基因修饰的组织工程化骨及其制备方法和应用的制作方法

基因修饰的组织工程化骨及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了基因修饰的组织工程化骨及其制备方法和应用，其中，制备基因修饰的组织工程化骨的方法包括：(1)构建pLenti6.3-hOPG-IRES-EGFP重组慢病毒载体；(2)将步骤(1)得到的重组载体包装成重组慢病毒；(3)将步骤(2)得到的重组慢病毒感染牙周膜干细胞，获得转染重组慢病毒的牙周膜干细胞；(4)将步骤(3)获得的所述转染重组慢病毒的牙周膜干细胞同β-磷酸三钙支架材料体外复合，获得所述基因修饰的组织工程化骨。该组织工程化骨可用于治疗牙周骨缺损疾病。
【专利说明】基因修饰的组织工程化骨及其制备方法和应用

【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种基因修饰的组织工程化骨及其制备方法。更具体地，具体涉及一种人类骨保护素基因修饰的组织工程化骨及其制备方法，以及该组织工程化骨在制备治疗牙周骨缺损疾病材料中的用途。

【背景技术】
[0002]牙周病是发生在牙齿支持组织的炎症性、破坏性疾病，以牙槽骨的吸收破坏为主要特征。在临床治疗中通过牙周病的基础治疗、牙周手术(根面处理技术、引导性牙周组织再生术、骨移植)和药物治疗，对消除致病因素、促使炎症减轻有一定疗效，但难以恢复正常的牙槽嵴高度、形成新附着。
[0003]组织工程技术为牙周组织再生提供了新方法。生长因子是组织工程的重要因素，它们能调控包括牙周来源在内的多种细胞的增殖、迁移、分化和外基质的合成，在牙周组织再生的修复中发挥重要作用。但是传统的组织工程方法应用生长因子时，多将生长因子局部注射或复合细胞和支架材料后植入体内，由于生长因子多为蛋白质或多肽，在体内极易降解，生物半衰期短，容易被体液冲走或稀释，因此难以保持局部有效治疗浓度。
[0004]基因治疗为生长因子持续、稳定表达提供了新方法。借助基因治疗的手段(如转基因技术)，将生长因子的基因转移到牙周组织相关靶细胞内，当基因导入靶细胞后，这些细胞便可以充当微型“生物工厂”，持续释放细胞因子，促使靶细胞的表型向再生方向分化；并通过自分泌或旁分泌作用对细胞自身以及周围未转染的细胞产生作用，促使整个缺损区的所有细胞活化，从而提高牙周组织再生的成功率。
[0005]目前利用组织工程和基因治疗技术以及两者相结合促进牙周组织修复再生已成为牙周领域的研究热点。有部分学者利用该技术在牙周病治疗、促进牙槽骨新生方面进行了研究，通过牙周膜细胞(Per1dontal ligament cells,牙周膜细胞)体外培养,并将骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein, BMPs)或血小板生长因子(Platelet-derivedgrowth factor, PDGF)等促进骨形成基因转染至牙周膜细胞，回植到牙周组织缺损处,发现有促进牙槽骨形成的作用。然而，牙周组织是由牙骨质、牙周膜、牙槽骨与牙龈共同构成的三维结构，牙周病是细菌等各种病原因素对这四者的共同破坏，虽然通过牙周手术，包括使用牙周组织工程方法在提供修复用细胞、促进组织形成等方面有一定作用，但是，在病变牙周组织中主要是各种刺激因素导致的大量破骨细胞活化，抑制了牙周组织的成骨能力，使组织修复无法达到理想效果。因此，单一依靠促进骨形成来治疗牙周病效果未尽人意。
[0006]骨保护素(osteoprotegerin, 0PG)是近年来发现的一种能阻止破骨细胞分化、成熟，抑制骨吸收的关键因子。骨保护素是核因子K B受体活化因子配体(receptoractivator of nuclear factor κ B ligand, RANKL)的天然诱傅受体，能竞争性地与核因子κ B受体活化因子配体结合，阻断核因子κ B受体活化因子(Receptor activator ofnuclear factor-κ B, RANK)与核因子κ B受体活化因子配体间的相互作用，从而抑制破骨细胞的形成和活化，抑制骨吸收。研究发现，核因子κ B受体活化因子配体水平升高可以导致牙周组织的破坏；检测牙周病患者龈沟液显示，RANKL/OPG比率比健康人群明显升高；细菌产生的毒素或是组织表达的炎症介质也是通过影响RANKL/OPG比率而影响组织修复的。这些研究结果表明，OPG/RANKL/RANK系统在牙周骨代谢中是重要的分子调节机制之一。
[0007]牙周组织中最重要的一种细胞是牙周膜细胞，有学者研究发现牙周膜细胞可以表达骨保护素和核因子κ B受体活化因子配体，在没有受到外界刺激时骨保护素表达较核因子κ B受体活化因子配体强，不利于破骨生成，以维持牙周内环境的稳定。揭示了牙周膜细胞是通过0PG/RANKL系统来调节牙槽骨代谢的。由于牙周膜细胞位于牙槽骨和牙骨质之间，其分泌的骨保护素可能在抵御炎症组织中核因子κ B受体活化因子配体介导的骨吸收中发挥一定的防御功能。
[0008]近年来，国内外学者利用骨保护素防治因破骨细胞过度活化而引起的骨吸收疾病做了大量研究，发现骨保护素可有效抑制骨质疏松性骨吸收、恶性肿瘤骨转移破坏等骨质吸收疾病。但使用骨保护素治疗牙周骨缺损还未见报道。


【发明内容】

[0009]本发明是基于发明人的下列发现而完成的:
[0010]发明人将组织工程化骨植入兔牙周骨缺损处，以磷酸三钙作为生长空间，植入的牙周膜干细胞在局部分化成成骨细胞、成牙骨质细胞和成纤维细胞，直接参与牙周骨组织的再生；同时植入的牙周膜干细胞在体内存活、发生迁移、吞噬及分泌细胞外基质，并吸引体内细胞至缺损区域，从而促进了牙周骨组织再生；另外植入的牙周膜干细胞不断分泌骨保护素蛋白，通过抑制核因子κ B受体活化因子配体与破骨细胞表面的核因子κ B受体活化因子结合，抑制破骨细胞活化，抑制牙槽骨吸收，从而提高牙周骨愈合过程。
[0011]本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供了一种制备基因修饰的组织工程化骨的方法。
[0012]根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备基因修饰的组织工程化骨的方法。根据本发明实施例。所述复合材料由含有hOPG基因的慢病毒修饰的牙周膜干细胞和β-磷酸三钙制备而成。根据本发明具体示例，本发明的方法包括:
[0013](I)构建 pLenti6.3_h0PG-1RES_EGFP 重组慢病毒载体；
[0014](2)将步骤(I)得到的重组载体包装成重组慢病毒；
[0015](3)将步骤(2)得到的重组慢病毒感染牙周膜干细胞，获得转染重组慢病毒的牙周膜干细胞；
[0016](4)将步骤(3)获得的所述转染重组慢病毒的牙周膜干细胞同β -磷酸三钙支架材料体外复合，获得所述基因修饰的组织工程化骨。
[0017]发明人惊奇地发现，发明人惊奇地发现，利用本发明的重组载体能转染极难转染的牙周膜干细胞并且不影响转染后的牙周膜干细胞与支架材料的黏附及其正常的生长。利用该方法制备获得的基因修饰的组织工程化骨，能够促进牙周骨组织的再生。
[0018]根据本发明实施例，步骤(I)进一步包括:全基因合成人骨保护素(GenbankN0.ΝΜ_002546)的编码序列区域；hOPG基因的编码序列区域克隆连接到T载体上；使用合适的引物扩增含有两端酶切位点的hOPG基因编码序列片段；将基因片段连接到pIRES-EGFP载体上；转化大肠杆菌，测序鉴定筛选出连接到载体的克隆；使用合适的引物扩增出hOPG-1RES-EGFP序列，亚克隆到载体pcDNA6.2w上；经BP重组到入门载体上，再经LR重组到pLENT6.3/V5载体上。由此，利用该方法可以获得重组慢病毒载体，该慢病毒载体能够实现转染基因在体内持续、稳定的表达；并能用于极难转染的干细胞和原代细胞。
[0019]根据本发明实施例，本发明制备方法中选用的酶切位点是BglI和BamHI。
[0020]根据本发明实施例，扩增含有酶切位点的hOPG基因编码序列片段使用的第一引物序列为:SEQ NO 1(命名为SF-F1)、:SEQ NO 2 (命名为SF-R1)，第一引物的具体序列如下:
[0021]SF-Fl:5，-AAATAGATCTGCCACCATGAACAACTTGCT-3’ (SEQ NO I)；
[0022]SF-Rl:5’ -ATACGTCGACAGCTGGGTCTTATAAGCAGC-3’ (SEQ NO 2)；
[0023]由此，扩增的精确率好、效率高。
[0024]根据本发明实施例，扩增hOPG-1RES-EGFP序列使用的第二引物序列为::
[0025]SEQ NO 3 (命名为SF-F)、:SEQ NO 4 (命名为SF-R2)，，第二引物的具体序列如下:
[0026]SF-F:5’ -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCCGCCACCATGAACAACTTGCTGTGCTGCG-3’ (SEQ NO 3)；
[0027]SF-R2:5’ - GG GG A C C A C T T T G T A C A A G A A A G C T GG G T C T C A C T T G T A C AGCTCATCCATGCCG-3’ (SEQ NO 4)。
[0028]由此，扩增的特异性好、效率高。
[0029]根据本发明实施例，本发明前述的步骤(4)进一步包括:(I)磷酸三钙支架材料的制备；(2)将pLenti6.3-hOPG-1RES-EGFP转染后的牙周膜干细胞与磷酸三钙支架材料的体外复合。由此，该制备方法不影响转染后的牙周膜干细胞与支架材料的黏附及其正常的生长，转染后的牙周膜干细胞与支架材料的复合效果好。
[0030]根据本发明实施例，磷酸三钙支架材料的制备的具体操作如下:将颗粒型磷酸三钙支架材料无水乙醇浸泡24h后，用质量浓度75%酒精冲洗浸泡15min，用双蒸水漂洗3遍，经高温高压灭菌后置入24孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM培养液预湿备用。
[0031]根据本发明实施例，将pLenti6.3-h0PG_IRES_EGFP转染后的牙周膜干细胞与磷酸三钙支架材料的体外复合的具体操作如下:将pLenti6.3-hOPG-1RES-EGFP转染牙周膜干细胞，细胞消化后制备成5 X 106/ml的细胞悬液，分别滴加于24孔培养板中备用的β -磷酸三钙材料上，使细胞自然沉降在材料表面，2h后在培养皿中缓慢注入含10%胎牛血清的DMEM培养液2ml，充分浸没材料，再加入适量的培养基，在体积分数为5%的C02、37°C孵箱中培养。
[0032]根据本发明的另一方面，本发明提供了一种基因修饰的组织工程化骨。根据本发明实施例，该产品是利用本发明前述的实施例的方法制备而成的。
[0033]发明人惊奇地发现，该产品利用组织工程联合基因治疗技术治疗牙周骨缺损，能够显著促进牙周骨组织再生。
[0034]根据本发明再一方面，本发明还提供了上述组织工程化骨在制备治疗牙周骨缺损疾病的材料中的用途。
[0035]发明人惊奇地发现，将基因修饰的组织工程化骨做为牙周骨缺损材料，利用组织工程联合基因治疗技术治疗牙周骨缺损，能显著促进牙周骨组织再生。
[0036]本发明所述的Gateway技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。Gateway技术是基于已研究的非常清楚的λ噬菌体位点特异重组系统(attB XattP — attLXattR)。BP和LR两个反应就构成了 Gateway技术。BP重组反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆，产物是attLl-基因_attL2。LR重组反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应，产物是attBl-基因_attB2。LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。
[0037]本发明的优点和有益效果:利用pLenti6.3-h0PG_IRES_EGFP转染牙周膜干细胞/β -磷酸三钙修复牙周骨缺损，本发明的重组慢病毒载体能够实现转染基因在体内持续、稳定的表达；能够用于极难转染的干细胞和原代细胞；以慢病毒为载体的基因转染不影响种子细胞与支架材料的黏附及其正常的生长，pLenti6.3-hOPG-1RES-EGFP转染牙周膜干细胞/ β -磷酸三钙能显著促进牙周骨组织再生，为组织工程联合基因治疗技术治疗牙周骨缺损提供可能性。

【专利附图】

【附图说明】
[0038]图1显示了经过有限稀释法克隆化培养的牙周膜干细胞的细胞形态显微图片，，其中
[0039]A显示了未染色细胞的形态的显微图片，
[0040]B显示了 HE染色的细胞的形态的显微图片；
[0041]图2显示了 MTT法检测纯化的牙周膜干细胞与未纯化的牙周膜细胞的生长曲线示意图；
[0042]图3显示了牙周膜干细胞来源及表面标志鉴定的显微图片，其中
[0043]A显示了波形丝蛋白的显微图片，
[0044]B显示了角蛋白的显微图片，
[0045]C显示了 STR0-1的显微图片；
[0046]图4显示了牙周膜干细胞成骨诱导后ALP活性测定结果示意图；
[0047]图5显示了牙周膜干细胞成骨诱导后各分子指标的检测结果的显微图片，其中
[0048]A显示了碱性磷酸酶的显微图片，
[0049]B显示了矿化结节的显微图片，
[0050]C显示了骨钙素的显微图片，
[0051]D显示了 I型胶原的显微图片；
[0052]图6显示成脂诱导后的牙周膜干细胞，其中
[0053]A显示了脂滴的形成的显微图片，
[0054]B显示了油性O染色阳性的显微图片；
[0055]图7显示了慢病毒重组质粒的图谱示意图；
[0056]图8显示了 pLenti6.3-h0PG_IRES_EGFP转染牙周膜干细胞后的细胞形态的显微图片，其中
[0057]A显示了光镜下图像的图片，
[0058]B显示了荧光显微镜下的图像的图片；
[0059]图9显示了 QPCR检测hOPG基因的表达结果的示意图，其中
[0060]A显示了内参基因的扩增曲线和熔解曲线的示意图，
[0061]B显示了 hOPG基因的扩增曲线和熔解曲线的示意图；
[0062]图10显示了利用Western Blot检测hOPG蛋白表达结果的图片；
[0063]图11显示了细胞与材料复合扫描电镜图像的图片；
[0064]图12显示术后12周组织学观察图像的图片；
[0065]图13显示了新生牙槽骨的激光共聚焦显微图像的图片；
[0066]图14显示了新生牙槽骨面积百分比示意图。

【具体实施方式】
[0067]慢病毒载体是近年来基因治疗载体研究的热点。慢病毒可以非常高效地将基因转染到活体模式生物和几乎所有的哺乳动物细胞中，包括不分化的细胞。对于干细胞，能大大提高目的基因转导效率，转染率达90%以上。牙周组织工程体内动物实验的观察时间较长，通常为2-3个月，甚至更长时间。慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。更重要的是，慢病毒转染体系不会产生化学转染或腺病毒转染等引起的非特异性的细胞反应。本发明利用慢病毒的这一特性，尝试使用基因治疗的方法使人牙周膜干细胞在牙周骨缺损局部持续分泌表达，抑制局部大量破骨细胞的活化，抑制骨吸收，从而加快牙周骨愈合过程的能力。
[0068]目前多数学者认为基因强化组织工程牙周组织的靶细胞首选为牙周膜干细胞，它是一组具有多向分化潜能的未分化间充质细胞，直接取自牙周组织，具有很强的增殖能力，一定条件下可分化为成纤维细胞、成骨细胞和成牙骨质细胞，进一步形成新的牙周组织，而且自体细胞植入还可避免免疫排斥反应。
[0069]本发明利用携带人牙周膜干细胞基因的慢病毒转染牙周膜干细胞，然后将基因修饰的细胞与β -磷酸三钙复合，构建组织工程化骨，修复兔牙周骨缺损。
[0070]下面将结合实施例进一步详细地描述本发明，然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。
[0071]实施例1牙周膜干细胞体外培养及分化研究
[0072]1.牙周膜细胞原代培养和生理指标的检测
[0073]1.1牙周膜细胞原代培养
[0074]分别采用组织块法和酶解组织块法进行细胞原代培养。空气栓塞法处死实验动物。立即摘取兔上下颌骨，并置于75%酒精中浸泡15min。在超净工作台内，用咬骨钳去除牙齿周围的牙槽骨，完整分离出兔牙齿。拔髓针完整拔除牙髓，用含有双抗的PBS自根尖至牙冠反复冲洗，并用咬骨钳剪去牙冠及根尖部，只留根中1/3段，加入3mg/ml的I型胶原酶，在水浴震荡器37°C下消化lh，将上清接种于6孔板内，沉淀中加入胶原酶，继续消化lh，将组织块和消化下来的细胞接种到前述6孔板中，37°C、5% CO2、饱和湿度条件下于恒温孵箱中静置培养。3d后更换培养液弃去未贴壁的细胞，2-3d换液I次，收集对数生长期的牙周膜细胞的培养上清备用。细胞生长达80%汇合时，用2.5g/L的胰酶消化传代。有限稀释法克隆化培养纯化牙周膜细胞
[0075]将收集的对数生长期牙周膜细胞的培养上清1500r/min离心lOmin，经0.22 μ m直径的小滤器过滤后，与培养基以1:1比例混合作为适应性培养基。取对数生长期的第一代细胞用适应性培养基倍比稀释，调整细胞密度至10-15个/ml，吹打混匀，接种于96孔培养板中，100 μ I/孔，培养12h后标记单个细胞孔，并补液至200 μ I/孔，待克隆长至孔底1/3-1/2时，用胰酶消化分别移至24孔板和6孔板中扩大培养。
[0076]1.2牙周膜细胞的生理指标的检测
[0077]1.2.1MTT法检测细胞生长周期
[0078]分别取第4代克隆化培养的兔牙周膜细胞和未纯化的兔牙周膜细胞的单细胞悬液，各以2 X 13/孔接种于96孔板中，每孔培养液200 μ 1，共9组，每组10个复孔。连续培养9d，每3d换液。每天各取10孔，每孔分别加入MTT溶液(5g/L) 20 μ 1，37°C继续孵育4h，终止培养，吸去上清液。每孔加入150 μ I DMS0，吹打混匀。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，求均值。以时间为横轴，光吸收值为纵轴，绘制细胞生长曲线。
[0079]1.2.2细胞来源及间充质干细胞表面标志鉴定
[0080]取生长状态良好的克隆化培养的细胞制作细胞爬片。采用免疫荧光方法鉴定波形丝蛋白、角蛋白和间充质干细胞标志STR0-1的表达。
[0081]2.牙周膜干细胞的成骨诱导
[0082]2.1碱性磷酸酶活性检测分别将利用矿化液(含lOmmol/1 β -甘油磷酸钠、50 μ g/ml维生素C、I X 10_8mol/L地塞米松和10%小牛血清的L-DMEM培养液)诱导和未诱导的克隆化培养的细胞以5 X 104/ml的细胞浓度，加入96孔板，每孔100 μ 1，各接种24孔，每3天换液一次。于接种后3d和7d，按照碱性磷酸酶组化试剂盒说明操作，选择510nm波长，酶联免疫检测仪分别测定12孔诱导组和未诱导组细胞的光吸收值，检测细胞的碱性磷酸酶活性。
[0083]2.2骨钙素、I型胶原免疫细胞化学染色取生长状态良好的克隆化培养的细胞制备细胞爬片，以2X 104/ml的密度接种于置有盖玻片的6孔板中，用10%小牛血清的DMEM培养24h，待细胞伸展至60%汇合后，换矿化诱导液(含lOmmol/Ιβ-甘油磷酸钠、SOyg/ml维生素C、lXl(T8mol/L地塞米松、10%小牛血清的L-DMEM培养液)连续培养。培养21d时取部分细胞爬片，行骨钙素、I型胶原免疫细胞化学染色。
[0084]2.3矿化结节染色取生长状态良好的克隆化培养的细胞接种后，用矿化液连续培养至28d，经4%多聚甲醛固定30min，行茜素红染色，观察矿化结节形成情况。
[0085]3.牙周膜干细胞的成脂诱导
[0086]取生长状态良好的克隆化培养的细胞制备细胞爬片，以2X 104/ml的密度接种于置有盖玻片的6孔板中，用10%小牛血清的DMEM培养液培养24h，待细胞伸展至60%汇合后，换成脂诱导液(含IX 10_6mol/L地塞米松，10mg/L胰岛素,0.5mmol/L异丁基黄嘌呤，0.2mmol/L吲哚美辛，10%小牛血清L-DMEM的培养液)，观察细胞形态变化，油红O染色。
[0087]4.实验结果
[0088]本实验采用组织块法和酶解组织块法进行兔牙周膜细胞的原代培养，并采用有限稀释法进行兔牙周膜细胞克隆筛选，获得单细胞克隆来源的细胞(图1)，克隆形成率为0.52% ;细胞生长曲线结果显示，克隆化培养的牙周膜细胞和未克隆化培养的牙周膜细胞生长曲线(图2)，均呈倒“S”形，在培养的第2天细胞生长速度加快，第7天各自的生长速度减慢，总体来说克隆化培养的牙周膜细胞生长慢于未克隆化培养的牙周膜细胞；细胞免疫荧光鉴定波形丝蛋白表达阳性，角蛋白表达阴性，间充质干细胞表面标志STRO-1表达阳性(图3);并向成骨、脂肪细胞诱导分化，初步研究了牙周膜细胞的分化潜能，成骨诱导后，ALP活性增高(图4) ,ALP染色阳性，体外可形成矿化结节，茜素红染色阳性，免疫细胞化学染色结果显示OC和COL I均呈阳性表达(图5);成脂诱导后，油红O染色阳性(图6)。本实验结果表明牙周膜细胞具有间充质干细胞表型和多向分化潜能，可作为牙周组织工程的种子细胞。
[0089]实施例2慢病毒载体介导hOPG基因转染牙周膜干细胞
[0090]1.PCR扩增人骨保护基因
[0091]登陆Genbank查询人骨保护素基因(Genbank N0.NM_002546)的mRNA序列。根据文献报道设计人骨保护素基因cDNA的特异引物序列，由美国Invitrogen公司进行全基因合成hOPG基因的编码序列区域。
[0092]2.C端融合IRES-EGFP的中间载体的构建
[0093](I)根据所需融合表达的基因序列设计并合成4条引物，引物序列如下所示:
[0094]SF-Fl:
[0095]5，-AAATAGATCTGCCACCATGAACAACTTGCT-3’ (SEQ NO I)；
[0096]SF-Rl:
[0097]5’ -ATACGTCGACAGCTGGGTCTTATAAGCAGC-3’ (SEQ NO 2)；
[0098]SF-F:
[0099]5’ -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCCGCCACCATGAACAACTTGCTGTGCTGCG-3’ (SEQ NO 3)；
[0100]SF-R2:
[0101]5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCACTTGTACAGCTCAT CCATGCCG-3’ (SEQ NO4)；
[0102](2)将hOPG基因的编码序列区域克隆连接到T载体上；
[0103](3)使用引物SF-FUSF-Rl扩增含有BglI和BamHI酶切位点的hOPG基因编码序列片段，PCR反应体系如表1所示,反应条件如表2所示:
[0104]表1PCR反应体系
[0105]

【权利要求】
1.一种制备基因修饰的组织工程化骨的方法，其特征在于，所述制备方法包括: (1)构建pLenti6.3-hOPG-1RES-EGFP 重组慢病毒载体； (2)将步骤(I)得到的所述重组载体包装成重组慢病毒； (3)将步骤(2)得到的重组慢病毒感染牙周膜干细胞，获得转染重组慢病毒的牙周膜干细胞； (4)将步骤(3)获得的所述转染重组慢病毒的牙周膜干细胞同β_磷酸三钙支架材料体外复合，获得所述基因修饰的组织工程化骨。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(I)进一步包括: a、合成人类骨保护素基因的编码序列区域； b、将人类骨保护素基因的编码序列区域克隆连接到T载体上； C、使用第一引物从连接骨保护素的T载体扩增两端含有酶切位点的人类骨保护素基因的编码序列片段； d、将步骤c得到的基因片段连接到pIRES-EGFP载体上，获得OPG-1RES-EGFP载体； e、利用步骤d获得的OPG-1RES-EGFP重组载体转化大肠杆菌，筛选阳性克隆； f、使用第二引物从阳性克隆扩增出OPG-1RES-EGFP序列，亚克隆到载体pcDNA6.2w上; g、经BP重组反应到入门载体上，再经LR重组反应到pLENT6.3/V5载体上。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤c中所述第一引物序列为SEQNOl和SEQ N02所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤c中所述酶切位点是BglI和BamHI。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤f中所述第二引物序列为:SEQN03和SEQ N04所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)进一步包括: (1)磷酸三钙支架材料的制备； (2)将pLenti6.3-hOPG-1RES-EGFP转染后的牙周膜干细胞与磷酸三钙支架材料的体外复合。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸三钙支架材料的制备的具体操作如下:将颗粒型β -磷酸三钙支架材料无水乙醇浸泡24h后，用质量浓度75%酒精冲洗浸泡15min，用双蒸水漂洗3遍，经高温高压灭菌后置入24孔板中，用含10 %胎牛血清的DMEM培养液预湿备用。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述体外复合的具体操作如下:将pLenti6.3-hOPG-1RES-EGFP转染牙周膜干细胞，细胞消化后制备成5 X 106/ml的细胞悬液，分别滴加于24孔培养板中备用的β -磷酸三钙材料上，使细胞自然沉降在材料表面，2h后在培养皿中缓慢注入含10%胎牛血清的DMEM培养液2ml，充分浸没材料，再加入适量的培养基，在体积分数为5%的CO2、37 °C孵箱中培养。
9.一种基因工程修饰的组织工程化骨，其是根据权利要求1-8任一项所述方法获得的。
10.权利要求9所述的组织工程化骨在制备治疗牙周骨缺损疾病的材料中的用途。
【文档编号】A61L27/36GK104174064SQ201410331757
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年7月11日 优先权日:2014年7月11日
【发明者】刘洪臣, 苏方, 王东胜, 鄂玲玲 申请人:中国人民解放军总医院, 中国人民解放军第306医院