的来源。
有时，在含有多肽的药物组合物(包括水性和冷冻干燥的制剂)的长期储存中，可能因为聚集和/或降解而损失活性多肽。
因此，改善多肽稳定性的典型实践可提供改变制剂内元素的浓度、或提供添加赋形剂以修饰制剂而解决(美国专利No.5,580,856和No.6,171,586，与美国专利申请No.US 2003/0202972、US 2003/0180287)。美国专利5,580,856是原型专利，公开了诸如天然聚合物、表面活性剂、硫酸化多醣、蛋白质和缓冲剂的试剂，其可在再水合期间或之后添加以稳定干燥的蛋白质。然而，除了多种选项以外，美国专利5,580,856并未教导对哪种蛋白质应添加哪种稳定剂。因此，当熟知技艺的读者注意到那么多种选项时，其将不得不在美国专利5,580,856描述的多种选项中找出对于其蛋白质的最佳条件。美国专利申请2003/0202972描述了抗-Her2抗体的稳定的冷冻干燥制剂，其中稳定剂为糖、海藻糖或缓冲剂。但是，当这些稳定剂可能对一种抗体有用时，其可能无法推广至其他蛋白质。美国专利申请2003/0180287类似于美国专利申请2003/0202972，其中也描述了免疫球蛋白样蛋白质的稳定溶液，所述免疫球蛋白样蛋白质即含Fc结构域的蛋白质。所述稳定剂可为磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠或柠檬酸钾、马来酸、乙酸铵、Tris缓冲剂、乙酸盐、二乙醇胺(diethaolamine)、组氨酸、赖氨酸或半胱氨酸。在这些可由熟知技艺的读者选择的化学上不同的稳定剂中，证明赖氨酸是适合的。然而，像美国专利申请2003/0202972一样，该特定的稳定剂仅对特定的蛋白质适用，此处为含Fc结构域的蛋白质，且其本身无法推广至另一种蛋白质。因此，添加剂的使用无法由特定蛋白质推广至另一个不相关的蛋白质。事实上，(当于改善储存时)添加剂的使用仍可导致无活性多肽。此外，在冷冻干燥的情况中，再水合步骤可引入导致使多肽失活的条件，例如聚集或变性(Hora等人.(1992),Pharm.Res.,9:33-36；Liu等人.(1991),Biotechnol.Bioeng.,37:177-184)。事实上，多肽的聚集是不期望的，因其可能导致免疫原性(immunogenicity)(Cleland等人.(1993),Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems,10:307-377；和Robbins等人.(1987),Diabetes,36:838-845)。
在医药产品开发和制造期间生物学活性的维持仰赖于大分子的固有稳定性以及所使用的稳定化技术。存有多种蛋白质稳定化技术；包括添加化学“稳定剂”至蛋白质水性溶液或悬浮体中。例如，美国专利4,297,344公开了凝结因子II和VIII的稳定化，通过加入选定的氨基酸至凝血酶III与血纤维蛋白溶酶原以对抗热。美国专利4,783,441公开了通过加入表面活化物质而用于稳定化蛋白质的方法。美国专利4,812,557公开了使用人血清蛋白而用于稳定化白介素-2的方法。制剂与低温保护剂混合和储存于非常低温下的冷冻/融化方法是稳定化蛋白质的另一选项。然而，并非所有蛋白质在冷冻/融化循环下存活。与低温保护剂添加剂(通常为甘油)的冷储存是另一选项。也可如美国专利5,098,893中描述的以玻璃形式储存。在此情况中，蛋白质溶解于呈非晶型或玻璃态的水可溶性或水可膨润性物质中。用于蛋白质稳定化的最为广泛使用的方法是冷冻-干燥(freeze-drying)或冷冻干燥(lyophilization)。当在水性溶液中无法达成足够的蛋白质稳定性时，冷冻干燥提供最可行的替代方案。冷冻干燥的一格缺点为其需要熟练的处置、是耗时的和昂贵的。此外，若冷冻干燥不是小心地进行，多数制剂因技术的冷冻和脱水步骤而至少部份变性。结果经常为部份蛋白质分子不可逆的聚集，从而导致不可用于不经肠道的施用的制剂。
普遍而言，蛋白质的降解已在文献中详尽描述，但中和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(进一步称为GM-CSF)的化合物的储存和稳定度，特别是多肽和抗GM-CSF抗体并未被描述。
此外，尽管本领域中已知对于蛋白质稳定剂以及对于允许蛋白质高浓度的同时可保持稳定的试剂的众多选项，直至本发明，本领域中并未认知到包含高浓度的中和GM-CSF的化合物的制剂可能为不稳定的，因而需要改进。
在包含蛋白质(诸如抗体，例如单克隆抗体)的药物组合物的制备中，由于潜在对患者具较高便利性的皮下注射，一个目标是开发高浓度液体制剂。然而，一般共识为开发抗体(特别是单克隆抗体)的高浓度制剂就单克隆抗体的物理和化学稳定性方面具有严苛挑战，诸如可溶性以及不可溶聚集体的增加的形成提高了免疫原性反应的机会及造成低生物学活性。
在液体药物组合物储存期间多肽的聚集体形成可对该多肽的生物学活性有负面效应，从而导致药物组合物治疗功效的损失。此外，当使用输注系统施用含多肽的药物组合物时，聚集体形成可导致其他挑战，例如管道、膜或泵的阻塞。并且，抗体的高浓度制剂已被报告会导致增加的粘度，由此对可制造性和可注射性产生严苛的挑战。高粘性制剂是难以制造、抽入注射器和注射的。操纵粘性制剂所用的力导致过量起泡，其可导致活性单克隆抗体的变性和失活。
因此，对于含中和GM-CSF的化合物(例如抗体)且具有适合皮下注射的低且可用粘度(诸如即可使用的装置)的稳定高浓度蛋白质药物组合物有高的需求。并且，从患者的角度而言，高度希望具有室温稳定产品。现在，已有特定的非市售抗体制剂，其在室温下储存可能跨及药物产品的保存期限。典型地，发生增加的蛋白质聚集会造成不可接受的高量的聚集物和蛋白质相关不纯物，其可导致免疫原性反应。许多的市售单克隆抗体产品在其制剂中含有表面活性剂。典型地，添加表面活性剂以便减少界面应力，所述界面应力可诱导蛋白质聚集和粒子形成，从而导致不可接受的产品质量。接口应力的实例可为蛋白质与下列者的接触：i)空气、ii)容器闭合材料，诸如橡胶柱塞、活塞、玻璃、预填充的注射器，iii)与制造相关的材料，诸如钢槽、管与泵，iv)冷冻/融化期间的冰等等。然而，表面活性剂(诸如聚山梨醇酯)典型地含有过氧化物残余，其可能氧化蛋白质分子而导致产品质量受损。此外，从制造的角度而言，聚山梨醇酯的添加在制造中需要另外的步骤，因为当制剂含有所述聚山梨醇酯时，进行超/透析过滤(diafiltration)是具有挑战性的。避免形成氧化的产品为挑战性的问题，因而必须小心处理聚山梨醇酯以便控制氧化产品的形成。因此，从稳定性与制造角度两者而言，还希望设计不具有表面活性剂的制剂。
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(最初鉴别为造血生长因子)最近期已证明是炎症和自体免疫中的重要的细胞因子。已在包括过敏与牛皮癣患者、关节炎与气喘患者的多种炎性部位测得升高量的GM-CSF mRNA或蛋白质。多数体内研究已显示过去数年间经由中和抗体阻断GM-CSF可避免或甚至治愈多种炎症模式的促炎性疾病，包括用于关节炎实验性自体免疫性脑炎、牛皮癣和肺部疾病的模式。因此，非常希望拥有具有GM-CSF中和化合物的制剂，其特别为稳定的、含有高含量的GM-CSF中和化合物的和/或可经由皮下途径施用的。
技术实现要素：
因此，本发明的技术挑战符合上述的需求。
本发明解决这些需求，且因此提供关于制剂的实施方案作为技术挑战的解决方法，以及提供在治疗患有可受惠于施用中和GM-CSF的化合物的疾病的受试者中施用这些制剂的方法和用途。这些实施方案在本文中表征和描述，于实施例中示例且反映于权利要求书中。
应注意，除非上下文明确另有指示，本文所使用的单数形式“一个(a/an)”、“一种(a/an)”和“所述/该(the)”包括复数指代。因此，例如提及“一种抗体”包括一种或多种此类不同抗体，提及“该方法”包括指代本领域普通技术人员已知的可修饰或替换本文所述方法的等效步骤和方法。
除非另有指示，在一系列元素前的术语“至少”理解为指代该系列中的每一元素。本领域技术人员将使用不多于例行实验而理解或能够查明本发明文中描述的特定实施方案的多种等效者。这些等效者预期为本发明所涵盖。
除非上下文另有要求，本说明书与权利要求书通篇中，词语“包括/包含(comprise)”及变形诸如“包括/包含(comprises)”与“包括/包含(comprising)”将理解为意为包括所述整数或步骤、或整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或者排除整数或步骤的组。当在本文使用时，术语“包括”可替换为术语“包含”，或有时在本文中使用术语“具有”，或甚至可由“由…组成”替换。
当在本文使用时，“由…组成”排除所要求保护的元素中未指明的任何元素、步骤或成份。当在本文使用时，“实质上由…组成”未排除实质上未影响权利要求的基础和新颖特征的材料或步骤。在本文的每一实例中，术语“实质上由…组成”和“由…组成”中的任一个可相互替换。
如本文中所使用，在多个引述元素之间的连接性术语“和/或”理解为涵盖个别和组合的选项。例如，当两元素以“和/或”连接时，第一选项意指可施用第一元素而排除第二个。第二选项意指可施用第二元素而排除第一个。第三选项意指可一起施用第一和第二元素。这些选项中的任一个理解为落入含义中，且因此满足本文所使用的术语“和/或”的要求。多于一个所述选项的一同施用也理解为落入含义中，且因此满足本文所使用的术语“和/或”的要求。
本说明书文本中通篇引述若干文件。本文所引述的每一文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商规格书、操作指南等)，无论在前文或后文，以其整体通过引用并入此文。在通过引用并入的材料与本说明书矛盾或不一致的情况下，本说明书将优先于任何此类材料。本文中并未有任何内容理解为承认本发明非先于此类揭示内容的先前发明。
在谨记提供具有高浓度中和GM-CSF的化合物的制剂的目标情况下，本发明人认识到，中和GM-CSF的化合物可能在高浓度下不稳定且还可能经延长的储存时间后不稳定。
事实上，有许多方式可使中和GM-CSF的化合物(像蛋白质)不稳定。例如，蛋白质不稳定性可由蛋白质聚集或降解造成，也可因脱氨基作用、脱酰胺作用、氧化、双硫键断裂和形成、水解、丁二酰亚胺化、非双硫键交联、脱醣基化作用或“酶促褐变”(梅纳反应(Maillard reaction))或这些现象的任意组合的化学不稳定性造成；参见例如Wang等人.(1999),Int.J.Pharm.185:129-188。此外，物化参数诸如温度、pH值、表面吸附、盐、金属离子、螯合剂、物理力诸如剪切力、蛋白质变性剂、非水性溶剂、蛋白质浓度、蛋白质来源和纯度、蛋白质型态(morphism)或压力会影响蛋白质稳定性。
然而，虽然多种因素可影响蛋白质稳定性，也可采取多种措施以稳定蛋白质。例如，蛋白质可内部地(通过改变氨基酸)或外部地稳定化。外部稳定化可通过添加螯合剂、金属离子、还原剂、聚合物、聚乙二醇/多元醇、血清白蛋白、表面活性剂、糖鹤多元醇、脂肪酸和磷脂、氨基酸、缓冲剂等而实现；参见例如Wang,Y和Hanson M(1988),J.Parental Sci.&Technology,42,Supplement:4-26；Wang等人.(1999),Int.J.Pharm.185:129-188。总之，用于稳定制剂中的GM-CSF中和化合物(诸如抗体)，技术人员将有多种可能的选项。
在本情况中，本发明人观察到，中和GM-CSF的化合物可显示聚集和/或可在较高浓度中不溶解。多种不同的因素可导致制剂中蛋白质的聚集。典型的纯化和储存程序会使蛋白质制剂暴露于导致该蛋白质聚集的条件和组份。例如，在制剂中的蛋白质可因以下任一或多个而聚集：储存、暴露于高温、制剂的pH、制剂的离子强度以及某些表面活性剂(例如聚山梨醇酯-20与聚山梨醇酯-80)和乳化剂的存在。类似地，当暴露至剪切应力时，诸如在溶液中重构冷冻干燥的蛋白质块、过滤-纯化蛋白质样品、冷冻-融化、摇晃或经由注射器转移蛋白质溶液，蛋白质可能聚集。聚集还可因在储存小瓶内多肽分子在溶液中和在液体-空气界面处的相互作用而发生。在运输期间由于搅拌所导致的界面压缩或延伸期间，在吸附至空气-液体和固体-液态界面的多肽中可能发生构型变化。此类搅拌可造成制剂的蛋白质聚集和与其他吸附的蛋白质最终地沉淀。
此外，使蛋白质制剂暴露于光可造成蛋白质聚集。本发明因此提供容许高浓度的中和GM-CSF的化合物且降低这些化合物聚集的制剂。不受理论所限，聚集的减少据信通过控制一或多种上述聚集机制而实现。此可导致例如改善的产品稳定性和在制造过程及储存条件中更大的弹性。
本发明旨在提供具有高浓度中和GM-CSF的化合物的制剂，以便例如容许较低注射体积，其适合于降低例如因高输注体积而疼痛的副作用，或允许低体积的皮下注射。
因此，本发明人在其研究期间已观察到中和GM-CSF的化合物的某种不稳定性，因而旨在改善此非期望的观察结果。因此，他们旨在浓缩中和GM-CSF的化合物同时在溶液中维持所述化合物，即呈溶解状态。为此，他们具有众多可能的选项及替代方案，然而并没有任何征兆表明它们中的任一者将适合于解决此目标问题。
“溶解状态”意为所述中和GM-CSF的化合物，优选在溶液中浓度为至少约20mg/ml，即直接地(溶)解和/或分散于制剂的水溶液中(即在水相中)。优选地，中和GM-CSF的化合物是匀相地(溶)解和/或分散的。匀相意为该(溶)解和/或分散于水性制剂中的中和GM-CSF的化合物是近于均匀地、优选均匀地分布于水性制剂中，以使得中和GM-CSF的化合物的浓度(“c”)(在摩尔质量的情况为“n”，或在质量的情况为“m”)是在(或遍及)水性溶液的体积(“v”)中近于相同的、优选为相同的，即c＝n/v或c＝m/v分别为接近常数，优选为常数。优选地，制剂内没有浓度梯度。
因此，本发明包含中和GM-CSF的化合物的稳定制剂优选可视为水性溶液，其中中和GM-CSF的化合物直接地溶解于和/或分散于其中。
“溶液”是两或多种物质/组份的匀相混合物。在此类混合物中，溶质(本发明中为中和GM-CSF的化合物)(如上所述地)溶解于另一物质(本发明中优选为水性制剂)，也称作溶剂。
鉴于上述，中和GM-CSF的化合物优选非为非匀相地(溶)解和/或分散于水性溶液中。术语“溶解态”还包括，中和GM-CSF的化合物优选为实质上非乳化的，或更优选地在水性溶液中完全非乳化的。
并且，术语“溶解态”包括，中和GM-CSF的化合物优选为非实质上被封装和/或包覆的，优选低于2％、1％或0.5％的中和GM-CSF的化合物可被封装和/或包覆的，或更优选地，完全非被封装和/或包覆的，例如在脂质体、多层脂质体或其类似物中。
因此，本发明一个优选的实施方案是含有中和GM-CSF的化合物的液体制剂，当储存长时间段时其是稳定的且不会经历缀合物/聚集物或片段/降解产物的形成，且其制剂适用于皮下施用。
特定而言，在测试多种不同稳定剂后，本发明人发现，如果将张力调节剂(tonicity modifier)添加至要被储存的溶液中，中和GM-CSF的化合物可被稳定化。张力调节剂的实例包括但不限于糖和糖醇。简单的糖称为单醣，且包括葡萄糖、左旋糖、半乳糖、木糖、核糖、甘露糖、乳酮糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、太洛糖、阿拉伯糖和来苏糖。对本发明更优选的为二糖，其包括例如蔗糖、麦芽糖、乳糖、异麦芽糖、海藻糖和纤维素二醣。糖醇包括山梨醇、甘露醇、甘油、赤藻糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、聚糖醇。在优选实施方案中，糖为非还原糖，诸如蔗糖或海藻糖。非还原糖类的特征在于缺乏开链结构，故其不易受氧化-还原反应影响。因此一种或多种非还原糖、诸如蔗糖或海藻糖，或一种或多种糖醇、诸如甘露醇或山梨醇，可添加至包含中和GM-CSF的化合物的制剂中。还可添加非还原糖和糖醇的组合至溶液中，诸如蔗糖和甘露醇、蔗糖和山梨醇、海藻糖和甘露醇或海藻糖和山梨醇。更优选地，添加糖醇甘露醇和/或山梨醇，优选以其D-式，最优选为添加山梨醇至溶液中。张力调节剂(优选为山梨醇)的浓度为约1％至约15％(w/v)，优选为约2％至约10％(w/v)，更优选为约3％至约7％(w/v)，更优选为约4％至约6％(w/v)，且最优选为约5％(w/v)。
在高浓度就长期储存下另一个特别优选的稳定化中和GM-CSF的化合物的物质是pH为约4至约10、优选为约4至约7、更优选为约4至约6或为约5至约7、甚至更优选为约5.5至约6.5且最优选pH为约5.8的缓冲剂体系。缓冲剂优选可选自组氨酸缓冲剂、乙酸盐缓冲剂和柠檬酸盐缓冲剂。当在本文中提及时，氨基酸意为L-氨基酸或D-氨基酸，其中L-氨基是优选的。优选地，组氨酸或其盐用于缓冲剂体系。该盐优选为氯化物、磷酸盐、乙酸盐或硫酸盐，该盐更优选为氯化物。组氨酸缓冲剂体系的pH为约5至约7、优选为约5.5至约6.5、pH更优选为约或正好5.8。pH可通过使用常规使用的碱和酸调整，优选为NaOH。缓冲剂体系(优选组氨酸缓冲剂体系)的浓度为约10mM至约50mM、优选为约20mM至约40mM、更优选为约30mM。
根据一个优选实施方案，缓冲剂(优选组氨酸缓冲剂)体系与张力调节剂(优选糖醇、更优选甘露醇或甚至更优选山梨醇)的组合用于稳定化溶液中的中和GM-CSF的化合物，以便避免聚集和使制剂在长期储存下和/或一个或多个冷冻/融化循环下足够稳定。显示对稳定性而言，在制剂中优选具有约6％(w/v)和更高的糖醇(优选山梨醇)。然而，制剂渗透压度(osmolality)的上限设定为约470mOsm/kg，其仍为高张的但类似于已批准产品(Synagis；Lm.administration)的渗透压度。因此，需要如本发明实施例中所述在中和GM-CSF的化合物的优化稳定性、张力和浓度之间找寻折衷。糖醇(优选山梨醇)的浓度因此优选为约3％至约7％(w/v)，更优选为约4％至约6％(w/v)，最优选为约5％(w/v)。
在本发明的一些实施方案中，本发明包含中和GM-CSF的化合物的制剂或组合物，除了以上公开的那些(即缓冲剂和张力调节剂)以外并不需要另外的赋形剂，像是诸如表面活性剂和氨基酸，其使用于传统制剂中以稳定化溶液中的蛋白质。此外，本文所描述的制剂较优于标准制剂，因为它们因缺少通常需要用于蛋白质稳定化的另外的添加剂而具有减少的免疫原性。
已知氨基酸可用于稳定化高浓度下的蛋白质，尤其是通过调节蛋白质溶解度和/或抑制蛋白质聚集。虽然苏氨酸(例如在250mM)指示较小的稳定化效果，本发明的液体制剂优选不含其他氨基酸。
并且，优选本发明制剂不含或实质上不含氯化钠。“实质上不含”意指氯化钠的浓度为或非常接近0(零)mM，例如低于约50mM、优选低于约20mM、更优选低于约10mM、甚至更优选低于约5mM及最优选低于约2mM或甚至低于约1mM。
在生物医药产品中，表面活性剂的添加可用于在储存期间降低蛋白质降解。聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80(Tween 20和Tween 80)是为此目的广为接受的赋形剂。然而，因为对中和GM-CSF的化合物的稳定性无效用或有负面效用，本发明的液体制剂优选不包含任何表面活性剂。
使用的各个中和GM-CSF的化合物的浓度在要储存、冷冻/融化的和/或立即使用的液体制剂中为至少约20mg/ml、优选至少约50mg/ml、更优选至少约100mg/ml。本发明所使用的浓度是约20mg/ml至约200mg/ml、优选约50mg/ml至约200mg/ml、更优选约100mg/ml至约180mg/ml、甚至更优选约130mg/ml至约170mg/ml、甚至更优选约135mg/ml至约165mg/ml及最优选约150mg/ml。
所生产的液体制剂的保存期限优选具有的最低要求是，在2至8℃下为24个月、优选在2至8℃下为36个月、更优选在2至8℃下为48个月、最优选在2至8℃下为60个月或在室温下(25℃±2℃)下为至少28天。
本发明涉及稳定的制剂、优选为稳定的液体制剂，其惊人地容许中和GM-CSF的化合物的长期储存。此制剂某种程度上为有用的，因为其对患者而言使用更为便利，如此制剂的中和GM-CSF的化合物为高度浓缩的以使得降低因高体积注射而导致的副作用(如疼痛)。
因此，本发明的一方面基于以下发现：包含以下的制剂
-中和GM-CSF的化合物，
-缓冲剂体系，优选选自组氨酸缓冲剂、乙酸盐缓冲剂和/或柠檬酸盐缓冲剂，优选具有5至7的pH，
-和张力调节剂，优选选自非还原糖，诸如蔗糖或海藻糖；或糖醇，诸如甘露醇或山梨醇。
被赋予在长期储存和/或冷冻/融化循环和/或剪切应力(摇晃稳定性)下的足够稳定性。本发明的制剂相较于标准的缓冲的制剂具有许多优点。在一方面，所述制剂在长期储存后显示最小的聚集行为而没有在高蛋白质制剂下可预期的不好性质。根据本发明的制剂的其他优点为：经长期储存后中和GM-CSF的化合物的最小片段化和在中和GM-CSF的化合物的生物学活性方面无显著冲击，以及组合物的低粘度。最后，在一个优选实施方案中，所述制剂不含另外的赋形剂，诸如表面活性剂、另外的氨基酸和/或氯化钠。
本发明第一方面的优选实施方案为下列：
根据本发明的制剂，其中所述中和GM-CSF的化合物为多肽、拟肽、核酸或小分子。
在一个优选实施方案中，所述中和GM-CSF的化合物(其优选为多肽，更优选为抗体或其功能片段)结合、或特异结合至GM-CSF或GM-CSF受体。预见到GM-CSF或GM-CSF受体为动物的，所述动物包括但不限于哺乳动物，诸如实验性动物(啮齿类动物诸如大鼠、天竺鼠、仓鼠或小鼠；非人类灵长类动物诸如马来猴(cynomolgus)或猕猴(macaque monkey))、家庭或宠物动物(例如狗或猫)、农场或农业动物(例如牛、绵羊、山羊和猪属动物)和/或人。优选地，所述GM-CSF或GM-CSF受体分别为人类GM-CSF(智人)或人类GM-CSF受体，或分别为非人灵长类动物GM-CSF或非人灵长类动物GM-CSF受体。非人灵长类动物GM-CSF或非人灵长类动物GM-CSF受体的尤其优选的变体(同系物)包括长臂猿猴(黑冠长臂猿(nomascus concolor)，也称为西方黑冠长臂猿)的GM-CSF或GM-CSF受体和猕猴家族的猴例如恒河猴(Macaca mulatta)的GM-CSF或GM-CSF受体以及食蟹猕猴(cynomolgous monkey)(Macaca fascicularis)的GM-CSF或GM-CSF受体。根据本发明一个特别优选的实施方案，结合至GM-CSF或GM-CSF受体(优选抗体或其片段)的化合物展现在人和至少一种上述的猴物种之间的交叉反应性。例如，抗体或其片段能够结合至(并中和)人类GM-CSF和食蟹猕猴(Macaca fascicularis)的GM-CSF。此对于预期在人受试者中治疗施用的抗体分子为尤其有利的，因为此类抗体在规范批准前一般将必须进行多种试验，其中包含涉及非人动物物种的某些早期试验。在进行此类试验中，通常希望使用对人具有高度基因相似性的物种作为非人物种(例如非人灵长类动物，诸如食蟹猕猴)，因为由此获得的结果一般将高度预示将相同分子施用至人时可预期的相应结果。然而，此类基于动物试验的预测力至少部份取决于分子的可相比性，并且(由于交叉物种反应性)当相同治疗分子可施用至人和动物模型时此预测力为非常高的。如在本发明的此实施方案中，当抗体分子对人和另一紧密相关物种中的相同抗原具交叉反应性时，该试验可使用相同抗体分子在人和此紧密相关物种中进行，例如在上述的猴物种之一中。此增加了试验本身的效率，以及增加了由所述试验所提供的关于此类抗体在人中的行为的预测力，所述人是从治疗观点来看感兴趣的最终物种。优选的是，结合至GM-CSF或GM-CSF受体的抗体或其功能片段为单克隆抗体或其功能片段。对于非抗体或非抗体衍生的中和GM-CSF的化合物的替代实施方案，情况也是这样。
优选地，中和GM-CSF的化合物为人类单克隆抗体或其功能片段；
中和GM-CSF的化合物可为结合至人和非人灵长类动物GM-CSF的表位的抗体或其功能片段。所述表位优选包括氨基酸23-27(RRLLN)和/或氨基酸65-77(GLR/QGSLTKLKGPL)。氨基酸序列伸展段(stretch)65-77内在位置67处的变异反映了GM-CSF此部份中在一方面为人和长臂猿GM-CSF(其中位置67为R)和另一方面为猕猴家族的猴(例如食蟹猕猴和恒河猴(其中位置67为Q))之间的异质性。如果所述表位包括两个非邻接的氨基酸序列伸展段，诸如23-27(RRLLN)及65-77(GLR/QGSLTKLKGPL)，所述表位也可称作“不连续”表位。所述GM-CSF表位或所述GM-CSF不连续表位可进一步包括氨基酸28-31(LSRD)、氨基酸32-33(TA)和/或氨基酸21-22(EA)。
所述人类单克隆抗体或其功能片段优选在其重链可变区中包括含选自SEQ ID NOs:1-13和56的氨基酸序列的CDR3；优选地，所述重链可变区CDR3包括在SEQ ID NO:2中示出的氨基酸序列。
任何所述重链可变区CDR3序列可进一步在重链可变区中与以下一起存在：包括在SEQ ID NO:14中示出的氨基酸序列的重链可变区CDR1和包括在SEQ ID NO:15中示出的氨基酸序列的重链可变区CDR2。
此外，所述人类单克隆抗体或其功能片段可在其轻链可变区中包括含在SEQ ID NO:16中示出的氨基酸序列的CDR1、含在SEQ ID NO:17中示出的氨基酸序列的CDR2和含在SEQ ID NO:18中示出的氨基酸序列的CDR3。
在本发明一个尤其优选的方面，所述人类单克隆抗体或其功能片段在其轻链可变区中包括含如在SEQ ID NO:16中示出的氨基酸序列的CDR1、含如在SEQ ID NO:17中示出的氨基酸序列的CDR2和含如在SEQ ID NO:18中示出的氨基酸序列的CDR3，并且在其重链可变区中包括含如在SEQ ID NO:14中示出的氨基酸序列的CDR1、含如在SEQ ID NO:15中示出的氨基酸序列的CDR2和含选自在SEQ ID NOs:1-13和56中示出的氨基酸序列、最优选为SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR3。
根据一个优选实施方案，所述人类单克隆抗体或其功能片段在其轻链可变区中包括选自在SEQ ID NOs:19、54和55中示出的那些的氨基酸序列。根据另一个优选实施方案，所述人类单克隆抗体或其功能片段在其重链可变区中包括选自在SEQ ID NOs:20-33、52和53中示出的那些的氨基酸序列。所述人类单克隆抗体或其功能片段可在进一步实施方案中包括如在SEQ ID NO:34中示出的轻链氨基酸序列和/或选自在SEQ ID NOs:35-48中的任一者、最优选为SEQ ID NO:35中示出的那些的重链氨基酸序列。
所述人类单克隆抗体或其功能片段可包括与以下相应氨基酸序列具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％同源性的一个或多个氨基酸序列：如SEQ ID NOs:1-48和52-56的任一者中示出的相应氨基酸序列，优选如在SEQ ID NOs:1-18和56的任一者中示出的相应氨基酸序列和/或如在SEQ ID NOs:19-48和52-55的任一者中示出的氨基酸序列内的框架区(framework region，FR)的氨基酸序列。因此，在一个优选实施方案中，所述人类单克隆抗体或其功能片段可包括与如在SEQ ID NOs:1-18和56的任一者中示出的相应氨基酸序列具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％同源性的一个或多个氨基酸序列。
或者，在SEQ ID NOs:1-18和56的任一者中示出的CDR的任一个氨基酸序列中，一、二、三、四、五、六、七、八、九或10个氨基酸可被置换。优选地，此类具有置换的CDR仍能够如本文所述结合至GM-CSF。
替代地或除此之外，优选的是，所述人类单克隆抗体或其功能片段可包括分别与如在SEQ ID NOs:19-48和52-55的任一者中示出的VH、VL、H或L区的相应氨基酸序列具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％同源性的一个或多个氨基酸序列。优选地，同源性涵盖整个VH、VL、H或L氨基酸序列。更优选地，同源性是在如前所述的CDR内，或同源性是在如在SEQ ID NOs:19-48和52-55的任一者中示出的此VH、VL、H或L区的FR(或非CDR)内。因此，在所述FR的每一个中可置换1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25个氨基酸。此类FR置换变体仍能够如本文所述结合至GM-CSF。
技术人员可以容易地鉴别SEQ ID NOs:19-48和52-55内的FR(或非CDR)，因为SEQ ID NOs:1-18和56示出了包括于在SEQ ID NOs:19-48和52-55中示出的VH、VL、H或L序列的一个或多个的CDR序列。即，序列表在序列标识符<223>中提供每一个氨基酸序列的命名。相同的命名指示这些氨基酸序列“归属”在一起，意为CDR包含于VH、VL、H或L区中，例如SEQ ID NOs:16、17、18是被包含于在SEQ ID NO:19示出的氨基酸序列中的CDR的氨基酸序列(因为它们均被命名为“5-306”)。
进一步的示例为，如果置换重链和/或轻链的一个或多个或全部CDR或FR中的氨基酸，那么优选如此获得的“经置换的”序列与“原始”CDR或FR序列具有至少70％、更优选80％、甚至更优选90％、特别优选95％、更特别优选98％或99％的同一性。此意为其与经置换的”序列的同源性程度取决于CDR或FR的长度。
通过标准序列比对程序诸如Vector NTI(InforMaxTM,Maryland,USA)或更优选通过程序BLASTP、优选blastp 2.2.5版(2002年11月16日；参见Altschul,S.F.等人.(1997)Nucl.Acids Res.25,3389-3402)来确定同源性。同源性的百分比基于整个多肽序列的比对(矩阵：BLOSUM 62；空位代价：11.1；截至值设定为10-3)，使用CDR、VH、VL、H或L氨基酸序列的任一者作为配对比较的参考。其计算为作为BLASTP程序输出中的结果示出的“正”(同源的氨基酸)数量除以程序用于比对而选择的氨基酸总数量的百分比。
当在本文使用时，氨基酸或核苷酸序列的同源性可与术语“同一性”相互交换地使用。在本发明中所使用的术语“同一性”意为配对的相同残基的百分比——本发明氨基酸序列或核苷酸序列与讨论的序列的序列同源性比对之后——相对于这两个序列中较长者的残基数目。如上所述，用于确定同源性(或同一性)的程序在氨基酸-对-氨基酸的基础上比较被比对的序列，并且所述程序可对该比较设定严格性的不同水平(例如相同氨基酸、保守氨基酸置换等)。如本文中所使用的术语，如果所讨论的两个氨基酸各自属于相同的化学类别(即酸性、非极性/疏水性、不带电荷的极性和碱性)，则被认为是彼此的“保守置换”。非限制实例为，属于非极性氨基酸的两个不同的氨基酸将被认定是彼此的“保守置换”，即使这两个氨基酸不相同，而一方面为非极性氨基酸、与另一方面为碱性氨基酸时将不被认为是彼此的“保守置换”。Alberts、Johnson、Lewis、Raff、Roberts和Walter的《Molecular Biology of the Cell》第4版(2002)第3.1栏，将氨基酸分成四个主要组别：酸性、非极性、不带电荷的极性和碱性。此分组在本发明的上下文中可用于确定特定氨基酸对所讨论的另一个氨基酸是否为保守取代的目的。上述主要组别可进一步再分类为例如小的非极性和大的非极性氨基酸、大的芳香族氨基酸等。术语“保守的氨基酸置换”还指示对给定氨基酸残基的任一个氨基酸置换，其中该置换残基与给定的残基在化学上是如此的相近而在多肽功能(例如结合)结果方面无实质减少。
中和GM-CSF的化合物通常配制为用于不经肠道的的药物组合物，例如对受试者的静脉内、腹膜内、皮下、肌内、局部或皮内施用，其中优选为皮下施用。在某些实施方案中，药物组合物为液体组合物，优选为水性组合物。
在一个实施方案中，中和GM-CSF的化合物在液体药物组合物中的浓度为至少20mg/ml、优选至少50mg/ml、更优选至少100mg/ml、甚至更优选为约100mg/ml至约200mg/ml，诸如约150mg/ml。在一些实施方案中，例如当该组合物预期用于皮下递送时，可使用较高浓度的中和GM-CSF的化合物。
如上所述，本发明的组合物包括缓冲剂。如本文中所使用，术语“缓冲剂”是指允许液体制剂抵抗pH变化的所添加的组合物。在某些实施方案中，添加的缓冲剂允许液体制剂通过其酸-碱共轭组份的作用而抵抗pH变化。合适缓冲剂的实例包括但不限于缓冲的组氨酸、乙酸盐或柠檬酸盐体系。
本文中所使用的术语“特异性结合(specifically binds)”或相关表示诸如“特异结合(specific binding)”、“特异性结合(binding specifically)”、“特异结合剂”等是指GM-CSF-中和化合物、优选(人)(单克隆)抗体或其功能片段在其靶标(例如GM-CSF或GM-CSF受体)与任何其他与GM-CSF或GM-CSF受体不同的潜在抗原之间辨别的能力，所述辨别的程度为从多个作为潜在结合配偶体的不同抗原中，仅结合GM-CSF/GM-CSF受体，或显著结合。在本发明的意义中，当从多个作为潜在结合配偶体的同样可接近的不同抗原中“显著”结合靶标时，所述靶标比其他与该靶标不同的任何其他抗原至少10倍、优选至少50倍、最优选至少100倍或更大地更频繁(以动态观点)地结合。此类动态测量可例如使用SPR技术诸如Biacore仪器而进行。如本文中所使用，术语“特异性”结合至或相关术语诸如“特异性”识别、“指向”、“与…(特异性)交互作用”和“与…(特异性)反应”意为，根据本发明中和GM-CSF的化合物(例如抗体)对其靶标(例如GM-CSF或GM-CSF受体)显示可察觉的亲和力，且通常与不同于前述靶标的蛋白质或抗原不显示显著的反应性。“可察觉的亲和力”包括以约10-6M(KD)或更强、诸如10-7M或更强的亲和力结合。优选地，当结合亲和力是约10-11至10-8M、优选约10-11至10-9M、更优选约10-11至10-10M时，认定结合为特异的。化合物(例如抗体)是否与靶标特异反应或结合至靶标，可尤其通过将所述化合物与其靶标蛋白质或抗原的反应与所述化合物与不同于其靶标的蛋白质或抗原的反应相比较而容易地测试。优选地，根据本发明的化合物不实质结合至、或不能结合至不同于GM-CSF或GM-CSF受体的蛋白质或抗原。术语“不实质结合”或“不能结合”意为本发明的化合物对不同于GM-CSF或GM-CSF受体的蛋白质或抗原不显示超过30％、优选超过20％、更优选超过10％、特别优选超过9％、8％、7％、6％或5％的反应性。
如本文中所使用，“中和(neutralization)”、“中和剂(neutralizer)”、“中和(neutralizing)”及其文法上相关变体是指GM-CSF生物学效应的部份或完全衰减。此类GM-CSF生物学效应的部份或完全衰减由于GM-CSF-介导过程的修饰、中断和/或废除而造成，诸如信号转导，如例如表现于细胞内信号转导、细胞增殖或可溶物质的释放、细胞内基因活化的上或下调，其导致例如不同于GM-CSF的配体的表面受体的表达。如本领域技术人员所了解，存在确定化合物(例如抗体或其功能片段)是否被分类为中和剂的多个模式。作为实例，此可通过如下一般实施的体外(in vitro)标准测试而完成：在第一增殖实验中，将细胞系(已知其增殖程度取决于GM-CSF的活性)与一系列具有变化浓度的GM-CSF的样本一起孵育，孵育后测量所述细胞系的增殖程度。由此测量，确定允许细胞的最大半增殖值的GM-CSF浓度。然后实施第二增殖实验，其在所述样品系列的每一个中使用与在第一增殖实验中所用的相同数量细胞、上述所确定的GM-CSF浓度，而本次改变疑似为GM-CSF中和剂的化合物的浓度。再次测量细胞增殖以确定所分析的化合物的足以造成最大半生长抑制的浓度。如果所产生的生长抑制相对所分析的化合物浓度的图是呈S形的，导致在增加的所分析的化合物浓度下减低的细胞增殖，则已发生某种程度的生长抑制，即GM-CSF活性已被中和至某一程度。在此情况下，可认定讨论的化合物为本发明意义中的“中和剂”。细胞系的一个实例(已知其增生程度取决于GM-CSF活性)为TF-1细胞系，如Kitamura,T.等人.(1989).J Cell Physiol 140,323-34中所描述。
如本领域普通技术人员所理解，细胞增殖的程度并非是可建立GM-CSF中和能力的唯一参数。例如，信号转导分子(例如细胞因子)的水平的测量，其取决于GM-CSF的分泌水平，可用于鉴别疑似的GM-CSF中和剂/GM-CSF抑制化合物。
可用于确定讨论的化合物(诸如抗体或其功能片段)是否为GM-CSF活性的中和剂的细胞系的其他实例包括AML-193(Lange,B.等人.(1987).Blood 70,192-9)；GF-D8(Rambaldi,A.等人.(1993).Blood 81,1376-83)；GM/SO(Oez,S.等人.(1990).Experimental Hematology 18,1108-11)；MO7E(Avanzi,G.C.等人.(1990).Journal of Cellular Physiology 145,458-64)；TALL-103(Valtieri,M.等人.(1987).Journal of Immunology 138,4042-50)；和UT-7(Komatsu,N.等人.(1991).Cancer Research 51,341-8)。
理解关于本发明的GM-CSF中和可在具有GM-CSF受体的细胞外或在所述细胞内发生。因此，通过化合物的GM-CSF中和可为抑制或预防GM-CSF结合至特异受体或通过细胞因子结合至它们的受体而诱导的细胞内信号的抑制。中和GM-CSF的化合物可例如直接结合至GM-CSF或GM-CSF受体，由此在两种情况下均干扰GM-CSF的生物学效应。
如本文以上所定义，GM-CSF的抑制剂可选自多肽、拟肽、核酸分子和小分子。
本文所使用的术语“多肽”描述这样的分子组，其通常由经共价肽键而彼此耦合的至少30个氨基酸组成。根据本发明，多肽组包括由单一多肽或超过一种多肽组成的“蛋白质”。术语“多肽”还描述蛋白质的片段，只要这些片段由至少30个氨基酸组成。本领域熟知多肽可形成多聚体(multimer)，诸如二聚体、三聚体和更大的寡聚体，即由超过一个多肽分子组成。此类多聚体也由术语“多肽”所涵盖。形成此类二聚体、三聚体等的多肽分子可为相同的或不同的。因此，此类多聚体对应的较高级结构称为同或异二聚体、同或异三聚体等。异多聚体的实例为抗体分子，其在其天然存在形式中由两个相同的轻多肽链和两个相同的重多肽链组成。术语“多肽”和“蛋白质”还指天然或非天然修饰的多肽/蛋白质，其中修饰例如通过翻译后修饰如醣基化、乙酰化、磷酸化、形成二硫键及其类似物进行；或通过化学修饰诸如聚乙二醇化(PEGylation)而进行。本领域熟知此类修饰。
术语“核酸”或“多核苷酸”在本发明的上下文中定义由多个磷酸、糖和嘌呤与嘧啶碱的重复单元组成的聚合的大分子。这些分子的实施方案包括DNA、RNA和PNA。核酸可为单链或双链、线性或环状的。本发明上下文中核酸的一个特别优选的实施方案为适体(aptamer)。核酸适体为基于其结合至其他分子的能力而从随机池中选择的DNA或RNA分子。适体已选择为结合核酸、蛋白质、小的有机化合物及甚至整个生物体。其由寡核苷酸的通常短链、一般为50个碱或更少组成。
术语“小分子”定义具有低于1000道尔顿、优选至多800道尔顿、更优选300至700道尔顿的分子量的有机药物化合物组。对小分子的分子量上限允许快速跨细胞膜扩散的可能性，使得其可到达作用的细胞内位置。对应的小分子可源自至少部份随机化的肽文库。根据本发明适合的小分子库是本领域熟知的，和/或可从商业发布者处购买。
术语“拟肽”描述设计来模拟肽的小的蛋白质类链。此类分子通过修饰存在的肽而人工地得到以便改变分子的性质。例如，修饰存在的母肽以改变分子的稳定性或生物学活性。这些修饰包括骨架的改变和引入非天然氨基酸。
术语“GM-CSF受体”指GM-CSF的生理细胞表面受体，其在本领域中描述为α-链(CD116)和普通β(β-c)亚基的异聚体(heteromer)。
中和多肽的优选实施方案是抗体或其功能片段，更优选是人抗体或其功能片段。用于制造抗体的技术是此领域熟知的，例如在Harlow和Lane"Antibodies,A Laboratory Manual",Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988与Harlow和Lane"Using Antibodies:A Laboratory Manual"Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999中描述。
术语“抗体”的定义包括实施方案诸如单克隆、嵌合、单链、人源化和人抗体。除了全长抗体外，该定义还包括抗体衍生物和抗体片段，尤其像是Fab片段。抗体片段或衍生物进一步包括F(ab')2、Fv、scFv片段或单结构域抗体诸如结构域抗体或纳米抗体(nanobody)、单可变结构域抗体或包括仅一个可变结构域的免疫球蛋白单可变结构域，其可为VHH、VH或VL，其独立于其他V区域或结构域特异性结合抗原或表位；参见例如引述于Harlow和Lane(1988)及(1999)；Kontermannhe和Dübel,Antibody Engineering,Springer,2nd ed.2010；和Little,Recombinant Antibodies for Immunotherapy,Cambridge University Press 2009。所述术语还包括二抗体(diabody)或双-亲和力再-靶向(Dual-Affinity Re-Targeting，DART)抗体。进一步设想的是(双特异性)单链二抗体、串联二抗体(Tandab)、“迷你抗体(minibody)”，由下列结构例示：(VH-VL-CH3)2、(scFv-CH3)2或(scFv-CH3-scFv)2、“FcDART”和“IgG DART”；多抗体(multibody)诸如三抗体(triabody)。免疫球蛋白单可变结构域不仅涵盖分离的抗体单可变结构域多肽，还涵盖包括抗体单可变结构域多肽序列的一个或多个单体的较大多肽。
并且，如本文所使用的术语“抗体”还涉及本文所述抗体的衍生物或变体，其显示如所述抗体的相同特异性。“抗体变体”的实例包括非人抗体的人源化变体、“亲和力成熟的”抗体(参见例如Hawkins等人.J.Mol.Biol.254,889-896(1992)和Lowman等人.,Biochemistry 30,10832-10837(1991))和具有经改变效应功能的抗体突变体(参见例如引述于美国专利5,648,260、Kontermann和Dübel(2010)以及Little(2009))。
术语“抗体”还包括不同类别的免疫球蛋白(Ig’s)(即IgA、IgG、IgM、IgD和IgE)及亚类(诸如IgG1、IgG2等)。抗体的衍生物(其也落入本发明意义中术语抗体的定义)包括此类分子的修饰，例如醣基化、乙酰化、磷酸化、形成二硫键、法尼基化(farnesylation)、羟基化、甲基化或酯化。
抗体的功能片段包括F(ab’)2片段的结构域、Fab片段、scFv或包括单免疫球蛋白可变结构域或单结构域抗体多肽的构建体，例如单重链可变结构域或单轻链可变结构域、以及其他如本文以上所描述的抗体片段。F(ab’)2或Fab可经工程化以最小化或完全移除存在于CH1和CL结构域之间的分子间二硫键交互作用。
如本文中所使用的术语“人”抗体理解为表示，抗体或其功能片段包括在人胚系抗体集(germline antibody repertoire)中所包含的氨基酸序列。用于本文的目的，如果抗体或其片段由此类人胚系氨基酸序列组成，即如果该讨论的抗体或其功能片段的氨基酸序列与表现的人胚系氨基酸序列相同，则可因此认为所述抗体或其片段为人的。如果抗体或其功能片段由与它(它们)最接近的人胚系序列偏移不超过因体细胞超突变印记造成所预期的序列组成，则所述抗体或其功能片段也可被认为是人的。此外，许多非人哺乳动物(例如啮齿类动物，诸如小鼠及大鼠)的抗体包括可预期也存在于的人抗体集中的VH CDR3氨基酸序列。可预期存在于表现的人抗体集中的任何此类人或非人起源的序列也被认为用于本发明目的的“人的”。术语“人抗体”因此包括具有基本上对应于本领域已知的人胚系免疫球蛋白序列的可变和恒定区域的抗体，包括例如描述于Kabat等人(参见引述于Kabat等人(1991))的那些。本发明的人抗体可包括不是由人胚系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位置特异性诱发或通过体内体细胞突变所引入的突变)，例如在CDR中，特别在CDR3中。人抗体可具有至少一、二、三、四、五或更多个位置被不是由人胚系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基替换。
非人和人抗体或其功能片段优选为单克隆的。制备单克隆的人抗体尤其困难。和鼠类B细胞与永生化细胞系的融合不同，人B细胞与永生化细胞系的融合并非可行。因此，人类单克隆抗体是克服一般已知存在于抗体技术领域的显著技术障碍的结果。抗体的单克隆天性使其特别适合于用作治疗剂，因此此类抗体将作为可良好表征且可再现地制造和纯化的单一、均匀分子种类存在。此类因素导致其生物学活性可以高水平精确度预测的产品是非常重要的，如果此类分子将要得到在人体中治疗施用的审查批准的话。本文所用术语“单克隆抗体”是指获自基本上均匀的抗体群的抗体，基本上均匀的抗体群即构成该群的个别抗体除了可能自然发生的突变和/或可能少量存在的翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)以外是相同的。单克隆抗体是高度特异的，从而指向单一抗原位点。此外，与典型包括指向不同决定子(表位)的不同抗体的传统(多株)抗体制备物相反，每一个单克隆抗体指向抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们为通过杂交瘤培养而合成的，并未被其他免疫球蛋白污染。修饰词“单克隆”表明抗体的特征是从抗体的基本上均匀的群体所获得的，并且不将理解为需要通过任何特定方法制造该抗体。例如，根据本发明待使用的单克隆抗体可通过首先由Kohler等人.,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法制造，或可通过重组DNA法制造(参见例如美国专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”也可使用例如描述于Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)的技术从噬菌抗体文库分离。
尤其优选的是单克隆抗体或对应的功能片段是人抗体或对应的功能片段。在构思预期用于给人治疗施用的抗体剂时，抗体具有人源是高度有利的。施用至人患者之后，人抗体或其功能片段将最可能不引起患者的免疫系统的强烈免疫原性反应，即将不会被认为是非人蛋白质的外来物。此意味着将不会产生对抗该治疗抗体的宿主(即患者)抗体，否则其将阻断治疗抗体的活性和/或加速或治疗抗体从患者体内的清除，因而阻止其发挥所期望的治疗效果。
根据本发明的一个优选实施方案，要用于医药目的人类单克隆抗体或其功能片段表现出人和至少一种猴物种之间的反应性。对所有其他非抗体或源自非抗体的GM-CSF中和/抑制化合物来说，同样的跨物种反应性也是优选的。
根据本发明的另一个实施方案，抗体可为IgG抗体。IgG同工型不仅包括对高度区别性抗原识别和结合负责的重和轻链的可变抗体区域，还包括通常存在于“天然”产生的抗体(在一些实例中甚至在一个或多个位点以碳水化合物修饰)的重和轻抗体多肽链的恒定区域。此类醣基化通常为IgG形式的标志，且位于包括所谓整个抗体的Fc区域的恒定区域，已知其在体内引起不同的效应功能。此外，Fc区域介导IgG与Fc受体的结合，以及促进IgG回到具有增加的Fc受体存在的地方，例如发炎组织。有利地，IgG抗体为IgG1抗体或IgG4抗体，这些形式是优选的，因为它们在体内的作用机制已得到特别充分的了解和表征。IgG1抗体的情况尤为此。
根据本发明的另一个实施方案，抗体的功能片段优选可为scFv、单结构域抗体、Fv、VHH抗体、二抗体、串联二抗体、Fab、Fab’或F(ab)2。这些形式通常可被分成两种亚类，即由单一多肽链组成的那些和包括至少两个多肽链的那些。前一亚类的成员包括scFv(包括经由多肽连接物结合成单一多肽链的一个VH区域和一个VL区域)；单结构域抗体(包括单一抗体可变区域)诸如VHH抗体(包括单一VH区域)。后一亚类的成员包括Fv(包括一个VH区域和一个VL区域，作为彼此非共价地连接的分离的多肽链)；二抗体(包括两个非共价地连接的多肽链，其中每者包括两个抗体可变区域(通常为一个VH和一个VL多肽链)，该两个多肽链呈头对尾构型排列，使得产生二价抗体分子)；串联二抗体(双特异性单链Fv抗体，其包括四个共价连接的具有两种不同特异性的免疫球蛋白可变(VH和VL)区域，从而形成如同上述二抗体的两倍大的同元二聚体)；Fab(包括作为一个多肽链的完整抗体轻链，其本身包括VL区域和完整轻链恒定区域，及作为另一个多肽链的部份抗体重链，其包括全部的VH区域和部份重链恒定区域，所述两个多肽链经由链间双硫键而分子间连接)；Fab’(如以上Fab，除了具有包括于该抗体重链中的另外的还原双硫键)；和F(ab)2(包括两个Fab’分子，每个Fab’分子经由链间二硫键分别连接至相应其他Fab’分子)。一般而言，本文上文所描述类型的功能抗体片段允许很大的修改灵活性，例如针对期望用于到来的特定紧急状况的治疗施用的抗体的药物动力学性质。例如，可能希望减小施用的抗体尺寸，以便当处理的组织已知难以血管化(例如关节)时增加组织穿透的程度。在一些情况下，可能还希望增加治疗抗体自体内清楚的速率，所述速率通常通过降低所施用抗体的尺寸而可加速。在本发明上下文中，只要该片段维持对亲本抗体的表位/靶标的特异性结合特征，即只要其特异性结合至GM-CSF或GM-CSF受体，则抗体片段是定义为功能抗体片段。
根据本发明另一个实施方案，所述抗体或其功能片段可以下述形式存在：单价单特异性的；多价单特异性的，尤其是二价单特异性的；或多价多特异性的，尤其是二价双特异性的。一般而言，多价单特异性的、尤其是双价单特异性的抗体诸如本文上述的全长人IgG可使其具有以下治疗优势：通过亲和效应加强由此类抗体实施的中和化，即通过同一抗体结合至同一抗原的多个分子，此处为GM-CSF或GM-CSF受体。数种单价单特异性的抗体片段形式已于上文描述(例如scFv、Fv、VHH或单结构域抗体)。多价多特异性的、尤其是二价双特异性的抗体形式可包括全长IgG，其中一个结合臂结合至灵长类动物GM-CSF/GM-CSF受体，而其的另一个结合臂结合至与GM-CSF/GM-CSF受体不同的另一个抗原。其他多价多特异性的、尤其是二价双特异性的形式可有利地为人单链双特异性抗体，即包括如上所述的两个scFv实体的重组人抗体构建体，其通过此领域通常已知的短插入多肽间隔体连接为一个连续的多肽链(参见例如WO 99/54440的抗-CD19x抗-CD3双特异性单链抗体)。此处，包括于双特异性单链抗体中的双特异性的单链抗体的一个scFv部份将如上所述特异性结合GM-CSF/GM-CSF受体，而此双特异性的单链抗体的相应另一个scFv部份将结合确定具有治疗有益作用的另一个抗原。
根据另一个实施方案，所述抗体或其功能片段可被衍生化，例如用有机聚合物，例如用一个或多个聚乙二醇(“PEG”)和/或聚乙烯基吡咯啶酮(“PVP”)分子。如此领域已知，此类衍生化可有利于调节抗体或其功能片段的药物动力学性质。尤其优选的是衍生为PEG-马来酰亚胺的PEG分子，从而允许以位点特异性方式经由半胱氨酸氨基酸的巯基基团与抗体或其功能片段缀合。在这些之中，尤其优选20kD和/或40kD的PEG-马来酰亚胺，呈分支或直链形式的。可尤其有利的是通过将后者耦合至一个或多个PEG、尤其是PEG-马来酰亚胺而增加较小人抗-GM-CSF抗体片段(诸如scFv片段)的有效分子量。
本发明的抗体还包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中该重和/或轻链的一部份与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或为同源的，而该链的剩余部份与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以此类抗体的片段中的对应序列相同或为同源的，只要它们表现所期望的生物学活性即可(美国专利No.4,816,567；Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类动物化的”抗体，其包括源自非人灵长类动物(例如旧大陆猴、人猿等)的可变结构域抗原-结合序列和人恒定区域序列。
非人(例如鼠类)抗体的“人源化”形式是大多人序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab’、F(ab')2或抗体的其他抗原-结合亚序列)，其包含源自非人免疫球蛋白的最少序列。对于多数部份，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的超可变区域(及CDR)的残基由来自非人物种(共体抗体)的超可变区域的残基替换，所述非人物种诸如具有所需特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠或兔。在一些例子，人免疫球蛋白的Fv框架区域(FR)残基由对应的非人残基替换。此外，用于本文中的“人源化抗体”还可包括未见于受体抗体也未见于供体抗体中的残基。进行这些修饰以进一步改良和优化抗体性能。人源化抗体理想地还包括免疫球蛋白恒定区域(Fc)的至少一部分，典型地为人免疫球蛋白样的至少一部分。关于进一步详情，参见Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Reichmann等人,Nature,332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-59(1992)。
如本文中所使用，人和非人灵长类动物GM-CSF的氨基酸残基或位置的编号是指成熟GM-CSF的编号，所述成熟GM-CSF即不含其17个氨基酸的信号序列的GM-CSF(于上述人和非人灵长类动物物种两者中成熟GM-CSF的总长为127个氨基酸)。人类GM-CSF和长臂猿GM-CSF的序列如下：
SEQ ID NO:49
APARSPSPST QPWEHVNAIQ EATAAEMNETV EVISEMFDLQ
EPTCLQTRLE LYKQTMM ASHYKQHCPP TPETSCATQI
ITFESFKENL KDFLLVIPFD CWEPVQE
猕猴家族某些成员(诸如例如恒河猴和食蟹猕猴(cynomolgous monkey))中的GM-CSF序列如下：
SEQ ID NO:50
APARSPSPGT QPWEHVNAIQ EATAAEMNKTV EVVSEMFDLQ
EPSCLQTRLE LYKQTMM ASHYKQHCPP TPETSCATQI
ITFQSFKENL KDFLLVIPFD CWEPVQE
人类GM-CSF的序列还在SEQ ID NO:57中示出。长臂猿GM-CSF的序列也在SEQ ID NO:58中示出：
(SEQ ID NO:57和58)
猕猴家族中的某些成员(诸如例如恒河猴(SEQ ID NO:59)和食蟹猕猴(cynomolgous monkey)(SEQ ID NO:60))的GM-CSF序列还如下：
(SEQ ID NO:59和60)
如本文中所述通过抗体、优选为人类单克隆抗体(或其功能片段)结合的最小表位、有利地为不连续表位是在GM-CSF序列指出且于上所示呈粗体的。
根据一个优选实施方案，中和GM-CSF的化合物为抗体(优选为人类单克隆抗体)或其功能片段，其结合至GM-CSF。更优选地，其结合至GM-CSF的表位，所述表位优选包括氨基酸23-27(RRLLN)和/或氨基酸65-77(GLR/QGSLTKLKGPL)。这些氨基酸序列伸展段在以上的GM-CSF序列中呈粗体指出。术语“表位”是指抗原或靶标(例如GM-CSF)中化合物(诸如抗体或其功能片段)特异性结合的位点。所述结合/交互作用也理解为定义“特异性识别”。“表位”可通过邻接的氨基酸或通过蛋白质三级折叠而并列的非邻接的氨基酸两者形成。“线性表位”是其中氨基酸一级序列包括所识别的表位的表位。线性表位典型地在唯一序列中包括至少3个或至少4个、更常见的至少5个或至少6个或至少7个、例如约8至约10个氨基酸或更多。在本发明上下文中，所述GM-CSF表位优选是不连续表位。在抗体结合至序列伸展段23-27和65-77两者的情况下，所述表位可被称为“不连续的”。在人类GM-CSF的二级结构中，氨基酸15-35处于螺旋A中，而对应于位置65-77的残基是位于螺旋C和D间的环状结构的部份。分子折叠的三维结构模型揭露了这些位点相对于彼此的相近空间邻近性(也参见WO 2006/111353)。如本文中所使用，术语“不连续表位”理解为在给定的多肽链(此处为成熟人和非人灵长类动物GM-CSF)内至少两个非相邻氨基酸序列伸展段，其同时地且特异性地被抗体结合。根据此定义，此类同时特异性结合可为呈线性形式的GM-CSF多肽的。此处，可以想象形成延伸环的成熟GM-CSF多肽，在其一区域中以上粗体指出的两个序列排列，例如多于或少以平行状和与彼此邻近的。在此状态下，它们特异性且同时地被抗体片段结合。根据此定义，以上指出的成熟GM-CSF的两个序列伸展段的同时特异性结合也可采取抗体结合至构型表位的形式。此处，成熟GM-CSF已形成如其一般在体内存在的三级构型。在此三级构型中，成熟GM-CSF的多肽链折叠，折叠方式使以上所指出的两个序列伸展段成为空间邻近的，例如在成熟、折叠的GM-CSF的特定区域的外表面上，这是它们接着在所环绕的多肽序列的情况下通过其三维构型而被识别。
在另一个优选实施方案中，GM-CSF的上述表位或上述不连续表位进一步包括：
·氨基酸28-31(LSRD)，在人和非人灵长类动物GM-CSF的上述序列中呈斜体；
·氨基酸32-33(TA)，在人和非人灵长类动物GM-CSF的上述序列中带下划线；和/或
·氨基酸21-22(EA)，在人和非人灵长类动物GM-CSF的上述序列中带下划线。
优选的人单克隆抗-GM-CSF抗体或其功能片段为如特别公开于WO2006/111353中表示为SEQ ID NOs 1至48和52至56的那些，其中示出了重和轻链互补决定区域(CDR)1-3的氨基酸序列以及重和轻链的可变区域以及重及轻链的全长。
尤其优选的抗-GM-CSF抗体或其功能片段包括如在SEQ ID NO:14中示出的重链可变区CDR1序列、如在SEQ ID NO:15中示出的重链可变区CDR2序列和如在SEQ ID NO:1中示出的重链可变区CDR3序列；或包括如在SEQ ID NO:14中示出的重链可变区CDR1序列、如在SEQ ID NO:15中示出的重链可变区CDR2序列和如在SEQ ID NO:2中示出的重链可变区CDR3序列；或包括如在SEQ ID NO:14中示出的重链可变区CDR1序列、如在SEQ ID NO:15中示出的重链可变区CDR2序列和如在SEQ ID NO:3中示出的重链可变区CDR3序列；或包括如在SEQ ID NO:14中示出的重链可变区CDR1序列、如在SEQ ID NO:15中示出的重链可变区CDR2序列和如在SEQ ID NO:4中示出的重链可变区CDR3序列；或包括如在SEQ ID NO:14中示出的重链可变区CDR1序列、如在SEQ ID NO:15中示出的重链可变区CDR2序列和如在SEQ ID NO:5中示出的重链可变区CDR3序列；或包括如在SEQ ID NO:14中示出的重链可变区CDR1序列、如在SEQ ID NO:15中示出的重链可变区CDR2序列和如在SEQ ID NO:6中示出的重链可变区CDR3序列；或包括如在SEQ ID NO:14中示出的重链可变区CDR1序列、如在SEQ ID NO:15中示出的重链可变区CDR2序列和如在SEQ ID NO:7中示出的重链可变区CDR3序列；或包括如在SEQ ID NO:14中示出的重链可变区CDR1序列、如在SEQ ID NO:15中示出的重链可变区CDR2序列和如在SEQ ID NO:8中示出的重链可变区CDR3序列；或包括如在SEQ ID NO:14中示出的重链可变区CDR1序列、如在SEQ ID NO:15中示出的重链可变区CDR2序列和如在SEQ ID NO:9中示出的重链可变区CDR3序列；或包括如在SEQ ID NO:14中示出的重链可变区CDR1序列、如在SEQ ID NO:15中示出的重链可变区CDR2序列和如在SEQ ID NO:10中示出的重链可变区CDR3序列；或包括如在SEQ ID NO:14中示出的重链可变区CDR1序列、如在SEQ ID NO:15中示出的重链可变区CDR2序列和如在SEQ ID NO:11中示出的重链可变区CDR3序列；或包括如在SEQ ID NO:14中示出的重链可变区CDR1序列、如在SEQ ID NO:15中示出的重链可变区CDR2序列和如在SEQ ID NO:12中示出的重链可变区CDR3序列；或包括如在SEQ ID NO:14中示出的重链可变区CDR1序列、如在SEQ ID NO:15中示出的重链可变区CDR2序列和如在SEQ ID NO:13中示出的重链可变区CDR3序列；或包括如在SEQ ID NO:14中示出的重链可变区CDR1序列、如在SEQ ID NO:15中示出的重链可变区CDR2序列和如在SEQ ID NO:56中示出的重链可变区CDR3序列。
更为优选地，以上重链CDR1、CDR2和CDR3序列的14个组合中的任一者存在于抗体或其功能片段中，所述抗体或其功能片段进一步在其轻链可变区中包括含在SEQ ID NO:16中示出的氨基酸序列的CDR1、含在SEQ ID NO:17中示出的氨基酸序列的CDR2和含在SEQ ID NO:18中示出的氨基酸序列的CDR3。
尤其优选的抗-GM-CSF抗体或其功能片段包括如在SEQ ID NO:14中示出的重链可变区CDR1序列、如在SEQ ID NO:15中示出的重链可变区CDR2序列和如在SEQ ID NO:2中示出的重链可变区CDR3序列，进一步在其轻链可变区中包括含在SEQ ID NO:16中示出的氨基酸序列的CDR1、含在SEQ ID NO:17中示出的氨基酸序列的CDR2和含在SEQ ID NO:18中示出的氨基酸序列的CDR3。此抗-GM-CSF抗体是用于中和GM-CSF的最优选的化合物，且还描述于WO 2006/111353。
根据另一个实施方案，抗-GM-CSF抗体或其功能片段在轻链可变区中包括如在SEQ ID NO.19中示出的氨基酸序列。优选为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.19中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:20中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.19中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:21中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.19中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:22中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.19中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:23中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.19中示出的氨基酸序列某，重链可变区包括如在SEQ ID NO:24中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.19中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:25中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.19中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:26中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.19中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:27中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.19中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:28中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.19中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:29中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.19中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:30中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.19中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:31中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.19中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:32中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.19中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:33中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.19中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:52中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.19中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:53中示出的氨基酸序列。
根据另一个实施方案，所述抗-GM-CSF抗体或其功能片段于在轻链可变区中包括如在SEQ ID NO.54中示出的氨基酸序列。优选为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.54中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:20中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.54中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:21中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.54中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:22中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.54中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:23中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.54中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:24中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.54中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:25中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.54中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:26中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.54中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:27中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.54中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:28中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.54中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:29中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.54中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:30中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.54中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:31中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.54中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:32中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.54中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:33中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.54中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:52中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.54中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:53中示出的氨基酸序列。
根据另一个实施方案，所述抗-GM-CSF抗体或其功能片段在其轻链可变区中包括如在SEQ ID NO.55中示出的氨基酸序列。优选为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.55中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:20中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.55中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:21中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.55中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:22中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.55中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:23中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.55中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:24中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.55中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:25中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.55中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:26中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.55中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:27中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.55中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:28中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.55中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:29中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.55中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:30中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.55中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:31中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.55中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:32中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.55中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:33中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.55中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:52中示出的氨基酸序列；或者为这样的抗体或其功能片段，其轻链可变区包括如在SEQ ID NO.55中示出的氨基酸序列，重链可变区包括如在SEQ ID NO:53中示出的氨基酸序列。
优选的抗-GM-CSF抗体或其功能片段在其轻链可变区中包括含如在SEQ ID NO.16中示出的氨基酸序列的CDR1、含如在SEQ ID NO.17中示出的氨基酸序列的CDR2和含如在SEQ ID NO.18中示出的氨基酸序列的CDR3，并且在其重链可变区中包括含如在SEQ ID NO.14中示出的氨基酸序列的CDR1、含如在SEQ ID NO.15中示出的氨基酸序列的CDR2和含如在SEQ ID NOs.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或56的任一者中示出的氨基酸序列的CDR3。
在另一个优选实施方案中，所述抗体在其轻链中包括如在SEQ ID NO:34中示出的氨基酸序列，且在其重链中包括如在SEQ ID NO:35中示出的氨基酸序列；或在其轻链中包括如在SEQ ID NO:34中示出的氨基酸序列，且在其重链中包括如在SEQ ID NO:36中示出的氨基酸序列；或在其轻链中包括如在SEQ ID NO:34中示出的氨基酸序列，且在其重链中包括如在SEQ ID NO:37中示出的氨基酸序列；或在其轻链中包括如在SEQ ID NO:34中示出的氨基酸序列，且在其重链中包括如在SEQ ID NO:38中示出的氨基酸序列；或在其轻链中包括如在SEQ ID NO:34中示出的氨基酸序列，且在其重链中包括如在SEQ ID NO:39中示出的氨基酸序列；或在其轻链中包括如在SEQ ID NO:34中示出的氨基酸序列，且在其重链中包括如在SEQ ID NO:40中示出的氨基酸序列；或在其轻链中包括如在SEQ ID NO:34中示出的氨基酸序列，且在其重链中包括如在SEQ ID NO:41中示出的氨基酸序列；或在其轻链中包括如在SEQ ID NO:34中示出的氨基酸序列，且在其重链中包括如在SEQ ID NO:42中示出的氨基酸序列；或在其轻链中包括如在SEQ ID NO:34中示出的氨基酸序列，且在其重链中包括如在SEQ ID NO:43中示出的氨基酸序列；或在其轻链中包括如在SEQ ID NO:34中示出的氨基酸序列，且在其重链中包括如在SEQ ID NO:44中示出的氨基酸序列；或在其轻链中包括如在SEQ ID NO:34中示出的氨基酸序列，且在其重链中包括如在SEQ ID NO:45中示出的氨基酸序列；或在其轻链中包括如在SEQ ID NO:34中示出的氨基酸序列，且在其重链中包括如在SEQ ID NO:46中示出的氨基酸序列；或在其轻链中包括如在SEQ ID NO:34中示出的氨基酸序列，且其重链中包括如在SEQ ID NO:47中示出的氨基酸序列；或在其轻链中包括如在SEQ ID NO:34中示出的氨基酸序列，且在其重链中包括如在SEQ ID NO:48中示出的氨基酸序列。在其轻链中包括如在SEQ ID NO:34中示出的氨基酸序列且在其重链中包括如在SEQ ID NO:35中示出的氨基酸序列的抗-GM-CSF抗体是用于中和GM-CSF的最优选的化合物，且还描述于WO2006/111353。
以上优选的实施方案提供抗体分子和/或其功能片段，优选为人类单克隆抗体分子和/或其功能片段，其尤其有利作为灵长类动物和人类GM-CSF活性的中和剂。根据这些尤其优选的实施方案的抗体或其功能片段由于若干理由而是高度有利的。
首先，它们以高特异性识别灵长类动物和人类GM-CSF。也就是说，从灵长类动物GM-CSF与其他灵长类动物群落刺激因子的混合物(例如灵长类动物G-CSF和M-CSF)，根据这些尤其优选的实施方案的结合分子对于灵长类动物GM-CSF是高度鉴别的，而相同环境中的其他群落刺激因子不被识别。相同情况经必要变通适用于人类GM-CSF。此意为根据这些实施方案的抗体或其功能片段，当施用至人时，将被预期仅特异性结合至和中和预期的靶标，而其他非期望的靶标未被结合或未被中和。最终地，这导致关于体内治疗作用模式的高可预测性。
第二，根据这些尤其优选的实施方案的结合剂以可察觉的亲和力结合至灵长类动物和人类GM-CSF。“可察觉的亲和力”包括以约10-6M(KD)亲和力或更强的亲和力结合。优选地，当结合亲和力为约10-12至10-8M、10-12至10-9M、10-12至10-10M、10-11至10-8M，优选为约10-11至10-9M时，结合被认为是可察觉的(或高的、或特异性的)。因此，本发明的结合剂优选具有在该范围内的KD。对本文中所描述的抗体分子，已观察到KD值为约4x 10-9M至低至约0.04x 10-9M(后者对应为约40pM)，考虑到这一事实，优选的是本发明的抗体分子具有在该范围内的KD。然而，还优选的是本发明的抗体分子具有如本文以上所描述的KD。因为此类分子在水性介质中的动力学向前速率(on-rate)是大幅地扩散控制的，并因此无法改善至超过将于生理条件下允许的局部扩散条件，因此发生主要由于动力学的往回速率(off-rate，koff)所导致的低KD，其对于最高的亲和力抗体结合剂是大约10-5s-1。此意为一旦在一方面为根据任一这些实施方案的人类单克隆抗体或其功能片段与另一方面为GM-CSF直接的复合物形成，其不会容易地或至少不会快速地分开。对于预期作为生物学活性中和剂的结合分子，这些特征是高度有利的，因为只要其生物学活性待中和的的分子(此处为灵长类动物和人类GM-CSF)通过中和结合分子而维持结合，所期望的中和效应一般将持续下去。因此与其预期目标维持结合一段长时间的中和分子将继续中和持续相应的长时间。
抗体或其功能片段对灵长类动物和人类GM-CSF的高结合亲和力具有另外的优点。一般而言，抗体或其功能片段将以取决于尺寸的方式从患者的血流中清楚，较小分子是比较大分子先被排出和清除。因为这两个多肽(抗体或抗体片段和结合的GM-CSF)的复合物显然地大于单独的抗体，以上所提及的低koff具有这样的效应：与治疗中和剂未结合至GM-CSF的情况相比，其更慢地从患者的体内排出和清除。因此，不仅中和活性的大小，而且其于体内的持续期间均增加。
对于根据以上实施方案的结合剂所测定的中和活性惊人地高。如将于以下更详尽地描述的，GM-CSF-中和活性使用TF-1生长抑制测定法在体外测量(Kitamura,T.等人(1989).J.Cell Physiol.140,323-34)。作为中和潜力的指示，测量IC50值，IC50代表引起TF-1细胞增殖的最大半抑制所需要的根据这些实施方案中任一个的抗体或其功能片段的浓度。对于以上指明的人类单克隆抗-GM-CSF抗体或其功能片段，测定IC50值为大约3x 10-10M或约0.3nM。所述结合分子因此是灵长类动物和人类GM-CSF活性的高强度中和剂。
中和性抗-GM-CSF抗体的其他实例为人类E10抗体和人类G9抗体，其描述于Li等人,(2006)PNAS 103(10):3557-3562。E10和G9为IgG类抗体。E10具有对于GM-CSF的870pM的结合亲和力，而G9具有对于GM-CSF的14pM的亲和力。两种抗体均对结合至人类GM-CSF为特异性的，并显示如以TF-1细胞增殖测定法评估的强的中和活性。其他实例为如公开于WO2006/122797的人类抗-GM-CSF抗体。
为抗-GM-CSF受体抗体的GM-CSF拮抗剂或中和剂也可在本发明中使用。此类GM-CSF拮抗剂包括针对GM-CSF受体α链或β链的抗体。在本发明中使用的抗-GM-CSF受体抗体可为如上所解释的任一抗体形式，例如完整、嵌合、单克隆、多克隆、抗体片段或衍生物、单链、人源化、与人类相关的(humaneered)及其类似物。适用于本发明的抗-GM-CSF受体抗体的实例(例如中和性高亲和力抗体)是本领域已知的(参见例如美国专利5,747,032和Nicola等人,Blood 82:151724,1993)。
用于合适抗体的再其他序列在申请中提供且通过全文引用并入。抗-GM-CSF抗体在WO2006/122797、WO2007/049472、WO2007/092939、WO2009/134805、WO2009/064399、WO2009/038760中提供。针对GM-CSF受体的抗体在WO2007/110631中提供。
总之，抗-GM-CSF抗体或其功能片段表现出对于所期望抗原的高程度的辨识度，极度紧密地且长时间结合此抗原，并且展现它们维持结合的长时间的高强度中和活性。同时，结合剂-抗原复合物的长持久性减慢此结合剂从体内的清除，由此增长体内所期望的治疗效果的持续期间。相同特征优选地还应用于识别GM-CSF受体的抗体，同上所述。
根据本发明的组合物优选为药物组合物。根据本实施方案，术语“药物组合物”涉及用于施用至患者、优选为人类患者的组合物。药物组合物或制剂通常为允许活性成份的生物学活性为有效的形式，且可因此如本文所述施用至受试者以用于治疗用途。药物组合物通常包括合适的(即药学上可接受的)载体、稳定剂和/或赋形剂的制剂。在一个优选实施方案中，所述药物组合物为用于不经肠道的、透皮肤的(trans-dermal)、腔内的、动脉内的、囊内的(intra-thecal)和/或鼻内的施用或用于直接注射到组织中的组合物。特别设想所述组合物经由输注或注射而施用至患者。合适组合物的施用可通过不同方式施行，例如通过静脉内的、腹膜内的、皮下、肌内的、局部或皮内的施用。本发明的组合物可进一步包括药学上可接受的载体。合适的药学载体的实例是本领域熟知的，包括缓冲盐水溶液、水、乳液，诸如油/水乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液、脂质体等。包括此类载体的组合物可通过熟知的传统方法配制。
根据本实施方案，术语“有效量”是指对于治疗与GM-CSF相关的疾病(如炎性和自体免疫性障碍)有效的中和GM-CSF的化合物的量。
施用的优选剂量和优选方法使得施用后，中和GM-CSF的化合物以有效剂量存在于血液中。可以通过观察疾病状况和在实验室测试中分析中和GM-CSF的化合物的血清水平，接着延长施用间隔，例如从每周两次或每周一次延长至每两周一次、每三周一次、每四周一次等等，或可替代地对应减少施用间隔，调整施用方案。
药物组合物可以合适的剂量施用至受试者。剂量方案(regimen)将由参与的医师何临床因素所决定。如医学领域中熟知的，用于任一患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型、身体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用的时间和途径、一般健康和同时施用的其他药物。
用于不经肠道的施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油，和可注射的有机酯诸如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液、包括盐水和缓冲介质。不经肠道的的溶媒包括氯化钠溶液、Ringer氏右旋葡萄糖、右旋葡萄糖和氯化钠、乳酸化Ringer氏或不挥发油。静脉内溶媒包括流体和营养素补充剂、电解质补充剂(诸如基于Ringer氏右旋葡萄糖的那些)及类似物。也可存在防腐剂和其他添加剂，诸如例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合试剂、惰性气体及类似者。此外，根据本发明的药物组合物可包括蛋白质性(proteinaceous)载体，例如血清白蛋白或免疫球蛋白、优选人源的。除了上述化合物以外，设想根据本发明的药物组合物可包括进一步的生物学活性试剂，取决于药物组合物的预期用途。此类试剂可为作用于胃-肠系统的药物、作为细胞增殖抑制剂(cytostatica)的药物、预防高尿酸血症(hyperurikemia)的药物、抑制免疫反应的药物(例如皮质类固醇)、调节炎性反应的药物、作用于循环系统的药物和/或诸如本领域已知的细胞因子的试剂。
为了分析GM-CSF中和化合物在例如风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)中的效应，结果测量可例如选自药物动力学、免疫原性和改善RA临床征兆与症状的潜力，如通过DAS28、ACR20/50/70和/或EULAR反应标准、对滑膜炎和骨水肿的MRI成像以及患者报告的结果所测量。ACR是综述于变软和肿胀关节的数量改善、疼痛尺度、患者和医师对改善的评估以及某些实验标记物的度量。ACR 20描述所研究的参加者中达到临床征兆和症状20％改善的百分比，例如在变软或肿胀关节计数中的20％改善以及在三种其他疾病相关标准中的20％改善。
在开发药品(诸如根据本发明的药物组合物)中的另一主要挑战为可预测的药物动力学性质调节。为此目的，建立候选药物的药物动力学概况，即影响特定药物治疗给定病况的能力的药物动力学参数的概括。影响用于治疗某个疾病实体的药物能力的所述药物的药物动力学参数包括但不限于：半衰期、分配的体积、肝一过代谢和血液血清结合的程度。给定药物试剂的功效可以受伤述每一参数所影响。“半衰期”意为50％的所施用药物通过生物学途径，例如代谢、排泄等而清除的时间。“肝一过代谢”意为经与肝第一接触(即在其第一次通过肝的期间)而被代谢的药物的倾向。“分配体积”意为遍及多个身体腔室的药物滞留程度，像是例如细胞内和细胞外空间、组织及器官等与该药物在这些腔室内的分布。“血液血清结合的程度”意为药物与血清蛋白质(诸如白蛋白)相会作用或结合、从而导致药物的生物学活性减少或损失的倾向。
药物动力学参数还包括生物利用度、延迟时间(Tlag)、Tmax、吸收速率和/或所施用药物给定量的Cmax。“生物利用度”意为药物在血液腔室中的量。“延迟时间”意为在药物施用与其在血液或血浆中检测和可测量性之间的时间延迟。“Tmax”是其后达到药物的最大血液浓度的时间，吸收定义为药物从施用处进入体循环的移动，而“Cmax”是以给定药物最大获得的血液浓度。达到其生物学效应所需的药物血液或组织浓度的时间受所有参数影响。
本文所使用的术语“毒性”是指药物显露于负面作用或严重负面作用的毒性效应。这些副作用可指总体缺乏药物的可容忍性和/或在施用后缺乏局部容忍性。毒性也可包括药物造成的致畸形的或致癌的效应。
本文所使用的术语“安全性”、“体内安全性”或“可容忍性”定义直接施用后(局部容忍性)和在施用药物的长时间期间不具有诱导严重负面作用的药物施用。“安全性”、“体内安全性”或“可容忍性”可例如在治疗期间的规则间隔和后续时间段评估。测量包括临床评估，例如器官表现和实验室异常性的筛选。临床评估可根据NCI-CTC和/或MedDRA标准进行和对所纪录/编录的正常发现偏移。器官表现可包括诸如过敏/免疫学、血液/骨髓、心律不整、凝结及类似者的标准，如在例如Common Terminology Criteria for adverse events v3.0(CTCAE)中所述。可被测试的实验室参数例如包括血液学、临床化学、凝结曲线和尿液分析及其他体液的检查，所述其他体液诸如血清、血浆、淋巴液或脊髓液、液体及类似物。安全性可因此通过例如生理检查、成像技术(即超声、x射线、CT扫描、核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)、采用技术装置的其他测量(即心电图)、生命迹象、通过测量实验室参数和纪录负面作用而评估。本文所使用的术语“有效和非毒性剂量”是指对该中和GM-CSF的化合物、优选本文所定义的抗体的可容忍剂量，其是足够高以治愈或稳定目标疾病而未有或实质上未有主要毒性效应。此类有效和非毒性剂量可例如通过本领域中所描述的剂量升高研究而测定，且应在诱导严重负面副作用的剂量(剂量限制毒性，DLT(dose limiting toxicity))以下。
本发明的制剂(本文有时称为“物质的组合物”、“组合物”或“溶液”)优选可为多种物理状态，诸如液体、冷冻的、冷冻干燥的(lyophilized)、冷冻-干燥的(freeze-dried)、喷雾-干燥的和重构制剂，以液体和冷冻为优选的。
本文所用的“液体制剂”是指发现作为液体的物质的组合物，特征为在它们中组成分子的自由移动但在室温下并没有分离的倾向。液体制剂包括水性及非水性液体，以水性制剂为优选的。水性制剂是其中的溶剂或主要溶剂为水、优选为用于注射的水(water for injection，WFI)的制剂。中和GM-CSF的化合物在制剂中的溶解可为匀相或非匀相，以如上述的匀相为优选的。
可使用任何合适的非水性液体，条件是其提供本发明制剂的稳定性。优选地，非水性液体是亲水的液体。合适的非水性液体的示例性实例包括：甘油；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)；聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PMS)；乙二醇类，诸如乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇(“PEG”)200、PEG 300和PEG 400；及丙二醇类，诸如二丙二醇、三丙二醇、聚丙二醇(“PPG”，polypropylene glycol)425和PPG 725。
本文所用的“混合的水性/非水性液体制剂”是指包含水(优选WFI)和另外的液体组合物的混合物的液体制剂。
当使用于本文时，“制剂”或“组合物”是中和GM-CSF的化合物(即活性药物/物质)和另外的化学物质和/或药用产品中所需的添加剂的混合物，其优选为液体状态。本发明的制剂包括医药制剂。
制剂的制备包括这样的过程：在过程中，组合不同化学物质(包括活性药物)以生产最终药物产品，诸如药物组合物。本发明制剂的活性药物是中和GM-CSF的化合物。
在某些实施方案中，要配制的中和GM-CSF的化合物实质上为纯的和/或实质上匀相的(即基本上不含污染性物质，例如蛋白质等，其可为产品相关和/或过程相关的杂质)。术语“基本上纯的”意为包括至少约80％、优选化合物重量的约90％、优选化合物重量的至少约95％、更优选化合物重量的至少约97％或最优选化合物重量的至少约98％(化合物优选为单体状态)的组合物。术语“实质上匀相的”意为包括化合物重量的至少约99％、化合物优选为单体状态的组合物，排除溶液中多种稳定剂与水的质量。
当在本文中使用时，术语“约”理解为意为于个别值或范围中(诸如pH、浓度、百分比、摩尔浓度、氨基酸数目、时间等)可具有变动，其可为高至给定值的5％、高至给定值的10％、高至给定值的15％或高至和包括给定值的20％。例如，如果制剂包括约5mg/ml的化合物，此可理解为意为制剂可具有4至6mg/ml、优选4.25至5.75mg/ml、更优选4.5至5.5mg/ml、甚至更优选4.75至5.25mg/ml、最优选5mg/ml。如本文中所使用，定义为“(从)X至Y”的间隔等同于定义为“X和Y之间”的间隔。两种间隔特定而言包括上限和下限。此意为例如“5mg/ml至10mg/ml”或“5mg/ml和10mg/ml之间”的间隔包括5、6、7、8、9和10mg/ml以及任何给定的中间值的浓度。
“稳定的”制剂是在制剂中中和GM-CSF的化合物实质上在储存后维持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性和/或与对照样品相比未显示聚集、沉淀、裂解、降解和/或变性的实质迹象的制剂，优选是在视觉检查颜色和/或澄清度后，或如通过UV光散射或通过尺寸排阻层析法测量。多种另外用于测量蛋白质稳定性的分析技术在本领域中可用且例如在下列中回顾：Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)和Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)。
本文所使用的“在储存期间”意为一旦制剂制备后并未立即使用；或者，在其制备后，将其包装用于储存，是为液体形式、冷冻状态或以后续重构为液体形式或其他形式的干燥形式。
设想所述中和GM-CSF的化合物优选为到以下的程度为稳定的：在储存期间和/或在冷冻/融化期间或之后和/或在剪切(例如摇晃)应力期间或之后，其未实质上形成聚集体或片段/降解产物(例如因为一个或多个前述原因)。因此优选设想，相对于在开始储存时或在进行一或多个冷冻/融化循环之前或在进行摇晃研究之前中和GM-CSF的化合物的量，不超过10％、更优选不超过8％、甚至更优选不超过5％、特别优选不超过2％的中和GM-CSF的化合物形成聚集体和/或片段。此稳定性优选应用于至少1个月、至少2个月或至少3个月；优选至少4个月、至少5个月或至少6个月；更优选至少9个月或至少12个月；甚至更优选至少18个月或至少24个月；和最优选至少30个月或至少36个月或至少48个月或至少54个月或至少60个月的时间范围。优选的储存温度条件是高至室温(约20℃至约25℃)、更优选约2-8℃、最优选时间范围是至少3年或甚至至少4年。化合物根据上述参数为优选稳定的期间冷冻/融化循环的次数是至少一个循环、优选至少2、3、或4个循环、更优选至少5、6或7个循环、最优选至少8、9或10个循环。化合物根据上述参数为优选稳定的期间摇晃的天数(例如在+5℃±3℃的温度下，还参见实施例12d)是至少1天、优选至少2、3、或4天、更优选至少5、6或7天、甚至更优选至少8、9、10或11天、最优选至少12、13或14天。
在替代情况中，设想中和GM-CSF的化合物优选为到其未形成二聚体、寡聚体或片段的程度则为稳定的。换言之，中和GM-CSF的化合物的稳定性可根据溶液中单体蛋白质的百分比而测定，其中降解的(例如裂解的)和/或聚集的蛋白质的百分比低。例如，包括GM-CSF中和化合物(诸如抗体)的本发明制剂可包括至少90％、更优选至少92％、甚至更优选至少95％、特别优选至少98％、最优选至少99％的中和GM-CSF的化合物的单体。
“聚集体”意为在蛋白质分子之间的物理相互作用，其导致形成共价的或非共价的二聚体或寡聚体(即高分子量实体)的形成，其可维持可溶的或形成从溶液中沉淀出来的不可溶的聚集体。“聚集体”还包括降解的和/或裂解的蛋白质。
如本文以上所提及，多种不同分析方法可用于检测包括中和GM-CSF的化合物的制剂中聚集体的存在和水平。这些包括但不限于例如天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)、十二磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)、毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis，CGE)、尺寸排阻层析法(size exclusion chromatography，SEC)、分析级超离心(analytical ultracentrifugation，AUC)、场流分离(field flow fractionation，FFF)、光散射检测、沉降速度、UV光谱、差分扫描热量法(differential scanning calorimietry)、浊度测定法(turbidimetry)、比浊测定法(nephelometry)、显微术、尺寸排阻-高性能液相层析法(size exclusion-high performance liquid chromatography，SE-HPLC)、逆相-高性能液相层析法(reverse phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC)、电喷雾离子化串联质谱法(electrospray ionization tandem mass spectroscopy，ESI-MS)和串联RP-HPLC/ESI-MS、场流分离技术和静态和/或动态光散射。这些方法可单独或结合使用。优选地，用于检测包括中和GM-CSF的化合物的制剂中聚集体和/或片段的存在和水平的分析方法为尺寸排阻层析法诸如SE-HPLC、分析级超离心和非对称场流分离。测定中和GM-CSF的化合物生物学活性的方法例如测量其结合至(固定的，immobilized)GM-CSF(或GM-CSF受体)的程度，是所谓的表面等离子体共振(surface plasmon resonance，SPR)。
包括蛋白质的制剂的常见挑战为随时间、热或剪切应力的不可逆的聚集体累积。典型地，当聚集体沉淀时，它们形成易于检测的大粒子。然而较小的、非共价的可溶性聚集体(其通常为沉淀为大粒子的前体)较难检测和定量。因此，检测和定量蛋白质制剂中的蛋白质聚集的方法需要基于评估的聚集体种类。
在以上方法中，用于测定蛋白质制剂中可溶的、共价聚集体的存在和/或量的建议方法为：SEC/光散射、SDS-PAGE、CGE、RP-HPLC/ESI-MS、FFF和AUC。用于测定蛋白质制剂中可溶的、非共价聚集体的存在和/或量的建议方法为：SEC、PAGE、SDS-PAGE、CGE、FFF、AUC和动态光散射。用于测定蛋白质制剂中不可溶的、非共价聚集体的存在和/或量的建议方法为：UV光谱法、浊度测定法、比浊测定法、显微术、AUC、非对称场流分离和动态光散射。
此外，本发明的制剂优选提供改善的长期储存，使得液体或冷冻的、优选为液体的中和GM-CSF的化合物在储存期间为稳定的。如本文中所使用，词组“储存”理解为意为制剂可储存至少一个月、两或三个月或更多、六个月或更多、优选一年和更长或甚至2年、3年或4年或5年和更长。长期储存也理解为意为药物组合物储存于2-8℃下或在室温下、优选在2-8℃下，由此所述制剂优选不会失去其生物学活性至如本文描述的程度和/或不会形成聚集体至如本文描述的程度和/或包括单体至如本文描述的程度。对这些性质的测试在本文他处描述。
在本发明的一方面中，制剂中的中和GM-CSF的化合物为液体形式在以下时间内为稳定的：至少1个月、2个月、3个月；至少4个月、至少5个月；至少6个月；至少12个月；至少24个月；至少36个月；至少48个月、至少60个月。上述时间段中间的范围也预期是本发明的部份。例如9个月等等。此外，预期包括使用上述值作为上限和/或下限的组合的范围。优选地，所述制剂在室温下(约20℃至25℃)在至少1个月为稳定的和/或在约2-8℃下在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月为稳定的，或更优选在约2-8℃下在至少2年、至少3年、至少4年或甚至至少5年为稳定的。
稳定性的另一重要方面为在根据本发明组合物内的中和GM-CSF的化合物在储存期间和在储存条件内，尤其是温度和可能温度变化下维持其生物学活性或潜能(potency)。活性或潜能例如由化合物的中和能力本身(其可在基于细胞的测定法中测量，如本文以上所描述)或由GM-CSF中和化合物对结合至GM-CSF或GM-CSF受体的能力所反映。结合亲和力可由SPR或其他本领域熟知方法所评估，例如流动式生物感测系统(Biacore)或斯卡查德(Scatchard)测定法。
本发明的制剂通过在例如水溶液中加入如本文所描述的中和GM-CSF的化合物、缓冲剂和张力调节剂所制备。本领域普通技术人员将理解包括于制剂中多种组份的组合可以任何适当次序完成。例如，可首先、中间或最后添加缓冲剂，且还可首先、中间或最后添加张力调节剂。本领域普通技术人员也可理解，某些这些化学物在某些组合中不兼容，并因此容易地以具有相似性质但在相关混合物中兼容的不同化学物取代。
在本发明的一个优选方面中所述制剂包括缓冲剂。本文所使用的术语“缓冲剂(buffer)”或“缓冲试剂(buffering agent)”包括将pH维持在所期望范围中的那些试剂。缓冲剂为由弱酸及其共轭碱或弱碱及其共轭酸的混合物组成的水性溶液。其具有当少量的强酸或碱加入时，溶液pH变化非常小的性质。缓冲溶液在广泛种类的化学应用中作为将pH维持在近乎恒定值的方式使用。一般而言，当施用于本发明制剂中缓冲剂优选稳定化中和GM-CSF的化合物。
当在本文中使用时，“氨基酸缓冲剂”包括例如氨基酸碱、例如组氨酸及其共轭盐。氨基酸缓冲剂的实例为组氨酸/组氨酸氯化物。此实例优选应用于本发明中。
如本文描述的制剂的优选pH可选自以下范围：从约4至约10、优选从约4至约6或从约5至约7、更优选从约5.5至约6.5。pH最优选为约或正好5.8。因此，优选使用可将溶液维持于pH 5至7的缓冲剂。当在上下文的pH值/范围中使用时，术语“约”优选意为具有围绕所述值+/-20％的范围的数值。当药物组合物的pH设定于或接近生理水平时，施用后患者的舒适度达到最大化。要理解可如使特定制剂中中和GM-CSF的化合物溶解度和稳定性最大化所需而调整pH，且如此生理范围以外、又优选患者可容忍的pH落于本发明的范围内。
可用于本文描述制剂中的缓冲剂的非限制性实例包括组氨酸、琥珀酸盐、葡萄糖酸盐、柠檬酸盐、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、tris(trometamol)、Bis-Tris、MOPS、ACES、TES、HEPES、EPPS、乙二胺、磷酸、马来酸/磷酸盐、2-吗啉代乙烷磺酸(2-morpholinoethanesulfonic acid，MES)、磷酸盐、乙酸盐和二乙醇胺。
优选的缓冲剂为组氨酸、乙酸盐和柠檬酸盐缓冲剂。更优选为在本发明的制剂中施用组氨酸缓冲剂，优选为pH 5至7、更优选pH 5.5至6.5、甚至更优选pH 5.8。施用于本发明的缓冲剂是本领域中熟知，且通过已知方法制造和可自商业供应者获得。
在一些实施方案中，所述制剂进一步包括氢氧化钠(NaOH)。在特定实施方案中，所述制剂包括1-200mM、或低于50mM、低于40mM、低于35mM、低于30mM、低于25mM、低于20mM、或低于15mM、例如10mM NaOH或更低，诸如5mM或1mM氢氧化钠。
除了中和GM-CSF的化合物和缓冲剂以外，根据本发明的制剂还可包含其他物质，其包括但不限于稳定试剂(stabilizing agent)(稳定剂(stabilizer))。
因此，在一个优选方面，实施制剂包括也可用作张力调节剂的稳定剂。术语“稳定试剂”是指改善或增强制剂、特别是中和GM-CSF的化合物的稳定性的试剂。为张力调节剂的稳定试剂可为非还原糖、糖醇或其组合。本发明液体组合物中的张力调节剂确保，溶液的张力(即渗透压度(osmolarity))实质上与正常生理流体相同并因此避免施用后肿胀或因组合物和生理流体之间的不同离子浓度而造成的组合物快速吸收。通常，如描述于本文的制剂的性质使得所述制剂的渗透压度为约240至约470mOsmol/kg、更优选约300和约400mOsmol/kg、最优选约350mOsmol/kg。
优选地，稳定试剂/张力调节剂可为一种或多种非还原糖、诸如蔗糖或海藻糖，或一种或多种糖醇、诸如甘露醇或山梨醇，还优选非还原糖和糖醇的组合。在某些实施方案中，所述组合物中稳定试剂/张力调节剂的浓度选自以下范围：从1至15％(w/v)、从2至10％(w/v)、从3至8％(w/v)、从4至6.5％(w/w)、从4.5至6％(w/v)。在特定实施方案中，浓度为约5至6％(w/v)。施用于本发明制剂中的优选地稳定剂/张力调节剂为山梨醇、优选5％(w/v)。
在一个优选实施方案中，本文描述的制剂并不包括另外的赋形剂，如氨基酸(除了当缓冲剂选自氨基酸缓冲剂时诸如组氨酸缓冲剂时)或表面活性剂。
在较不优选的实施方案中，本文描述的制剂包括另外的赋形剂。优选地，赋形剂优选自氨基酸、低温保护剂、冷冻防护剂(lyoprotectant)、表面活性剂、增量剂、抗氧化剂及其组合。
赋形剂，也指作为当在溶液中(也为干燥或冷冻形式)时优选稳定中和GM-CSF的化合物的化学添加剂、共溶质或共溶剂，可添加到本发明的制剂中。优选地，赋形剂对中和GM-CSF的化合物的稳定性具有贡献，但还理解赋形剂或可对制剂的物理、化学和生物学性质具有贡献。赋形剂为本领域中熟知的，且通过已知方法制造和可自商业供应者获得。
赋形剂的实例包括但不限于糖/多元醇诸如：蔗糖、乳糖、甘油、木糖醇、山梨醇、甘露醇、麦芽糖、肌醇、海藻糖、葡萄糖；聚合物诸如：血清白蛋白(牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、人类SA或重组HA)、聚葡萄糖、PVA、羟基丙基甲基纤维素(hydroxypropyl methylcellulose，HPMC)、聚乙二亚胺、明胶、聚乙烯基吡咯啶酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)、羟基乙基纤维素(hydroxyethylcellulose，HEC)、羟基乙基淀粉(hydroxyethylstarch，HES)；非水性溶剂诸如：多元醇(例如PEG、乙二醇和甘油)、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)和二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)；氨基酸诸如：苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、色氨酸和酪氨酸；表面活性剂类诸如：Tween-80、Tween-20、SDS、聚山梨醇酯、聚氧乙烯共聚物；和各种赋形剂诸如：磷酸钾、醋酸钠、硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、三甲胺N-氧化物、甜菜碱、金属离子(例如锌、铜、钙、锰和镁)、CHAPS、单月桂酸盐、2-O-β-甘油酸甘露糖酯(2-O-beta-mannoglycerate)或以上的任意组合。
“低温保护剂”包括在制造、冷冻、储存、搬运、分配、重构或使用期间提供给冷冻蛋白质稳定性的物质。在特定方面，“低温保护剂”包括保护蛋白质受冷冻过程导致的应力影响的物质。低温保护剂可具有冷冻防护剂作用。低温保护剂的非限制性实例包括糖，诸如蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、甘露糖和乳糖；聚合物，诸如聚葡萄糖、羟基乙基淀粉、聚乙烯基吡咯啶酮(PVP)和聚乙二醇；表面活性剂，诸如聚山梨醇酯(例如PS-20或PS-80)；和氨基酸，诸如甘氨酸、精氨酸、亮氨酸和丝氨酸。通常使用在生物体系中表现低毒性的低温保护剂。
如本文描述的二糖可用作冷冻防护剂或低温保护剂。“冷冻防护剂”包括避免或减少冷冻干燥和后续储存后蛋白质的化学或物理不稳定性的物质。在一方面，冷冻防护剂在干燥过程期间当水从组合物移除时，避免或减少蛋白质中化学或物理不稳定性。在另一方面，冷冻防护剂通过氢键合帮助维持蛋白质的适当构型而稳定蛋白质。
因此，在一方面，如本文描述的二糖在冷冻期间可用于稳定中和GM-CSF的化合物。因为在冷冻期间的保护可取决于二糖的绝对浓度(Carpenter等人.,Pharm.Res.(1997),14:969-975，高于5％的浓度对最大化稳定性可为必要的。
在一个实施方案中，冷冻防护剂添加到本文描述的制剂中。如本文所使用的术语“冷冻防护剂”包括这样的的试剂：所述试剂在冷冻-干燥或脱水过程(第一和第二冷冻-干燥循环)期间，通过提供非晶型玻璃状介质和通过氢键合而与蛋白质结合，从而取代在干燥过程期间被移除的水分子，给蛋白质提供稳定性。此帮助维持蛋白质构型，最小化在冷冻干燥循环期间的蛋白质降解和改善长期产品稳定性。冷冻防护剂以“冷冻防护量”添加到预冷冻干燥的制剂中，所述冷冻防护量意为在冷冻防护量的冷冻防护剂的存在下，中和GM-CSF的化合物冷冻干燥后，化合物在冷冻干燥和储存下实质上保留它们的物理和化学稳定性及完整性。
冷冻防护剂的非限制性实例包括糖，诸如蔗糖或海藻糖；氨基酸，诸如谷氨酸单钠、甘氨酸或组氨酸；甲基胺，诸如甜菜碱；溶致性盐，诸如硫酸镁；多元醇，诸如三元或更多元糖醇，例如阿拉伯醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇；聚乙二醇；pluronics；及其组合。优选地，冷冻防护剂如上所述用于稳定试剂。添加到制剂中的冷冻防护剂的量通常为当蛋白质制剂冷冻干燥时，不导致不可接受程度的蛋白质降解/聚集的量。
另一种赋形剂为表面活性剂。术语“表面活性剂”一般包括那些保护中和GM-CSF的化合物不受空气/溶液接口导致的应力和溶液/表面导致的应力影响的试剂。例如表面活性剂可防止蛋白质聚集。
表面活性剂的实例包括但不限于非离子性表面活性剂，诸如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20)；泊洛沙姆(poloxamer)(例如泊洛沙姆188)；三硝基甲苯(Triton)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)；月桂基硫酸钠；辛基醣苷钠；月桂基-磺酰基甜菜碱、肉豆蔻基-磺酰基甜菜碱、亚麻基-磺酰基甜菜碱、硬脂基-磺酰基甜菜碱、月桂基-肌氨酸、肉豆蔻基-肌氨酸、亚麻基-肌氨酸、硬脂基-肌氨酸、亚麻基-甜菜碱、肉豆蔻基-甜菜碱、鲸蜡基-甜菜碱、月桂酰胺基丙基-甜菜碱、椰油酰胺基丙基-甜菜碱、亚麻油酰胺基丙基-甜菜碱、肉豆蔻酰胺基丙基-甜菜碱、棕榈酰胺基丙基-甜菜碱(palmidopropyl-betaine)、异硬脂酰胺基丙基-甜菜碱(例如月桂酰胺基丙基)、肉豆蔻酰胺基丙基-(myristarnidopropyl-)二甲基胺、棕榈酰胺基丙基-二甲基胺或异硬脂酰胺基丙基-二甲基胺；甲基椰油基-牛磺酸钠或甲基欧非基-牛磺酸二钠(disodium methyl ofeyl-taurate)；和Monaquat系列(Mona Industries,Inc.,Paterson,NJ.)、聚乙二醇、聚丙二醇以及乙二醇和丙二醇共聚物(例如pluronics,PF68)。添加的表面活性剂的量使得其维持蛋白质聚集在一各可接受的水平，如使用例如SEC-HPLC或光障测量以测定高分子量(high molecular weight，HMW)物质或低分子量(low molecular weight，LMW)物质百分比而测定，和最小化本文描述蛋白质制剂的微粒形成。
另一种优选的赋形剂可为增量剂。如本文所使用的术语“增积剂”包括提供冷冻-干燥产品的结构而不直接与医药产品相互作用的试剂。除了提供药学上精致的饼(pharmaceutically elegant cake)以外，增量剂也可对于修饰塌陷温度、提供冷冻-融化保护和增强长期储存下蛋白质稳定性给予有用的质量。增量剂的非限制性实例包括甘露醇、甘氨酸、乳糖和蔗糖。增量剂可为结晶的(诸如甘氨酸、甘露醇或氯化钠)或非晶型的(诸如聚葡萄糖、羟基乙基淀粉)且一般以0.5％至10％的量用于蛋白质制剂中。
优选地，应用于本发明制剂中的增量剂促进饼的形成，该饼为美学上可接受的、均匀的或机械上强的。增量剂优选还促进开孔结构的形成和重构的容易性与速度。增量剂优选还减少或避免饼塌陷、共熔融或残余水汽的滞留。在另一方面，增量剂优选帮助保护中和GM-CSF的化合物抵抗应力(例如物理和化学应力)并帮助维持蛋白质活性。
另一种优选的赋形剂可为抗氧化剂。如本文所使用，“抗氧化剂”是能够减缓或避免其他分子的氧化的分子。氧化是从一个物质转移电子到氧化试剂的化学反应。对于用于本发明的组合物，生理上可接受的抗氧化剂为感兴趣的。此类抗氧化剂包括但不限于还原试剂、抗坏血酸(维生素C)、类脂酸、褪黑激素、尿酸、胡萝卜素、视黄醇、生育酚和生育三烯酚(tocotrienols)例如α-生育酚(维生素E)、泛醌(辅酶Q)及类似者。
在一些实施方案中，制剂可可选地包含防腐剂。“防腐剂”是可添加到本文制剂中以减少细菌活性的化合物。防腐剂的添加可例如促进多用途(多种剂量)制剂的制造。潜在的防腐剂实例包括氯化十八基二甲基苄基铵、氯化六甲双三级铵(hexamethonium chloride)、氯化烷基二甲基苄基铵(氯化烷基苄基二甲基铵的混合物，其中烷基为长链化合物)及苄索氯铵(benzethonium chloride)。其他类型的防腐剂包括芳香族醇诸如酚、丁醇和苄醇、对羟苯甲酸烷基酯诸如对羟苯甲酸甲酯或丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇合间甲酚。本文中最优选的防腐剂为苄醇。
因此，在更优选实施方案中，本发明制剂为长期储存的液体、优选为水性制剂，其包括约100mg/ml至200mg/ml的中和GM-CSF的化合物和选自组氨酸、乙酸盐和柠檬酸盐的缓冲剂，pH为约5至约7，且制剂可另外包括一种或多种蔗糖、海藻糖、甘露醇和/或山梨醇作为稳定剂/张力调节剂。
在特别优选的实施方案中，本发明制剂为长期储存的液体、优选为水性制剂，其包括约100mg/ml至200mg/ml、更优选约150mg/ml的中和GM-CSF的化合物和浓度为约20mM至约40mM、更优选约30mM的组氨酸缓冲剂，pH为约5.5至约6.5、更优选5.8，且所述制剂可另外包括约4％至约6％、更优选约5％(w/v)山梨醇，以及可选的没有另外的赋形剂如表面活性剂、氨基酸和/或NaCl。
应理解所述组合物的某些组份可以用本领域中已知的替代物交换。然而，本领域中技术人员也将理解，包括某些组份为了包括但不限于化学兼容性、pH、张力和稳定性的原因而排除使用其他组份、浓度或制备所述制剂的方法。
对于本发明液体制剂有益的是具有低且可行的粘度，其适于皮下施用，诸如在即可用的装置中。根据本发明的制剂的粘度因此优选于约50至约1000[1/sec]的剪切速率下且在约20℃的温度下在20mPa*s以下。更优选地，所述粘度在以上条件下在15mPa*s以下。
如本文所提及，本申请一般涉及这样的发现：若干物质添加到包括中和GM-CSF的化合物的制剂中可减少制剂中这些化合物的聚集和/或降解/碎裂。无论是何种原因使制剂中的中和GM-CSF的化合物成为聚集体或被降解，如本文描述的物质的添加减少制剂中的中和GM-CSF的化合物的聚集/碎裂。在某些实施方案中，所描述物质的添加减少制剂中由例如储存、暴露至提升的温度、暴露至光、暴露至剪切应力、表面活性剂的存在、pH和离子条件及其任意组合所造成的聚集/降解。
本发明人所发现的手段可用于减少所配制的中和GM-CSF的化合物的聚集和/或降解/碎裂，特别是以液态和冷冻形式。减少的聚集/碎裂是因此优选在液体制剂中观察到。假设减少的聚集/降解还在以下情况时观察到：当直接为液体形式用于之后使用而储存时、储存于冷冻状态和使用前融化时、或以干燥形式制备时，诸如冷冻干燥的、空气-干燥或喷雾干燥形式，其用于之后在使用前重构为液体形式或其他形式。
因此，设想本文描述的制剂可以本领域技术人员已知的任何方法储存。非限制性实例包括冷却、冷冻、冷冻干燥和喷雾干燥所述制剂，其中通过冷却储存是优选的。
在一些情况下，蛋白质制剂冷冻用于储存。因此，希望所述制剂可在此类条件下为相对稳定的，包括在冻融循环下。确定制剂此合适性的一中方法为使制剂的样品经受至少一次、例如一次、三次、五次、七次及至多十次冷冻和融化的循环(例如通过在约-80℃±10℃下冷冻过夜且在室温下快速融化或于冰上缓慢融化例如6小时)，从而测定在冻融循环后累积的低分子量(LMW)物质和/或高分子量(HMW)物质的量并且将其与在冷冻-融化程序前样品中存在的LMW物质或HMW物质的量进行比较。LMW或HMW物质的增加指示作为制剂部份储存的蛋白质稳定性的减少。尺寸排阻高性能液相层析法(SE-HPLC)可用于测定LMW和HMW物质的存在。
优选地，蛋白质制剂可作为液体储存。因此，如本文描述的，希望液体制剂在此类条件下为稳定的，包括在各种温度下。例如，确定制剂合适性的一种方法是将样品制剂储存在若干温度(诸如2-8℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和50℃)下且监控随时间累积的HMW和/或LMW物质的量。随时间累积的HMW和/或LMW物质的量越小，用于制剂的储存条件越好。此外，蛋白质的电荷概况可通过阳离子交换-高性能液相层析法(cation exchange-high performance liquid chromatography，CEX-HPLC)监测。替代地，所述制剂可在冷冻干燥后储存。此外希望所述制剂在剪切应力的条件下为稳定的。确定制剂合适性的一种方法是轻摇振荡器、例如垂直振荡器上容器中的制剂，在所期望温度(诸如2-8℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和50℃，优选+5℃±3℃)下。容器(例如小瓶)可储存于振荡器上所期望的时间段，例如高至14天或更长，相对于储存于在相同温度下的非摇动的对照组。数据点收集可在例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、1214和14天后进行。可测定在摇动储存后累积的低分子量(LMW)物质和/或高分子量(HMW)物质的量且与非摇动样品中存在的LMW物质或HMW物质的量相比较。LMW或HMW物质的增加指示作为制剂部份储存的蛋白质稳定性的减少。可使用尺寸排阻高性能液相层析法(SE-HPLC)以测定LMW和HMW物质的存在。
在一些情况下，所述制剂被喷雾-干燥然后储存。针对喷雾-干燥，液体制剂在干气体流的存在下气溶胶化。将水从制剂液滴中移除到气体流中，从而产生药物制剂的干燥颗粒。制剂中可包括赋形剂以(i)在喷雾-干燥脱水期间保护蛋白质、(ii)在喷雾-干燥后储存期间保护蛋白质、和/或iii)给予适合气溶胶化的溶液性质。所述方法类似于以上对于冷冻的描述，除了所述样品制剂是喷雾干燥而非冷冻、在稀释剂中重构且测试重构的制剂中LMW物质和/或HMW物质的存在。在喷雾-干燥样品中的LMW或HMW物质相对于非冷冻干燥的对应样品制剂的增加指示喷雾-干燥样品中减少的稳定性。
术语“冷冻干燥的”或术语冷冻-干燥“”包括已经经受干燥程序(诸如冷冻干燥)的物质状态，其中至少90％、优选95％、最优选98％的水分已被移除。因此，如本文所使用的术语“冷冻干燥”术语是指通过其待干燥的材料首先冷冻、接着通过在真空环境中升华而移除冰或冷冻溶剂的过程。赋形剂(例如冷冻防护剂)可包括于待冷冻干燥的制剂中，使得增强冷冻干燥的产品在储存下的稳定性。如本文所使用术语“重构的制剂”是指已通过在稀释剂中溶解冷冻干燥的蛋白质制剂而使中和GM-CSF的化合物分散于所述稀释剂中而制备的制剂。
如本文所使用的术语“稀释剂”是药学上可接受的(对施用至人类为安全且非毒性的)并有用于制备液体制剂的物质，诸如冷冻干燥后重构的制剂。稀释剂的非限制性实例包括无菌水、用于注射的抑菌水(bacteriostatic water for injection，BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐-缓冲盐水)、无菌盐水溶液、Ringer氏溶液、右旋葡萄糖溶液或盐的水溶液和/或缓冲剂。
在本发明另一方面中，设想制剂为用于治疗中。因此，本发明设想包括本文描述的制剂的药物组合物(或药剂)。
在另一个实施方案中，本发明提供治疗受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本文描述的制剂，其中所述受试者具有可有利地用中和GM-CSF的化合物治疗的疾病或障碍。
优选地，本文描述的制剂应用于预防和/或治疗可用中和GM-CSF的化合物预防和/或治疗和/或改善的疾病。
术语“受试者”预期包括活的生物。受试者的实例包括哺乳动物，例如人类、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、鼠和转基因非人类动物。在本发明的优选实施方案中，受试者为人类。
术语“有效剂量(effective dose)”或“有效剂量(effective dosage)”是定义为足以达成或至少部份地达成所期望效果的量。术语“治疗上有效剂量”定义为足以治愈或至少部份地遏止已患有该疾病的患者的疾病及其并发症的量。对此用途有效的量将取决于医学情况的严重性和受试者本身免疫系统的一般状态。术语“患者”包括人类及其他哺乳动物受试者，其接受预防性或治疗性处理。
制剂的适合剂量或治疗上有效量将取决于待处理的病症、治疗前病症的严重性和患者的临床历史及对治疗试剂的反应。合适的剂量可根据参与医师的判断调整以使得其可一次或经过一系列施用而施用至患者。所述药物组合物可作为单一疗法或根据需要与另外的疗法的结合施用。
本发明的药物组合物特别可用于不经肠道的施用，即皮下地、肌内地、静脉内地、关节间和/或滑液囊内的，其中皮下施用为优选的。不经肠道的施用可通过推注或连续输注而进行。
用于注射的药物组合物可为单一剂量形式存在，例如在安瓿中或在多剂量容器中，其具有添加的防腐剂。此外，已开发多种近期药物递送方案，本发明的药物组合物适合于使用这些新方法的施用，例如Inject-ease、Genject、注射器笔诸如Genen和无针装置诸如MediJector与BioJector。本发明的药物组合物也可适用于尚未被发现的施用方法。还参见Langer,1990,Science,249:1527-1533。
冷冻干燥的药物组合物可优选存在于包含活性成份的小瓶中。在一个实施方案中，药物组合物另外包括用于重构的溶液。
所述药物组合物可进一步包括另外的药学上可接受的组份。其他药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，诸如描述于Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)的那些也可被包括于本文描述的蛋白质制剂中，条件是他们不会负面地影响制剂的所期望特征。如本文所使用，“药学上可接受的载体”意为任何和所有与医药施用兼容的溶剂、分散介质、涂布、抗菌和抗真菌试剂、等张的和延缓吸收的试剂。此类用于医药活性物质的介质和试剂的使用是本领域中熟知的。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在对受体非毒性的剂量和浓度下使用，并包括：张力调节剂；另外的缓冲试剂；防腐剂；共溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合试剂诸如EDTA；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；生物可降解聚合物，诸如聚酯；形成盐的抗离子，诸如钠、多元糖醇；氨基酸，诸如丙氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、2-苯基丙氨酸和苏氨酸；糖或糖醇，诸如乳糖醇、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌糖(myoinisitose)、肌醇(myoinisitol)、半乳糖、乳糖醇、甘油、环多元醇(例如，肌醇)、聚乙二醇；含硫还原试剂，诸如谷胱甘肽、硫辛酸、硫羟乙酸钠、硫化甘油、α-单硫甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白质诸如人类血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其他免疫球蛋白；和亲水的聚合物，诸如聚乙烯基吡咯啶酮。
本文描述的制剂可用于作为治疗和/或避免和/或改善由此需要的患者中的疾病或障碍的药物组合物。术语“治疗”是指治疗性处理和预防或预防性手段。治疗包括制剂的应用或施用至身体、来自患者的独立组织或细胞，所述患者具有疾病/障碍、疾病/障碍的症状或疾病/障碍的倾向，目的是治愈、恢复健康(heal)、缓和(alleviate)、减轻(relieve)、改变、治疗(remedy)、改善(ameliorate)、改善(improve)或影响疾病、疾病的症状或疾病的倾向的目的。
那些“有此需要”的包括那些已具有障碍的那些以及其中预防障碍的那些。术语“障碍”是将得利于用本文描述的蛋白质制剂治疗的任何情况。此包括慢性的和急性的障碍或疾病，包括使哺乳动物预先置于所讨论的障碍的那些病理情况。本文中待治疗的障碍的非限制性实例包括炎性和自体免疫性障碍、优选包括过敏和牛皮癣障碍以及关节炎及气喘障碍，例如关节炎、风湿性关节炎(RA)、自体免疫性脑炎、牛皮癣、多发性硬化症、肺部疾病诸如气喘、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)和急性呼吸窘迫综合征(Acute Respiratory Distress Syndrome，ARDS)；克罗恩疾病(Crohn’s Disease)、特发性肺纤维化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF)、炎性肠疾(Inflammatory Bowel Disease，IBD)、眼色素层炎、黄斑点退化、结肠炎、瓦勒氏变性(Wallerian Degeneration)、抗磷脂质综合征(antiphospholipid syndrome，APS)、急性冠状动脉综合征、血管再狭窄化(restinosis)、动脉粥样硬化、复发性多软骨炎(relapsing polychondritis，RP)、急性或慢性肝炎、失败的骨科植入(failed orthopedic implants)、肾丝球肾炎、狼疮、异位性皮肤炎(atopic dermatitis)和炎性、关节炎及骨关节炎疼痛。
过敏障碍是任何由过敏或过敏反应造成的障碍。过敏是免疫系统的过敏性障碍。其当人的免疫系统对通常无害的外来物质(过敏原)诸如食物、花粉、霉菌、屋尘、动物皮屑、尘螨反应或过度反应时发生。
牛皮癣是主要影响皮肤的自体免疫性疾病。皮肤细胞的生长循环由于免疫系统送出的错误信号而加速。牛皮癣有五种类型：斑状(plaque)、点滴状(guttate)、逆向状(inverse)、脓疱状(pustular)和红皮状(erythrodermic)。最常见形式的斑状牛皮癣常见于为红和白色调的鳞片状斑块，其出现于表皮(皮肤)第一层的上方。然而一些患者不具有皮肤学的迹象或症状。此障碍为慢性的复发情况，严重性从小的局部斑块变至全身覆盖。手指甲和脚趾甲是经常被影响(牛皮癣指甲营养不良)的，可视为独立的迹象。牛皮癣也可造成关节的炎性，称为牛皮癣关节炎。
关节炎为一种关节疾病的形式，其涉及一或多个关节的炎症。关节炎具有超过100种不同的形式。最常见的形式骨关节炎(退化性关节疾病)是对关节的创伤、关节的感染或年纪的结果。其他关节炎形式为风湿性关节炎、牛皮癣关节炎和其他与自体免疫性疾病相关的。脓毒性关节炎是由关节感染导致的。
气喘是常见的呼吸道慢性炎性障碍，呼吸道中许多细胞和细胞元件扮演重要角色。气喘与呼吸道过度敏感(hyperresponsiveness)相关，其导致喘鸣、咳嗽、胸紧缩和呼吸短缺的重复发作。这些发作通常与肺内广泛的、但可变化的气流阻碍相关，其时常为自发性或用治疗而可逆的。气喘可根据症状的频率、在一秒钟内强迫呼气的体积和峰值呼气流速进行分类。气喘也可分类为特应性的(外在的)或非特应性的(内在的)。
除了中和GM-CSF的化合物以外，本发明的药物组合物可包括另外的治疗性或生物上活性的试剂。例如，可存在可用于治疗特定适应症诸如骨关节炎(例如一或多种涉及关节软骨或滑液组份损坏的抑制剂选自但不限于抗金属蛋白酶(anti-metalloproteinase)、细胞周期蛋白(cycline)化合物、细胞因子拮抗剂、皮质类固醇、TNF抑制剂、IL-抑制剂、抗血管生成的物质、蛋白聚醣酶(aggrecanase)抑制剂、p38激酶抑制剂、细胞凋亡抑制剂、透明质酸酶抑制剂和蛋白解酶的抑制剂)的治疗性因子。控制炎症的因子，包括英夫利昔(infliximab)、恩博(etanercerpt)、复迈(adalimulab)、内雷利蒙迈(nerelimonmab)、来那西普(lenercerpt)及类似者或其组合，也可为组合物的部份。还设想药物组合物可包括细胞外介质组份诸如透明质酸或其衍生物，包括盐、酯、内酯和硫酸化衍生物，优选为透明质酸的偏酯。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种试剂盒(或制造的物品)或容器，其包括本发明的制剂。所述制剂优选可已为液体状态。然而可替换地，其可优选为冷冻干燥的状态。其还可为冷冻、冷冻干燥的、冷冻-干燥或喷雾-干燥状态。因此，如果所述制剂是为有别于液体的状态，其可通过从业者制备为(液体)水性药物组合物。例如，所述制剂可为冷冻干燥的然后将必须被重构。因此，试剂盒可进一步分别包括用于冷冻、冷冻干燥的、冷冻-干燥或喷雾-干燥制剂的重构的手段和/或用于稀释制剂的手段和/或用于施用制剂或药物组合物的手段，诸如注射器、泵、注入器、针或类似者。所述试剂盒可包括一或多个包含本发明制剂的小瓶。试剂盒还可伴随使用说明。
因此，提供一种制造的物品，其包括本文描述的制剂和优选地提供其使用说明。制造的物品包括适合用于包含所述制剂的容器。适合的容器包括但不限于瓶、小瓶(例如双腔小瓶)、注射器(例如单或双腔注射器)、试管、雾化器、吸入器(例如计量剂量吸入器或干粉吸入器)或储藏器。容器可自多种材料形成，诸如玻璃、金属或塑料(例如聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚烯烃)。所述容器容纳制剂，并且在容器上或与其相关的标签可指示用于重构和/或使用的说明。标签可进一步指示所述制剂是用于或预期用于皮下施用。容纳制剂的容器可为多用途小瓶，其允许制剂的重复施用(例如2-6次施用)。制造的物品可进一步包括包含适合稀释剂(例如WFI、0.9％NaCl、BWFI、磷酸盐缓冲水)的第二容器。当制造的物品包括中和GM-CSF的化合物制剂的冷冻干燥形式时，稀释剂与冷冻干燥的制剂的混合将提供在重构的制剂中所期望的最终蛋白质浓度。制造的物品可进一步包括其他从商业和使用者角度所期望的材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有使用指南的插页。
还包括于本发明中的为可用于递送本发明制剂的装置。此类装置的实例包括但不限于注射器、笔、植入物、无针注射装置、吸入装置和贴片。
本发明进一步通过图和实施例示例，它们仅是示例性的，不构成对本发明范围的限制。
附图说明
图1：储存时间、储存温度和蛋白质浓度对单体水平的抗-GM-CSF抗体的效应。
图2：以渗透压度[mOsmol/kg]作为变量的标准化效应的柏拉图(Pareto chart)。
具体实施方案
以下项目也表征本发明：
1.一种组合物，其包含浓度为至少约20mg/ml的中和GM-CSF的化合物、张力调节剂和缓冲剂，其中所述组合物为稳定的。
2.根据项目1的组合物，其中所述中和GM-CSF的化合物以至少约50mg/ml的浓度存在，所述张力调节剂以约1％至约15％(w/v)的浓度存在，所述缓冲剂以约10mM至约50mM的浓度存在。
3.根据项目1或2的组合物，其中所述张力调节剂选自甘露醇、山梨醇、蔗糖和/或海藻糖。
4.根据项目1至3中任一者的组合物，其中所述缓冲剂选自组氨酸、乙酸盐和/或柠檬酸盐缓冲剂。
5.根据项目1至4中任一者的组合物，其中所述中和GM-CSF的化合物以至少约100mg/ml且低于约200mg/ml的浓度存在，所述张力调节剂以约3％至约7％(w/v)的浓度存在，所述缓冲剂以约20mM至约40mM的浓度存在。
6.根据项目1至5中任一者的组合物，其中pH为约5至约7。
7.根据项目1至6中任一者的组合物，其中所述张力调节剂是山梨醇，所述缓冲剂是组氨酸缓冲剂。
8.根据项目1至6中任一者的组合物，其不含有表面活性剂或氨基酸。
9.根据项目4至7中任一者的组合物，其不含有表面活性剂或其他氨基酸。
10.根据项目1至9中任一者的组合物，其实质上不含有氯化钠。
11.根据项目1至10中任一者的组合物，其不含有任何其他赋形剂。
12.根据项目1至11中任一者的组合物，其中所述中和GM-CSF的化合物选自多肽、拟肽、核酸和小分子。
13.根据项目12的组合物，其中所述多肽为结合至GM-CSF或结合至GM-CSF受体的抗体或其功能片段。
14.根据项目13的组合物，其中所述抗体或其功能片段是人类单克隆抗体或其功能片段。
15.根据项目13或14的组合物，其中所述抗体为IgG、IgG1或IgG4抗体。
16.根据项目13至15中任一者的组合物，其中所述抗体或其功能片段结合至GM-CSF的表位，所述表位优选包括氨基酸23-27(RRLLN)和/或氨基酸65-77(GLR/QGSLTKLKGPL)。
17.根据项目16的组合物，其中所述表位进一步包括：
(i)氨基酸28-31(LSRD)；
(ii)氨基酸32-33(TA)和/或
(iii)氨基酸21-22(EA)。
18.根据项目16或17的组合物，其中所述表位为不连续表位。
19.根据项目13至18中任一者的组合物，其中所述抗体或其功能片段在其重链可变区中包括含选自在SEQ ID NOs:1-13和56的任一者中示出的氨基酸序列的CDR3。
20.根据项目19的组合物，其中所述重链可变区CDR3序列中的任一者在重链可变区中与含在SEQ ID NO:14中示出的氨基酸序列的重链可变区CDR1和含在SEQ ID NO:15中示出的氨基酸序列的重链可变区CDR2一起存在。
21.根据项目13至20中任一者的组合物，其中所述抗体或其功能片段在其轻链可变区中包括含在SEQ ID NO:16中示出的氨基酸序列的CDR1、含在SEQ ID NO:17中示出的氨基酸序列的CDR2和含在SEQ ID NO:18中示出的氨基酸序列的CDR3。
22.根据项目13至21中任一者的组合物，其中所述抗体或其功能片段在其轻链可变区中包括如在SEQ ID NOs.19、54和55的任一者中示出的氨基酸序列。
23.根据项目13至22中任一者的组合物，其中所述抗体或其功能片段在其重链可变区中包括如在SEQ ID NOs:20-33、52和53的任一者中示出的氨基酸序列。
24.根据项目13至23中任一者的组合物，其中所述抗体或其功能片段在其轻链可变区中包括含如在SEQ ID NO.16中示出的氨基酸序列的CDR1、含如在SEQ ID NO.17中示出的氨基酸序列的CDR2和含如在SEQ ID NO.18中示出的氨基酸序列的CDR3；且在其重链可变区中包括含如在SEQ ID NO.14中示出的氨基酸序列的CDR1、含如在SEQ ID NO.15中示出的氨基酸序列的CDR2和含如在SEQ ID NOs.1-13和56的任一者中示出的氨基酸序列的CDR3。
25.根据项目13至24中任一者的组合物，其中所述抗体或其功能片段在其轻链可变区中包括含如在SEQ ID NO.16中示出的氨基酸序列的CDR1、含如在SEQ ID NO.17中示出的氨基酸序列的CDR2和含如在SEQ ID NO.18中示出的氨基酸序列的CDR3；且在其重链可变区中包括含如在SEQ ID NO.14中示出的氨基酸序列的CDR1、含如在SEQ ID NO.15中示出的氨基酸序列的CDR2和含如在SEQ ID NO.2中示出的氨基酸序列的CDR3。
26.根据项目13至25中任一者的组合物，其中所述抗体或其功能片段包括如在SEQ ID NO:34中示出的轻链氨基酸序列和选自如在SEQ ID NOs:35-48的任一者中示出的那些的重链氨基酸序列。
27.根据项目13至26中任一者的组合物，其中所述抗体或其功能片段包括与以下相应氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列：如SEQ ID NOs:1-48和52-56的任一者中示出的相应氨基酸序列，优选如在SEQ ID NOs:1-18和56的任一者中示出的相应氨基酸序列和/或如在SEQ ID NOs:19-48和52-55的任一者中示出的氨基酸序列内的框架区的氨基酸序列。
28.根据前述项目中任一者的组合物，其包括
i)约100mg/ml至约180mg/ml的中和GM-CSF的化合物，
ii)约5％(w/v)山梨醇，
iii)约30mM的L-组氨酸，和
iv)具有约5.8的pH。
29.根据项目28的组合物，其包括约150mg/ml的中和GM-CSF的化合物。
30.根据前述项目中任一者的组合物，其为液体、优选为水性组合物。
31.根据前述项目中任一者的组合物，其在约2-8℃下至少24个月或在室温下至少28天为稳定的。
32.根据前述项目中任一者的组合物，其用于治疗。
33.根据前述项目中任一者的组合物，其用于静脉内和/或皮下施用。
34.根据前述项目中任一者的组合物，其用于炎性和自体免疫性疾病、优选包括过敏和牛皮癣障碍、以及关节炎和气喘障碍的治疗。
35.一种试剂盒，其包括前述项目中任一者的组合物。
应理解本文所公开的发明并未限制于特定方法学、方案或试剂，它们是可变化。本文提供的讨论和实例是为描述特定实施方案的目的而呈现的，不意欲于限制本发明的范围，所述本发明的范围仅由权利要求书所限定。以下实施例将示例本发明。
实施例1：材料
以下实施例以人类单克隆IgG1抗体(以下注记为“抗体”)进行，其结合至并以高亲和力且特异性中和人类GM-CSF，且其描述于WO 2006/111353。其产生描述于WO 2006/111353的实施例2。更具体地，所述抗体包括如描述于SEQ ID NOs:16、17、18、14、15和2中的轻链和重链CDR序列。这些CDR序列分别包括于重和轻链可变结构域中，分别显示于SEQ ID Nos:34和35。GM-CSF异常地过度生产于许多促-炎性和自体免疫性人类疾病中，且发现加入重组GM-CSF加重此类疾病。用GM-CSF-中和抗体治疗的可能疾病适应症包括风湿性关节炎(RA)、气喘和其他形式的肺炎、多发性硬化症(multiple sclerosis，MS)和牛皮癣。
所述抗体在使用无血清且无蛋白质的培养基的生物反应器中制造。从抗体制造克隆的单一小瓶制备用于制造发酵槽的接种体。完成发酵过程后，包含分泌的抗体的收获物通过过滤处理，以从上清液中分离细胞和碎屑。收获物的纯化基于一般层析方案以减少HCP、DNA和潜在病毒。整体病毒失活步骤是下游过程的另外的部份。对于所述制剂，进行浓度和缓冲剂交换步骤。
实施例2：测试方法
建立尺寸排阻高性能液相层析法(SE-HPLC)以测定抗体的聚集程度(HPLC：Agilent 1100Chemstation；柱子：Tosoh Biosep TSKgel G4000SWXL)。SE-HPLC方法通过进行九点范围测试而合格化，测定和测试其精确度(六次重复注射)和线性度(三重标准品曲线)。所有测定法使用100mM KH2PO4,200mM Na2SO4,pH 6.6作为移动缓冲剂(running buffer)而进行。
建立表面等离子体共振(surface plasmon resonance，SPR)方法以测定抗体结合活性对于固定化GM-CSF的程度(Biacore 3000/CM5传感器芯片/HBS-EP移动缓冲剂)。SPR方法通过进行九点范围测试而合格化，测定和测试其精确度(六次重复注射)和线性度(三重标准品曲线)。
进行还原和非还原SDS-PAGE以检测降解产物(片段)和所述抗体的聚集体。
实施例3：pH和温度应力的效应
进行研究以评估在低离子强度筛选缓冲剂(LISSB：2mM甘氨酸,2mM柠檬酸,2mM HEPES,2mM MES和2mM Tris)中在pH值范围为3至10下所述抗体的稳定性。抗体样品在55℃下储存于分别的溶液中达14天的时间段。在T0、T7及T14(天)时分析样品。SPR分析指出，所述抗体在pH 4-7下最稳定。当通过SE-HPLC分析时，发现抗体单体在pH 4-6下(T14)最稳定。T14样品的非还原和还原SDS-PAGE两者均显示在pH 4-6下仅最少的降解产物和聚集体形成。
实施例4：离子强度和温度应力的效应
进行研究以评估在低离子强度筛选缓冲剂(LISSB)中在0、10、100及500mM NaCl存在下所述抗体的稳定性。将抗体样品透析到具有另外的NaCl的LISSB的溶液(pH 4.5和pH 7.5)中，至大约1mg/ml的浓度并且在55℃下储存14天的时间段。在T0、T7和T14(天)时通过SE-HPLC和SPR分析样品。
HPLC和SPR研究指出，盐的添加恶化了所述抗体的稳定性并且在pH 4.5下比在pH 7.5下效应更为显著。此外，SE-HPLC数据显示在pH 4.5下用提高的盐浓度(≥100mM)的所述抗体的去稳定化主要造成所述抗体的聚集体累积。在pH 7.5下用提高的盐浓度(500mM)的所述抗体的去稳定化主要造成所述抗体的降解产物累积。在LISSB pH 4.5；500mM NaCl中，所述抗体的沉淀水平(T7和T14)非常高。
实施例5：缓冲剂的效应
进行研究以评估在各种pH 5-7缓冲剂中所述抗体的稳定性。将抗体样品透析到以下的溶液中：20mM柠檬酸盐缓冲剂pH 5、6和7；20mM磷酸盐缓冲剂pH 6和H 7；20mM琥珀酸盐缓冲剂pH 6和pH 7，20mM组氨酸缓冲剂pH 6和pH 7；和20mM乙酸盐缓冲剂pH 5和pH 6，至大约1mg/ml的浓度；并且在55℃下储存14天的时间段。在T0、T7和T14(天)时，通过SE-HPLC、SPR、和还原与非还原SDS-PAGE分析样品。
SPR研究、HPLC单体和聚集体数据以及还原和非还原SDS-PAGE指出，所述抗体在乙酸盐缓冲剂pH 5、组氨酸缓冲剂pH 6和柠檬酸盐缓冲剂pH 5、6和7(T14数据)中最稳定。
实施例6：氨基酸的效应
进行研究以评估在低离子强度筛选缓冲剂(LISSB)中在不同氨基酸添加情况下所述抗体的稳定性。抗体样品在55℃下在具有250mM的相应氨基酸的pH 6溶液中储存14天的时间段。在T0、T7和T14(天)时分析样品。SPR研究指出尤其是谷氨酸、苏氨酸、赖氨酸和缬氨酸(T14)的轻微稳定效果。HPLC数据指出，与未添加任何氨基酸的参照相比，谷氨酸、苏氨酸和丙氨酸稳定和显著的效应导致大约多了2-3％的完整单体和约分别少了30％、31％和20％的聚集体。
实施例7：糖和表面活性剂的效应
进行研究以评估在低离子强度筛选缓冲剂(LISSB)中在不同糖或表面活性剂添加情况下所述抗体的稳定性。将抗体样品透析到pH 6.0LISSB的溶液中，至大约1mg/ml的浓度，其中有另外的6％(w/v)糖(D-甘露醇、D-山梨醇、蔗糖、D-甘露糖、D-麦芽糖、D-海藻糖、D-葡萄糖)、0.05％(v/v)Tween 20或0.02％(v/v)Tween 80，并且在55℃下储存14天的时间段。在T0、T7及T14(天)时通过SE-HPLC、SPR和还原与非还原SDS-PAGE分析样品。
SPR和HPLC研究指出，D-山梨醇和D-甘露醇分别改善所述抗体稳定性约20％/3％(SPR/HPLC数据，T14)和14％/4％(SPR/HPLC数据，T14)。海藻糖和蔗糖两者已分别减少7％/0.7％(SPR/HPLC数据，T14)和6％/2％(SPR/HPLC数据，T14)的效应。此外，HPLC数据指出，D-山梨醇和D-甘露醇分别减少所述抗体聚集体的形成43％和50％，其也由通过SDS-PAGE所获得的数据支持。0.05％(v/v)Tween 20或0.02％(v/v)Tween 80似乎均无法显著地改善所述抗体的稳定性。
实施例8：缓冲剂、氨基酸和糖的组合的效应
基于先前的研究，进行研究以评估在缓冲剂、氨基酸和糖的组合中配制的1mg/ml所述抗体的稳定性。先前的研究指出下列的稳定效应：20mM乙酸盐pH 5；20mM组氨酸pH 6；250mM谷氨酸；250mM苏氨酸，6％(w/v)山梨醇和6％(w/v)甘露醇。所述抗体以浓度为5.4mg/ml配制到如表1中指出的20mM缓冲剂、250mM氨基酸和6％(v/v)糖的组合的溶液中，并且在55℃下储存14天的时间段。包括1xPBS中的抗体作为对照。在T0、T7和T14(天)时通过SE-HPLC和SPR分析样品。
此外，测试1xPBS中包含所述抗体(5.4mg/ml)的T0样品对冷冻和融化的易感受性。缓慢地在–20℃下在冷冻器中冷冻储存小瓶。在完成冷冻之后，在室温下融化所述样品。重复此过程直至已完成五次冷冻-融化循环。每一样品在两次和五次循环后检查SPR和SE-HPLC回收率。
表1：缓冲剂、糖和氨基酸的组合(Ac＝乙酸盐缓冲剂；His＝组氨酸缓冲剂；M＝甘露醇；S＝山梨醇)
SPR数据显示，在T14/55℃下在样品5-16中的结合活性相对于T0>93％。对于1xPBS中的所述抗体(样品17)和样品1-4(均不含甘露醇或山梨醇)，该数字分别为62％、19％、26％、91％和85％。SPR数据因此指出添加甘露醇或山梨醇改善了结合活性的稳定性。此外，样品1-4在T7和T14时显示发黄，从而指示了氧化现象。SE-HPLC数据显示在样品5-8、11-12和15-16(T14/55℃数据)中发现最低水平的聚集体(3.5％–5.6％)和降解产物(4.2％–5.4％)，从而支持甘露醇和山梨醇对所述抗体单体的稳定效应并且指示添加250mM苏氨酸的可能较小的效应。然而，苏氨酸的效应由样品5-8、11-12和15-16中发现的单体水平判断仅为至少最小的(分别为91.2％、89.8％、91.5％、90.8％、89.8％、89.0％、91.4％和90.9％)–针对样品17(PBS)该数字为80.3％(T14/55℃数据)。250mM谷氨酸连同山梨醇或甘露醇在所述抗体单体的稳定性上具有负面效果，尤其是在乙酸盐缓冲剂中。总之，所述抗体单体似乎在20mM乙酸盐缓冲剂pH 5或20mM组氨酸缓冲剂pH 6和6％(w/v)山梨醇或6％(w/v)甘露醇的组合中最稳定。
来自冷冻/融化实验的SE-HPLC数据指出相比于甘露糖稳定所述抗体单体，山梨醇的较小优越的效应。在样品6和8中，在5轮冷冻/融化之后单体含量分别为98.6％和98.4％，相比于在样品5和7中单体含量为96.9％和96.0％。
实施例9：组氨酸或乙酸盐缓冲剂、山梨醇或甘露醇、和Tween 20或Tween 80的组合的效应
基于来自先前研究的稳定性数据(显示特别在20mM乙酸盐pH 5、20mM组氨酸pH 6、6％(w/v)山梨醇和6％(w/v)甘露醇的稳定化效果)，进行新的研究以评估在组氨酸或乙酸盐缓冲剂、山梨醇或甘露醇、和Tween 20或Tween 80的组合中配制的10mg/ml所述抗体的稳定性。由于抗体在10mg/ml下的浓度，还测试添加0.02％(w/v)Tween 20和0.02％(w/v)Tween 80的对于聚集的效应。
所述抗体以10mg/ml浓度配制到20mM乙酸盐缓冲剂pH 5.0或20mM组氨酸缓冲剂pH 6.0的溶液中并具有如表2所指出的添加剂，并且在55℃下储存14天的时间段。在T0、T7和T14(天)时通过SE-HPLC和SPR分析样品。
此外，对抗体样品测试对冷冻和融化的易感受性。所述抗体以10mg/ml的浓度缓慢地在–20℃下在冷冻器中冷冻。在完成冷冻之后，在室温下融化所述样品。重复此过程直到已完成三和/或五次冷冻-融化循环。每一样品在三次和/或五次冷冻-融化循环后检查SPR和SE-HPLC回收率。
表2：缓冲剂、糖和去污剂的组合(Ac＝乙酸盐缓冲剂；His＝组氨酸缓冲剂；M＝甘露醇；S＝山梨醇；T20＝Tween 20；T80＝Tween 80)
HPLC数据清楚地显示0.02％(w/v)Tween 20和0.02％(w/v)Tween 80在所述抗体单体的稳定性上具有负面效果。在55℃下储存14天后，不含去污剂所配制的抗体约剩余89-90％单体，而添加去污剂所配制的抗体约剩余83-88％单体。抗体单体的损失主要当添加去污剂时造成更高水平的抗体聚集体(约7.6％–10.3％)。不含Tween 20和Tween 80时，所述抗体聚集体构成约5.2％–6.4％。虽然乙酸盐和组氨酸作为缓冲剂体系之间的差异是微小的，但是组氨酸似乎至少与乙酸盐一样好。
冷冻和融化实验指出在五轮冷冻和融化后，去污剂在抗体单体的水平上至少没有正面效应。然而，相比于添加6％(w/v)甘露醇，当添加6％(w/v)山梨醇到所述制剂时所述抗体单体更稳定。添加甘露醇时，在五轮冷冻和融化后所述抗体单体聚集为较高程度。来自冷冻和融化实验的HPLC数据显示使用乙酸盐和组氨酸之间没有差异。
总之，包含20mM组氨酸,pH 6.0和6％(w/v)山梨醇的预-制剂似乎对抗体单体的稳定性为最理想的。
实施例10：20mM组氨酸、6％(w/v)D-山梨醇预-制剂的短期稳定性评估
基于20mM组氨酸pH 6.0和6％(w/v)山梨醇作为最优选预-制剂的认定，进行短期稳定性测试以在所述抗体的更高浓度下评估此预-制剂。
将所述抗体以大约22、36、42、83和118mg/ml的浓度配制到上述溶液中。经配制的抗体在5℃和25℃下储存至多4周的时间段。在T0、T14和T28(天)时通过SE-HPLC分析样品。
SE-HPLC数据清楚地显示所述抗体在20mM组氨酸pH 6.0、6％(w/v)山梨醇中稳定。在5℃或25℃下储存28天后检测的抗体单体浓度永远在97％以上，除了在25℃下所测试的最高抗体浓度(118mg/ml)，其中所述抗体单体浓度为约96.5％。结果显示于图1中。
实施例11：最终赋形剂的微调
基于先前实验中产生的数据，山梨醇和组氨酸已被选为用于稳定所述抗体。在下一步骤中，使用“实验设计(Design of Experiment，DOE)”(包括3个中间点和产生30个个别运行)针对10至100mg/ml的抗体浓度微调赋形剂的量和pH值。以下列参数进行随机化的实验计划：
抗体：10–55–100mg/ml
pH：5–6–7
组氨酸：10–30–50mM
山梨醇：2–6–10％(w/v)
为允许短期评估，在50℃的加速条件下给样品施加应力14天。此外，进行三次冷冻融化循环(-20℃)以模拟所述抗体的储存。
结果：
测定渗透压度以确保用于制剂的生理条件。针对所述抗体的i.v.或s.c.应用，250至450mOsmol/kg的渗透压度为可接受的范围。如图2所示，渗透压度主要通过所述制剂中山梨醇的量控制。在低浓度(10-50mM)的组氨酸和所述抗体本身对渗透压度均仅具有最小的效应。
渗透压度对山梨醇和组氨酸浓度的依赖性可在示形线图(contour plot)中描绘。所述图显示为了维持在生理区间的渗透压度，浓度为3％至7％(w/v)的山梨醇为必要的。所产生的数据暗示最优选的山梨醇浓度为约6％，从而产生相当高的渗透压度值(>400mOsmol/kg)。因为山梨醇的某个减少并不影响所述抗体的稳定性，因此山梨醇浓度可被减少至5％，以便达到约350mOsmol/kg的渗透压度和因此增加患者的便利性。
基于所产生的数据，最优选的组氨酸浓度设定为30mM。在10mM至50mM的组氨酸浓度范围，如通过HP-SEC测量时，未检测到对聚集或破碎的影响。
所述抗体的聚集主要为浓度依赖的。增加的抗体浓度造成较高的聚集体水平以及在冷冻/融化期间和在加速的温度应力条件下的增加的澄清度值。此外，pH值影响所述抗体的单体含量。然而在pH<6下加速的应力导致所述抗体增加的碎裂，在冷冻/融化期间的稳定性未受影响，但观察到微微更好的稳定性。在pH>6的pH值下，对加速的温度和冷冻/融化治疗而言，使用HP-SEC和澄清度分析可测量到减少的单体含量。为了平衡相反效应，对所述抗体制剂而言5.8的pH似乎为最适合的。
这产生具有以下参数的制剂：
此组合物的情况或参数还可传至具有较高抗体浓度的组合物，如将由下列实施例所示。
实施例12：稳定性研究
a)长期研究
本研究设计用于高至60个月的测试期间。在此期间，抗体样品在+5℃±3℃下储存于DIN R2玻璃小瓶中。此外，在+25℃±2℃下的加速研究和在+40℃±2℃下的应力研究在DIN R2玻璃小瓶中分别进行至多12和6个月。使用所述抗体以106mg/ml和145mg/ml的浓度，在具有30mM组氨酸单氯化氢和5％(w/v)山梨醇、pH 5.8的制剂中进行测试。
测量下列参数：pH、渗透压度、浓度(OD280)、单体的百分比、通过SE-HPLC测得的聚集体和片段、电位(基于细胞的测定法)。结果显示于下表3-8中。
表3：在+5℃±3℃下的稳定性测试(106mg/ml抗体)
表4：在+5℃±3℃下的稳定性测试(145mg/ml抗体)
表5：在+25℃±2℃下的稳定性测试(106mg/ml抗体)
表6：在+25℃±2℃下的稳定性测试(145mg/ml抗体)
表7：在+40℃±2℃下的稳定性测试(106mg/ml抗体)
表8：在+40℃±2℃下的稳定性测试(145mg/ml抗体)
b)加速/应力研究
为了证明在规模化后药物物质的可比性，已在加速的(25℃)和施加应力的(40℃)条件下使用两批次的药物物质、以在30mM组氨酸、5％山梨醇、pH 5.8的溶液中配制的165mg/ml和171mg/ml的抗体浓度进行稳定性研究。
测量下列参数：pH、渗透压度、浓度(OD280)、单体的百分比、通过SE-HPLC测得的聚集体和片段、电位(基于细胞的测定法)。所述抗体浓度为171mg/ml的结果显示于下表9和10中。
表9：在+25℃±2℃下的稳定性测试(171mg/ml抗体)
表10：在+40℃±2℃下的稳定性测试(171mg/ml抗体)
c)冷冻/融化研究
针对在30mM组氨酸pH 5.8和5％山梨醇的溶液中配制的为106mg/ml和145mg/ml的抗体浓度测试冷冻/融化稳定性。所述抗体在-80℃±10℃下冷冻至少过夜。在室温下进行融化≥6h。进行0、1、3、5、7和10次冷冻/融化循环。
测量下列参数：pH、渗透压度、浓度(OD280)、单体的百分比、通过SE-HPLC测得的聚集体和片段、电位(基于细胞的测定法)。结果显示于下表11和12中。
表11：在-80℃±10℃下的冷冻/融化稳定性测试(106mg/ml抗体)
表12：在-80℃±10℃下的冷冻/融化稳定性测试(145mg/ml抗体)
d)摇晃稳定性
起始此研究以获得关于剪切应力对所示抗体在填充(例如填充、包装、运输)至患者的过程期间的影响的信息。因此所述抗体的浓度为106mg/ml和145mg/ml，并且配制于30mM组氨酸pH 5.8和5％山梨醇的溶液中，所述溶液在初级包装材料(DIN R2玻璃小瓶)中在垂直振荡器上轻摇。相对于对照(在+5℃±3℃下未摇晃储存)，小瓶在+5℃±3℃下在振荡器上储存高达14天。在0、1、2、3、7和14天后进行数据点收集。
测量下列参数：pH、渗透压度、浓度(OD280)、单体的百分比、通过SE-HPLC测得的聚集体和片段、电位(基于细胞的测定法)。结果显示于下表13-16中。
表13：在+5℃±3℃下「进行」摇晃的摇晃稳定性测试(106mg/ml抗体)
表14：在+5℃±3℃下「不进行」摇晃的摇晃稳定性测试(106mg/ml抗体)
表15：在+5℃±3℃下「进行」摇晃的摇晃稳定性测试(145mg/ml抗体)
表16：在+5℃±3℃下「不进行」摇晃的摇晃稳定性测试(145mg/ml抗体)
e)结果和结论
针对抗体浓度为约106mg/ml和约145mg/ml进行包括加速的和施加应力的条件的长期稳定性研究长达60个月。还针对抗体浓度高达约171mg/ml进行在加速的和施加应力的条件下另外的稳定性研究。
在60个月期间，在+5℃±3℃下以两种浓度储存的样品均显示低于2％聚集且具有与参考相比较的相同电位。
在加速的条件(+25℃±2℃)下储存12个月后，两种浓度(106mg/ml和145mg/ml)均显示低于2％聚集且具有与参考相比较的相同电位。在施加应力的情况下(+40℃±2℃)储存6个月后，两种浓度均显示低于5％聚集且具有与参考相比较的相同电位。
另外的加速/应力研究的数据分别显示在25℃和40℃下3个月和1个月的稳定性。此指示，可预期在2-8℃下的稳定性可相比于如上讨论的针对抗体浓度为106mg/ml和145mg/ml获得的稳定性。
此外，所述抗体在-80℃±10℃下在两种测试的抗体浓度为约106mg/ml和约145mg/ml时在至少10次冷冻/融化循环期间为稳定的。
最后，相对于未摇晃对照，设置在+5℃±3℃下在垂直振荡器上14天的时间段的摇晃稳定性研究。在此期间没有检测到对评估pH、渗透压度、降解、聚集、碎裂、浓度或电位的参数上的趋势。摇晃似乎对抗体稳定性没有影响。
基于以上数据，在+5℃±3℃下针对浓度高达约171mg/ml可设定至少60个月的保存期限。
实施例13：粘度评估
粘度以流变计测定。流变计用于那些无法通过单一粘度值所限定且因此需要设定和测量相比于粘度计的情况更多参数的流体。
对一些流体而言，粘度在广范围的剪切速率中为恒定的(牛顿流体)。不具有恒定粘度的流体(非-牛顿流体)无法通过单一数字描述。非-牛顿流体表现出在剪切应力和剪切速率之间多种不同关系。因此，对于非-牛顿流体而言粘度取决于温度以及剪切速率。粘度在给定的温度和给定的剪切速率γ[1/sec]下以毫巴*秒(mPas*s)指示。
在剪切速率为约50至约1000[1/sec]、在20℃的温度下，具有约150mg/ml抗体的制剂的粘度在12mPas*s以下。
在剪切速率为约50至约1000[1/sec]、在5℃的温度下，具有约150mg/ml抗体的制剂的粘度在20mPas*s以下。