抗cd24单克隆抗体、其可变区序列及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有中和人白细胞分化抗原CD24生物活性的单克隆抗体以及该单克隆抗体的可变区序列。本发明以抗原肽与血蓝蛋白偶联物CD24-KLH作为免疫原，免疫注射BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾脏细胞并将其与骨髓瘤细胞融合，获得了可表达抗CD24抗体的杂交瘤细胞株，此细胞株可用于制备抗CD24单克隆抗体。本发明同时克隆了抗CD24抗体可变区氨基酸序列。本发明的抗CD24抗体可与CD24特异性结合，因此可以用于治疗与CD24表达过量、异常、失控相关的疾病。
【专利说明】抗CD24单克隆抗体、其可变区序列及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种能特异性结合人白细胞分化抗原CD24的单克隆抗体、其可变区序列及其应用。
【背景技术】
[0002]人白细胞分化抗原⑶24(cluster of differentiation 24)是一种新近发现并重点研究的肿瘤标志物。
[0003]当前研究表明，⑶24分子是表观分子量介于30~70kDa之间的高度糖基化唾液酸糖蛋白。CD24包含33个氨基酸残基组成的核心蛋白骨架结构，具有16个潜在的O-或N-糖基化位点，与小鼠热稳定抗原高度同源；其成熟多肽能够通过羧基端的磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidy 1-1nositol, GPI)锚定在细胞膜的表面。
[0004]在生理情况下，⑶24分子仅在未成熟B细胞、成熟粒细胞以及少数上皮细胞和神经细胞上低水平表达；而当机体处于病理状态时，多数恶性肿瘤细胞的表面均能检测到显著高水平表达的CD24分子，其表达水平的高低与肿瘤的发生和发展密切相关。
[0005]P选择素表达于活化的血小板与内皮细胞表面，⑶24是其配体之一。⑶24分子高表达增强了肿瘤细胞对血小板及内皮细胞的粘附作用，促进了肿瘤的复发与转移。当然，作为细胞膜表面信号转导分子，CD24能够通过多种作用机制介导肿瘤细胞的的增殖、粘附、转移和侵袭。研究进一步发现，CD24表达与肝癌细胞的干性紧密相关，CD24可能成为一种新的肝癌干细胞表面标志物。
[0006]由此可见，⑶24有 望成为研究肿瘤发生机制及开发相关诊断试剂的新靶标。
【发明内容】
[0007]本发明目的一在于提供一种抗⑶24单克隆抗体制备方法。
[0008]本发明目的二在于提供了一种抗⑶24单克隆抗体。
[0009]本发明目的三在于提供抗⑶24单克隆抗体的可变区氨基酸序列。
[0010]本发明以⑶24核心区多肽与血蓝蛋白KLH偶联物(⑶24-KLH)作为免疫原，免疫注射BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾脏细胞并将其与骨髓瘤细胞融合，获得了可表达抗CD24抗体的杂交瘤细胞株，此细胞株可用于制备抗CD24单克隆抗体。
[0011]本发明克隆的抗体重链、轻链可变区氨基酸序列及其高变区如有SEQ ID N0.1~16所示。
[0012]本发明的单克隆抗体可与⑶24特异性结合。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为SDS-PAGE检测Protein G亲和层析柱纯化产物结果。泳道M为标准分子量蛋白；泳道I为腹水样品；泳道2为上样收集液；泳道3为20mM磷酸钠缓冲液洗柱收集液；泳道4~6为IOOmM甘氨酸缓冲液(ρΗ3.5)洗脱收集液(每分钟收集I ml，共收集3ml)，泳道7~10为IOOmM甘氨酸缓冲液(pH2.7)洗脱收集液(每分钟收集1ml，共收集4ml)。
[0014]图2为Western Blot鉴定纯化后抗体与⑶24之间相互作用。泳道M为标准分子量蛋白；泳道I市售⑶24-Fc (购自北京义翘神州)；泳道2为市售Fe (购自北京义翘神少H )。
[0015]图3为PCR扩增抗体重轻链可变区基因琼脂糖电泳结果。泳道M为标准分子量DNA ;泳道I为PCR扩增抗体重链可变区基因产物；泳道2为PCR扩增抗体轻链可变区基因产物。
[0016]图4为竞争性ELISA测定单克隆抗体G7、A7、E4、G5、B4亲和力。
【具体实施方式】
[0017]实施例1抗CD24单克隆抗体杂交瘤细胞的制备
[0018]1.免疫原
[0019]⑶24核心区由33个氨基酸残基组成，其分子量约为3.2kD，免疫原性较弱。本发明将抗原肽⑶24与血蓝蛋白KLH偶联，以偶联物⑶24-KLH作为免疫原，增强了⑶24核心区多肽的免疫原性。本发明所用⑶24-KLH由生工生物(上海)有限公司合成，纯度> 90%。
[0020]2.免疫动物
[0021]本发明所用免疫动物为BALB/c小鼠，为SPF级别，由扬州大学比较医学院提供。免疫佐剂为QuickAntibody,购自北京康碧泉公司。免疫流程参照QuickAntibody说明书进行，具体如表1所示。
[0022]表1.免疫途径与周期
【权利要求】
1.一种抗CD24单克隆抗体的可变区序列，其特征在于，所述可变区序列具有SEQ IDN0.1和5所示重链和轻链的氨基酸序列,其中重链、轻链可变区中分别包含SEQ ID N0.2~4和SEQ ID N0.6~8所示⑶Rl~3区氨基酸序列。
2.一种抗CD24的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的结构中包括具有SEQ IDN0.1和5所示重链和轻链的氨基酸序列。
3.—种抗CD24单克隆抗体的可变区序列，其特征在于，所述可变区序列具有SEQID N0.9和13所示重链和轻链的氨基酸序列，其中重链、轻链可变区中分别包含SEQ IDN0.10~12和SEQ ID N0.14~16所示CDRl~3区氨基酸序列。
4.一种抗CD24的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的结构中包括具有SEQ IDN0.9和13所示重链和轻链的氨基酸序列。
5.一种抗CD24单克隆抗体的可变区序列，其特征在于，所述可变区序列具有SEQID N0.17和21所示重链和轻链的氨基酸序列，其中重链、轻链可变区中分别包含SEQ IDN0.18~20和SEQ ID N0.22~24所示⑶Rl~3区氨基酸序列。
6.一种抗CD24的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的结构中包括具有SEQ IDN0.17和21所示重链和轻链的氨基酸序列。
7.—种抗CD24单克隆抗体的可变区序列，其特征在于，所述可变区序列具有SEQID N0.25和29所示重链和轻链的氨基酸序列，其中重链、轻链可变区中分别包含SEQ IDN0.26~28和SEQ ID N0.30~32所示CDRl~3区氨基酸序列。
8.一种抗CD24的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的结构中包括具有SEQ IDN0.25和29所示重链和轻链的氨基酸序列。
9.一种抗CD24单克隆抗体的可变区序列，其特征在于，所述可变区序列具有SEQID N0.33和37所示重链和轻链的氨基酸序列，其中重链、轻链可变区中分别包含SEQ IDN0.34~36和SEQ ID N0.38~40所示CDRl~3区氨基酸序列。
10.一种抗CD24的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的结构中包括具有SEQID N0.33和37所示重链和轻链的氨基酸序列。
11.一种基因工程抗体，其特征在于，它所含的重链和轻链可变区序列与权利要求书1、3、5、7和9所述的任一可变区序列是一致的；该基因工程抗体包括但不限于:人-鼠嵌合抗体(chimeric antibody);或者是人源化抗体(humanized antibody, HAb);或者是抗体的功能性片段 Fab (Fragment of antigen binding, Fab);或者是单链抗体(single-chainvariable fragment, scFv);或者是重链可变区和完整轻链融合的抗体功能性片段VH_L ;或者是重链和轻链的一个或多个CDR的排列、串联或组合而成的抗体功能性片段；或者是上述抗体和抗体功能片段和其他各种蛋白或多肽进行连接、拼接、融合而得到的类抗体的功能性的融合蛋白。
12.—种抗体偶联物，其特征在于，将权利要求1~11中所述任意一项单克隆抗体或者基因工程抗体作为靶向部分，与放射性核素或化学药物或毒素偶联。
13.权利要求1~11中所述任意一项单克隆抗体或者基因工程抗体，其特征在于，选择性地与⑶24结合或抑制⑶2 4与⑶24配体的结合或中和⑶24。
14.权利要求1~12中所述单克隆抗体或者基因工程抗体或者抗体偶联物，其特征在于，能够用于制备与⑶24表达异常或过量、失控相关疾病的药物。
15.一种抗CD24单克隆抗体制备方法，其特征在于，以CD24核心区多肽(氨基酸序列如SEQ ID N0.41所示)与血蓝·蛋白KLH偶联物作为抗原。
【文档编号】A61P35/00GK103819561SQ201410027795
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年1月22日 优先权日:2014年1月22日
【发明者】王旻, 涂孝洁, 何花, 张娟, 罗晨 申请人:中国药科大学