氧化苦参碱在制备治疗柯萨奇病毒感染性疾病药物的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种氧化苦参碱在制备治疗柯萨奇病毒感染性疾病药物的应用。本发明提供了氧化苦参碱，在制备治疗柯萨奇病毒感染性疾病，特别是柯萨奇病毒A16型和柯萨奇病毒B3型感染性疾病的药物的新应用。将氧化苦参碱制备得到的药物，对柯萨奇病毒感染性疾病有预料不到的治疗效果。
【专利说明】氧化苦参碱在制备治疗柯萨奇病毒感染性疾病药物的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于药学领域，涉及氧化苦参碱的应用，尤其是氧化苦参碱在制备治疗柯 萨奇病毒感染性疾病药物的应用。
【背景技术】
[0002] 氧化苦参碱（Oxymatrine)是从中药苦豆子中提取的或化学合成等途径获得的一 种生物碱，其分子式为C 15H24N2O2. H2O,分子量为282。无色结晶，熔点2080°C，易溶于水。氧 化苦参碱是苦参的主要药理活性成分之一，具有清热、燥湿、解毒、利尿、祛风、杀虫之功效。
[0003] 柯萨奇病毒属于小核糖核酸病毒科肠病毒属，据其在乳鼠中引起病变的差异分为 A、B两个组，A组和B组均可感染人类。经消化道传播感染人类，可引起手足口病、脑膜脑 炎、心肌炎、疱疹性咽峡炎、支气管炎和腮腺炎等。目前，常用的治疗方法主要为抗病毒（利 巴韦林、阿昔洛韦）、免疫调节（干扰素、免疫球蛋白）、促进心肌代谢（三磷酸腺苷、辅酶A、 肌苷等）、中药治疗、对症治疗等。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于，提供一种氧化苦参碱在制备治疗柯萨奇病毒感染性疾病药物 的应用。特别是提供一种氧化苦参碱在制备治疗柯萨奇病毒A16型和柯萨奇病毒B3的药 物的应用。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案如下：一种氧化苦参碱在制备治疗 柯萨奇病毒感染性疾病药物的应用。
[0006] 上述的应用中，所述的治疗柯萨奇病毒感染性疾病药物，是治疗柯萨奇病毒A16 型和柯萨奇病毒B3的药物。
[0007] 前述的应用中，所述的治疗柯萨奇病毒感染性疾病药物，是以氧化苦参碱为原料， 按常规制剂工艺，再加入相应辅料，制备成任何一种适合于临床上使用的口服或非口服剂 型。
[0008] 前述的应用中，所述的口服或非口服剂型包括散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、微囊 齐IJ、丸剂、滴丸、软胶囊、口服液、糖浆剂、分散片、喷雾剂或气雾剂、静脉注射剂、肌肉注射 齐IJ、吸入剂或凝胶剂。
[0009] 前述的应用中，所述的辅料包括常规的溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂、粘 合剂、润滑剂、润滑剂、湿润剂、增稠剂、增溶剂和基质。
[0010] 与现有技术比较，本发明提供了氧化苦参碱，在制备治疗柯萨奇病毒感染性疾病， 特别是柯萨奇病毒A16型和柯萨奇病毒B3型感染性疾病的药物的新应用。将氧化苦参碱 制备得到的药物，对柯萨奇病毒感染性疾病有预料不到的治疗效果。
[0011] 以下是本发明的实验例：
[0012] 实验例1 :氧化苦参碱抗柯萨奇病毒A16型和B3型的细胞实验
[0013] UHela细胞的复苏和培养
[0014] ⑴实验前准备：将一次性细胞瓶、泡酸并灭菌处理后的移液管及尖头玻璃离心管、 污物缸放于超净工作台台面上，开启紫外30分钟后关闭。将4°C保存的1640完全培养基放 入37°C温箱中预温，并将水浴箱中的水预热至37°C。
[0015] ⑵将冻存于液氮中的Hela细胞迅速取出，直接投入已预热至37°C的水浴箱中，并 轻轻不断摇动使其内容物在1分钟完全融化成悬液。取出冻存管，用2%新洁尔灭擦拭后放 入超净工作台内，用移液管将悬液转移至一洁净尖头玻璃离心管中，加入2-3mll640完全 培养基，配平后IOOOrpm离心约3-4分钟，吸净上清后加入2-3ml 1640完全培养基，将沉淀 轻轻吹匀制成细胞悬液。
[0016] ⑶倒置显微镜下观察，置于37°C、5% CO2培养并每日观察复苏后的细胞生长贴壁 情况，待Hela细胞长成致密单层后即可传代。
[0017] ⑷换液及传代：观察Hela细胞换液后贴壁生长情况良好，形态正常为多边形。
[0018] 2.柯萨奇病毒的活化增殖
[0019] ⑴将购回的CVA16(即柯萨奇病毒A16型）和CVB3(即柯萨奇病毒B3型）病毒液 从液氮中取出，使其自然完全融化。
[0020] ⑵病毒感染细胞：在超净工作台中无菌操作将生长状态良好的单层Hela细胞培 养物中的旧培养基吸弃，用IXPBS缓冲液漂洗细胞3次后加入融化后的CVA16和CVB3病 毒原液，37°C孵育2小时使病毒吸附，然后将多余的病毒液吸弃，以I XPBS缓冲液漂洗3次 后加入适量1640维持液，倒置显微镜下观察后37°C、5% CO2条件下培养，48小时后收集培 养液。
[0021] ⑶收集活化增殖后的病毒液：每日观察病毒感染细胞情况，病毒成功在细胞中增 殖后可见细胞出现变大变圆、脱落、出现融合细胞等细胞病变效应（CPE)，待75%以上细胞 出现细胞病变，无菌操作将细胞瓶中的培养液转移至无菌尖头玻璃离心管中，3000rpm离心 约3分钟后弃去沉淀保留上清液，分装至冻存管中，-20°C保存备用或冻于液氮中。
[0022] 3.测定 CVA16 和 CVB3 对 Hela 细胞的 TCID50
[0023] ⑴将Hela细胞计数为浓度1-5 X IOVml，并接种到96孔细胞板上，37°C、5 % CO2培 养至细胞长成单层。
[0024] ⑵将活化增殖后冻于_20°C备用的CVA16和CVB3病毒液自然解冻。在EP管中用 RPMI-1640维持液将CVA16和CVB3病毒液以10倍梯度稀释法连续稀释成KT1-KT'将10 倍梯度稀释的CVA16和CVB3液，分别接种100 μ 1于各Hela细胞单层培养物，每稀释度8 孔。37°C孵育1小时使病毒吸附，将多余的病毒吸弃，加入100 μ 1/孔1640维持液，37°C、 5% CO2培养，逐日观察CPE并照相，连续观察3-5天（一般2-3天细胞才会出现明显CPE)， 细胞病变达50%以上计为阳性。
[0025] ⑶按Reed-Muench方法计算CVA16的TCID5Q。LgTCID 5tl =高于50%病变率的病毒 稀释度的对数+距离比例X稀释度对数之间的差。距离比例=(高于50 %病变率-50 % ) / (>50%病变阳性率-低于50%病变率），最后换算为TCID5cZml。病毒感染细胞后的48小 时和72小时都要观察CPE并计算TCID 5tl。
[0026] 4. OMT对Hela细胞的细胞毒性实验
[0027] ⑴将Hela细胞计数为浓度1-5 X IO5Ail，并接种到96孔细胞板上，再加入20 μ 1/ 孔用1^^1-1640稀释的不同稀释度的01〇'(0.5、1、2、3、4、5、1011^/1111)或对照（细胞悬液+ 等量的PBS)，每个稀释度OMT各加一排，各设置3个复孔。倒置显微镜下观察后37°C、5 % CO2培养48小时，并每日观察各孔细胞形态和数量的差异。
[0028] ⑵MTT测定：将OMT的细胞毒性测定的各孔中的上清吸弃，加入I XPBS缓冲液洗 3次后轻轻扣去。避光操作加入20 μ 1/孔5mg/ml的MTT溶液，37°C孵育4小时后吸净各孔 内液体，加入1〇〇μ 1/孔DMSO终止反应。37°C静置10-15分钟，震荡摇匀，待各孔中的紫色 结晶物完全溶解可观察见孔内液体呈均匀紫色。用酶标仪在492nm波长处测定每孔光吸收 度值。光吸收度值与活细胞数量呈正相关。数据来自3次独立重复的实验，以i± S表示， 用SPSS19. 0统计处理，各浓度OMT与对照间的比较采用成组t检验。
[0029] 5. OMT(即氧化苦参碱，下同）体外抗柯萨奇病毒实验
[0030] ⑴将Hela细胞计数为浓度1-5 X IOVml，并接种到96孔细胞板上，37°C、5 % CO2培 养至细胞长成单层。
[0031] ⑵稀释OMT :用无菌蒸馏水溶解0ΜΤ，然后用RPMI-1640将浓度为125μ g/ml的OMT 用1:10PBS缓冲液对倍稀释后得浓度为62. 5 μ g/ml的0ΜΤ，共得到浓度分别为1000 μ g/ ml、500 μ g/ml、250 μ g/ml、125 μ g/ml、62. 5 μ g/ml 的 5 个不同稀释度的 rMBD-3 用于抗病毒 实验.
[0032] ⑶稀释病毒：待冻于液氮中的病毒液自然完全融化，稀释CVB3为100 X TCID5tl，即 KT3 7〇· lml。
[0033] (4)在EP管中分别先将270 μ 1病毒液和30 μ 15个不同稀释度的rMBD-3、干扰素、 利巴韦林混匀备用。洗板后直接将上一步的混合液100 μ 1/孔加入96孔板各孔中，5个不 同稀释度的rMBD-3、干扰素和利巴韦林各加一行，每行各设置3复孔。37°C孵育1小时吸弃 各孔上清，加入200μ 1/孔1640维持液维持细胞生长。逐日观察CPE，37°C、5% C02培养 48小时用MTT法测定各孔光吸收度值。
[0034] 6.实验结果
[0035] ⑴CVA16和CVB3对Hela细胞的TCID5tl测定结果
[0036] CVA16和CVB3均可致Hela细胞病变，正常Hela细胞为多边形铺于瓶壁。CVA16 或CVB3感染Hela细胞后，出现细胞变大变圆，脱离瓶壁，可见融合细胞出现（如图1，图1 中A为正常Hela细胞；B为CVA16感染Hela细胞后48小时；C为CVB3感染Hela细胞后 48小时）。检测、计算可知：CVA16对Hela细胞的TCID 5tl为I(T5 8A). Iml ;CVB3对Hela细胞 的 TCID5tl 为 KT3.5/0· lml。
[0037] ⑵OMT对Hela细胞的细胞毒性实验结果：加入0· 5、l、2、3、4、5mg/ml0MT对Hela 细胞生长无影响，与对照组相比P〈〇. 05 ;而10mg/ml0MT可抑制Hela细胞的增殖，与对照组 相比P>0. 1(图2)
[0038] ⑶OMT体外抗柯萨奇病毒实验结果：图3是OMT抗CVB3细胞实验结果，图4是OMT 抗CVA16细胞实验结果，从图3和图4可以看出，与病毒对照组相比，OMT各剂量组具有抑 制CVB3或CVA16复制，保护Hela细胞的作用（P〈0. 05)。其中，0. 2mg/ml0MT抑制柯萨奇病 毒的作用最显著（P〈〇. 01)。
[0039] 实验例2 :氧化苦参碱防治柯萨奇病毒B3的小鼠感染模型
[0040] 1.实验前准备
[0041] ⑴领取小鼠：领取Balb/C雌性小鼠150只，4周龄，适应性喂养2天。
[0042] ⑵随即将小鼠分为10组，每组15只：
[0043] ①正常组：不做任何处理，同其他组小鼠一起喂养；
[0044] ②模型组：100 X TCID5(ICVB3腹腔接种4次，不做治疗或预防；
[0045] ③利巴韦林治疗组：10mg/kg · D, QD,末次接种病毒后开始治疗；
[0046] ④OMT治疗高剂量组：12. 5mg/kg · D，QD，末次接种病毒后开始治疗；
[0047] ⑤OMT治疗中剂量组：6. 25mg/kg · D，QD，末次接种病毒后开始治疗；
[0048] ⑥OMT治疗低剂量组：3. 125mg/kg · D，QD，末次接种病毒后开始治疗；
[0049] ⑦利巴韦林预防组：10mg/kg · D, QD,第一次接种病毒后开始治疗；
[0050] ⑧OMT预防高剂量组：12. 5mg/kg · D，QD，第一次接种病毒后开始治疗；
[0051] ⑨OMT预防中剂量组：6. 25mg/kg · D，QD，第一次接种病毒后开始治疗；
[0052] ⑩OMT预防低剂量组：3. 125mg/kg · D，QD，第一次接种病毒后开始治疗；
[0053] ⑶稀释利巴韦林：
[0054] (4)稀释 OMT :
[0055] 2.检测指标
[0056] ⑴分别在末次接种病毒后的第5、12天处死3只小鼠/组，检查小鼠心肌组织的病 理情况和病毒载量。
[0057] ⑵在末次接种病毒后的第28天处死所有小鼠，计算各组死亡率。
[0058] ⑶心肌组织的病理情况检查：
[0059] ①称量处死小鼠的体重，摘取心脏，吸尽血液后称量心脏重量，计算心指数（心指 数=心脏重量/体重）。
[0060] ②将心脏组织制作成组织切片，行HE染色，显微镜下观察病理反应。
[0061] ⑷心肌组织病毒基因含量半定量检测（RT-PCR):
[0062] ①称取心肌组织lOOmg，提取总RNA ;
[0063] ②利用反转录试剂盒合成cDNA ;
[0064] ③运用CVB3的特异性引物扩增其基因片段，琼脂糖电泳后，分析电泳条带的灰度 值，与内参比较得到CVB3基因的相对表达量。
[0065] 3.检测指标
[0066] 数据来自3次独立重复的实验，以I-±S表示，用SPSS19. 0统计处理，各组数据之 间的比较采用单因素的方差分析。
[0067] 4.实验结果
[0068] ⑴OMT对CVB3感染小鼠死亡率的影响：预防或治疗性给予OMT可有效降低CVB3 感染小鼠的死亡率（表1)。OMT中、低剂量组的小鼠生存率均明显低于模型组，表明OMT中 剂量和低剂量均具有较强的抗CVB3作用。
[0069] 表I OMT对CVB3感染小鼠死亡率和心指数的影响
[0070]
【权利要求】
1. 氧化苦参碱在制备治疗柯萨奇病毒感染性疾病药物的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的治疗柯萨奇病毒感染性疾病药物， 是治疗柯萨奇病毒A16型感染性疾病和柯萨奇病毒B3型感染性疾病的药物。
3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的治疗柯萨奇病毒感染性疾病 药物，是以氧化苦参碱为原料，按常规制剂工艺，再加入相应辅料，制备成任何一种适合于 临床上使用的口服或非口服剂型。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的口服或非口服剂型包括散剂、片 齐?、颗粒剂、胶囊剂、微囊剂、丸剂、滴丸、软胶囊、口服液、糖浆剂、分散片、喷雾剂或气雾剂、 静脉注射剂、肌肉注射剂、吸入剂或凝胶剂。
5. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的辅料包括常规的溶剂、崩解剂、矫 味剂、防腐剂、着色剂、粘合剂、润滑剂、润滑剂、湿润剂、增稠剂、增溶剂和基质。
【文档编号】A61P31/14GK104288146SQ201410587164
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月28日 优先权日:2014年10月28日
【发明者】江滟, 沈祥春, 朱荣金, 牟秋菊, 罗红 申请人:江滟