本发明涉及生物
技术领域：
，更具体而言本发明涉及分子医药领域，特别是微小RNA分子的医药用途。
背景技术：
：microRNA(miRNA，又称微小RNA)是一类内生的、高度保守的、非编码的小单链RNA，长度约18-25个核苷酸(nt)(Lietal.，2010)。它广泛存在于生物界，从低等生物到人，甚至在古细菌和真菌中也能发现其踪迹。microRNA通过与蛋白编码基因的mRNAs反向互补，以调控其蛋白的表达(Ambrosetal.，2001)。已有研究报道microRNA参与调控多种生物学过程，例如细胞的发育调控，细胞增殖、分化、凋亡，肿瘤的发生和迁移，以及耐药性的调节等过程(Zhaoetal.，2007)。研究表明microRNA能影响化疗药物的敏感性，而且越来越多的研究证实microRNA的异常表达可导致肿瘤细胞的耐药性。Climent等发现乳腺癌患者由于11q染色体上mir-125b的缺失导致蒽环霉素类化疗药的耐药性增加。同时乳腺癌患者对紫杉醇、5-氟尿嘧啶、拓扑替康等化疗药也产生耐药性。已有专利公开申请基于microRNA的方法用于乳腺癌的诊断、预后和治疗(US2006/029889，克劳斯等.，；US2010/0297627，Watsonetal.，)。因此microRNA对肿瘤化疗药物的敏感性起着十分重要的作用。乳腺癌的发病率位居首位，对女性生命造成严重的威胁。化学治疗是目前治疗乳腺癌的主要方法，但随着治疗的深入，乳腺癌患者往往会对药物产生一定的耐药性，使得治疗难度加大。本所申请的基于代谢组学方法发现microRNA 在调控乳腺癌细胞代谢水平方面的应用，是本领域亟待发现microRNA的治疗用途。技术实现要素：本发明发现一种microRNA可影响抗肿瘤药物敏感性，所述治疗药物为它莫昔芬(tamoxifen)。所述microRNA为mir-103a-3p。所述mir-103a-3p的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO：1。因此，本发明的第一方面涉及用于制备一种具有影响肿瘤功能的药物组合物，所述药物组合物包括：a)有效量的mir-103a-3p和药学上可接受的载体；b)肿瘤治疗药物。在本实施方案中，所述肿瘤是乳腺癌。本实施方案中，所述肿瘤治疗药物为化疗剂，所述化疗剂优选为它莫昔芬(tamoxifen)。本发明的第二方面涉及microRNA在制备药物中的应用，尤其涉及mir-103a-3p在制备影响肿瘤细胞药物敏感性的药物组合物的应用。在本实施方案中，所述肿瘤是乳腺癌。本实施方案中，所述肿瘤治疗药物为化疗剂，所述化疗剂优选为它莫昔芬(tamoxifen)。附图说明图1为不同浓度MCF7细胞在384孔板中的生长曲线。图2为不同浓度miRNA对细胞生长的影响。图3为mir-103a-3p可增强它莫昔芬对肿瘤细胞生长的抑制效果。具体实施方式如本文所用，术语“影响抗肿瘤药物敏感性”指本发明引起肿瘤细胞生长降低至一定水平所需的抗肿瘤药物的显著变化。如本文所用，术语“mir-103a-3p”、“miRNA-103a-3p”或“microRNA-103a-3p”可互换使用。本发明的术语中包含但不限于SEQIDNO：1所示序列或其同源序列。本发明的术语中还包含已知各种来源的mir-103a-3p的同源序列，例如人、大鼠、小鼠、马等。如本文所用，术语“mir-103a-3p”指核酸编码mir-103a-3p和同源物和其变体，包括对mir-103a-3p的功能或结构不产生不利影响的取代、添加和缺失。本发明的术语中包含天然存在的mir-103a-3p序列中取代、添加或缺失一个或几个核酸，或经生物化学修饰，且仍具有生物活性的衍生RNA。本发明涉及治疗型miRNA的设计、合成、构建、组成、特性和应用以及如此miRNA治疗肿瘤的有效方式。更具体地，本发明公开了，人工合成的mir-103a-3p显著影响肿瘤细胞药物敏感性的代谢水平。mir-103a-3p以初始转录物(pri-miRNA)、miRNA前体、成熟miRNA、片段或其变体(保留成熟miRNA的生物活性)和DNA编码的初始转录物(pri-miRNA)、miRNA前体、成熟miRNA、片段或其变体的形式存在，或以miRNA调控元件的形式存在。本发明所述mir-103a-3p的序列变体包括取代、插入或缺失变体的一种或多种。如本文所用，术语“核酸或核酸序列的同源性”是指它们天然或人工来源于一个共同祖先的核酸或核酸序列。一般由两个或多个核酸或蛋白(或其序列)之间的序列相似性来推断同源性。如本文所用，序列之间相似性的百分比为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％时，可建立同源性。确定序列相似性的算 法可通过美国国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)公开获得。如本文所用，所述“有效量”是指足以产生生物活性的药物组合物的量。所选用的剂量水平取决于多种因素，包括药物组合物的活性、给药途径、与其他药物或治疗方法的组合、所治疗患者的严重程度等。优选地最合适的剂量由本领域内普通技术人员来评定。本发明的药物组合物在无菌的和无热源的条件下制备。所述药物组合物的制备方法在本领域技术人员的能力范围之内，可参考Remington’sPharmaceuticalScience，第17版，MackPublishingCompany，Easton，Pa.(1985)中其公开内容所描述的。合适的药学上可接受的载体包括水、缓冲水溶液、生理盐水、0.4％的盐水、有机溶剂等。本发明的药物组合物包括常规的药物赋形剂和/或添加剂。合适的药物赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、渗透压调节剂、缓冲剂和pH调节剂。合适的添加剂包括例如生理生物相容性缓冲剂(盐酸氨丁三醇)、螯合剂(DTPA或DTPA-双酰胺)或钙螯合物(DTPA钙、CaNaDTPA-双酰胺)，钙或钠盐(氯化钙、抗坏血酸钙、葡萄糖酸钙或乳酸钙)的加入。本发明的药物组合物可以液态形式包装或冻干。本发明的固体药物组合物，可用常规的药学上可接受的无毒载体例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。用于将核酸导入细胞的方法在此领域内有很多，其包括但不限于脂质体包裹RNA法、电穿孔法、磷酸钙介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、病毒和非病毒载体等。本发明所用的材料和试剂均来自市购。实施例：材料和方法1.细胞的培养将乳腺癌细胞系MCF7(航天医学基础与应用国家重点实验室张华博士赠送)在加入10％胎牛血清的DMEM(高糖)培养基(Hyclone)中，放置于37℃、5％CO2湿度培养箱中培养。2.mir-103a-3p激动剂转染mir-103a-3p激动剂是直接将mir-103a-3p的成熟序列(SEQIDNO：1)经过特殊化学修饰(如全链上的甲基化修饰、5’端和3’端的硫代修饰和3’端的胆固醇修饰)而合成的，它通过模拟内源性mir-103a-3p的作用来调节靶基因的表达。将MCF7细胞铺板于6孔板中，过夜培养。待细胞密度达到50％时，用无血清培养基(Opti-MEM)稀释mir-103a-3p激动剂(广州锐博生物科技有限公司)储存液。轻轻混匀，向孔中加入上述混合液。待转染4-6小时后，将含有miRNA的培养基去掉，加入新的细胞培养基。转染一段时间后，用发光法细胞活力测试(CTGassay)检测细胞存活量。本实施例中，采用的策略为在细胞转染miRNA24小时后，将细胞重新接种到384孔板中，然后加入抗肿瘤药物，一段时间以后进行细胞活性测试。从图1中可以看到每孔500个细胞这种浓度能保证细胞在120个小时的时间内依然有持续的生长空间，因此我们选用该细胞浓度进行后续实验。从图2中可以看到，不同浓度的miRNA对细胞生长的影响几乎一致，我们选用100nM的miRNA浓度进行后续实验。在本实验中，细胞中均加入400nM，从图3中可以看出，mir-103a-3p可大大增强它莫昔芬对肿瘤细胞的抑制效果。表1mir-103a-3p可降低它莫昔芬对肿瘤细胞的半数抑制浓度无处理Lipo3000mir-103a-3pIC50(nM)283137341101表1显示，加入mir-103a-3p后，可以使他莫昔芬对肿瘤细胞的半数抑制浓度大大下降，降低至不加microRNA时的不到40％。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3