一种可注射骨修复水凝胶及其制备方法与流程

本发明属于医药领域，具体涉及一种可注射骨修复水凝胶及其制备方法。

背景技术：

由于骨质疏松、创伤、肿瘤、感染和其他疾病而使骨丧失了一些骨质，形成较大的间隙，称为骨缺损。绝大多数骨缺损都难以愈合，最后形成骨不连。长期以来，骨缺损的修复主要采用自体骨移植或同种异体骨移植的方法，自体骨因兼有骨诱导活性和骨传导作用，并且携有具成骨作用的骨髓细胞，故目前仍奉为“金标准”，但自体骨来源有限，且取骨增加患者痛苦；异体骨存在不同程度的免疫排斥反应及具有潜在的病源传播危险。近年来，临床上也在使用各种金属、高分子材料或陶瓷等制造的人工骨替代材料。但是，这些材料的植入都有潜在增加骨丢失量，造成周围组织的损伤，也使患者承受较大的手术创伤等缺点。

利用微创手术结合可注射骨修复材料修复骨缺损克服了完全人工骨替代材料的不足，极大地提高了手术的安全性和实用性，且手术费用低、损伤小。然而，目前上临床上使用的可注射骨修复材料中都存在不足，如：甲基丙烯酸甲酯(PMMA)骨水泥由于现场固化放热导致温度升至90℃甚至更高，可能引起周围组织坏死；且其生物相容性差、不可降解、残留单体及引发剂存在细胞毒性。磷酸钙骨水泥(CPC)的固化时间长、粘结性能差、抗水性能不足、初凝阶段接触体液易崩解、机械性能难以与正常骨相匹配，未固化的微纳米粉体一旦进入心血管系统，则会造成血管堵塞；硫酸钙溶解迅速，在体液里易溃散，缺乏骨诱导性。综上，传统可注射骨修复材料尚有一定的缺陷而不适用于生物医学领域。

技术实现要素：

针对现有技术中的缺陷和不足，本发明的目的是提供一种可注射骨修复水凝胶及其制备方法，该方法能在生理条件下形成水凝胶，不需要添加具有生物/细胞毒性的交联剂或引发剂，反应条件温和，无剧烈放热，在临床应用中不会引发周围组织损伤。同时凝胶化时间可控，满足临床骨缺损修复的要求。并且所制得的水凝胶具有细胞/组织粘附性，有良好的生物相容性和生物降解性。该水凝胶有望成为临床上理想的骨缺损修复材料。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种可注射骨修复水凝胶，该水凝胶包括将聚多巴胺修饰的钙磷颗粒固载在带有醛基的可降解天然高分子上，再将带有氨基的可降解天然高分子与固载有聚多巴胺修饰的钙磷颗粒的带有醛基的可降解天然高分子混合发生席夫碱反应得到。

具体的，所述的聚多巴胺修饰的钙磷颗粒包括将钙磷颗粒分散于0.5～5mg/ml的多巴胺Tris-HCl溶液中形成浓度为0.25％～1％W/V的溶液，搅拌离心后即得聚多巴胺修饰的钙磷颗粒。

更具体的，所述的钙磷颗粒包括：羟基磷灰石、硫酸钙、碳酸钙和磷酸钙中的一种或一种以上的混合物；钙磷颗粒的粒径为100nm～10μm。

还有，所述的带有醛基的可降解天然高分子包括氧化海藻酸钠、氧化透明质酸、氧化纤维素、氧化甲壳素和氧化硫酸软骨素中的一种或一种以上的混合物。

另外，所述的带有氨基的可降解天然高分子包括明胶、壳聚糖、胶原、类人类胶原蛋白和生物短肽中的一种或一种以上的混合物。

可注射骨修复水凝胶的制备方法，包括将2～20wt％的带有氨基的可降解天然高分子缓冲溶液与5～20wt％的固载有聚多巴胺修饰的钙磷颗粒的带有醛基的可降解天然高分子缓冲溶液以体积比为1∶0.25～4的比例混合，搅拌发生席夫碱反应形成所述的水凝胶。

优选的，包括将20wt％的带有氨基的可降解天然高分子缓冲溶液与20wt％的固载有聚多巴胺修饰的钙磷颗粒的带有醛基的可降解天然高分子缓冲溶液以体积比为1∶1的比例混合，搅拌发生席夫碱反应形成所述的水凝胶。

优选的，所述的带有氨基的可降解天然高分子为明胶，带有醛基的可降解天然高分子为氧化海藻酸钠，聚多巴胺修饰的钙磷颗粒为聚多巴胺修饰的纳米羟基磷灰石颗粒。

还有，所述的缓冲溶液中使用的缓冲液可以为磷酸缓冲液、生理盐水或模拟体液。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

一、本发明的水凝胶是在生理条件下天然高分子通过席夫碱反应形成的，不需要添加具有生物/细胞毒性的交联剂或引发剂。该反应条件温和，无剧烈放热，在临床应用中不会引发周围组织损伤，适用于临床骨修复材料。

二、该水凝胶引入仿贻贝的粘附分子聚多巴胺对钙磷颗粒进行表面修饰，从而使钙磷颗粒在水凝胶网络中具有良好的分散性；且经聚多巴胺修饰后的钙磷颗粒能与水凝胶中的天然高分子发生席夫碱反应，既增加水凝胶网络的交联度，也提高了水凝胶的力学性能，适用于骨缺损的修复。

三、该水凝胶的主体成分是具有优异的细胞/组织亲和性的天然高分子，且上述物质均可以完全生物降解。因此该水凝胶可完全降解，且降解产物无毒副作用；同时，该水凝胶中的聚多巴胺具有超强的粘附性能，有利于成骨相关细胞的粘附、增殖，从而能与钙磷颗粒协同促进骨组织的生长和修复。

附图说明

图1为实施例1-3中的水凝胶注射5分钟后凝结效果图；

图2为实施例1-3中的水凝胶注射15分钟后凝结效果图；

图3为实施例2制得的水凝胶最终凝结效果图；

以下结合说明书附图和具体实施方式对本发明做具体说明。

具体实施方式

针对现有技术中的缺陷和不足，本发明的目的是提供一种可注射骨修复水凝胶及其制备方法，该方法能在生理条件下形成水凝胶，不需要添加具有生物/细胞毒性的交联剂或引发剂，反应条件温和，无剧烈放热，在临床应用中不会引发周围组织损伤。同时凝胶化时间可控，满足临床骨缺损修复的要求。并且所制得的水凝胶具有细胞/组织粘附性，有良好的生物相容性和生物降解性。该水凝胶有望成为临床上理想的骨缺损修复材料。

一种可注射骨修复水凝胶的制备方法，其具体步骤如下：

A、聚多巴胺(PDA)修饰钙磷颗粒

将钙磷颗粒分散于0.5～5mg/ml的多巴胺(DA)的Tris-HCl溶液中，形成0.25％～1％W/V的溶液，搅拌6～24h后离心，可得到PDA修饰的钙磷颗粒(PCP)；

B、PCP的固定

向5～20wt％的带有醛基的可降解天然高分子磷酸缓冲液(PBS)中加入PDA修饰的钙磷颗粒(PCP)，充分混合，其中PCP的浓度为5～20wt％，即得固载有PDA修饰的钙磷颗粒的带有醛基的可降解天然高分子磷酸缓冲溶液；

C、水凝胶的制备

将带有氨基的可降解天然高分子溶解于磷酸缓冲液(PBS)中，形成2～20wt％的溶液，再将其与上述固载有PDA修饰的钙磷颗粒的带有醛基的可降解天然高分子磷酸缓冲溶液以体积比1∶0.25～4的比例混合，充分搅拌，发生席夫碱反应形成水凝胶。

进一步，本发明中A步中使用的钙磷颗粒为：羟基磷灰石、硫酸钙、碳酸钙和磷酸钙等钙盐颗粒(上述颗粒粒径为100nm-10μm)中的一种或一种以上的混合物。

进一步，本发明B步中使用的带有醛基的可降解天然高分子是氧化海藻酸钠、氧化透明质酸、氧化纤维素、氧化甲壳素和氧化硫酸软骨素等的一种或一种以上的混合物。

进一步，本发明C步中使用的带有氨基的可降解天然高分子是明胶、壳聚糖、胶原、类人类胶原蛋白和生物短肽等的一种或一种以上的混合物。

进一步，本发明B或C步中的磷酸缓冲液可以替代为生理盐水或模拟体液等缓冲液。

以下结合具体实施例对本发明做具体说明，但本发明并不局限于下述实施例，本领域技术人员通过合理推断得到的其他技术方案均在本发明的保护范围之内。以下实施例中使用的磷酸缓冲液的浓度为0.01M，pH为7.2～7.4。

实施例1：

A、PDA修饰纳米羟基磷灰石

将2g纳米羟基磷灰石(HA)(粒径为150～200nm)分散在100ml浓度为5mg/ml的多巴胺(DA)的Tris-HCl溶液中，搅拌12h后离心，可得到PDA修饰的纳米羟基磷灰石(PHA)；

B、氧化海藻酸钠(ADA)的制备

将5.0g海藻酸钠分散在25ml乙醇中形成悬浮液I，将3.25g高碘酸钠溶于25ml蒸馏中形成溶液II，随后将溶液II加入到悬浮液I中，避光搅拌反应6h后加入2.5ml乙二醇终止反应2h，将该反应混合液加入到剧烈搅拌的200ml无水乙醇中。抽滤后将产物用蒸馏水充分溶解后装入透析袋中透析3d；最终将白色产物放入表面皿中，冷冻干燥3d，即可得到氧化海藻酸钠；

C、PHA的固定

向20wt％的ADA磷酸缓冲液(PBS)中加入PHA，充分混合，其中PHA的浓度为10wt％，得到ADA-PHA溶液；

D、水凝胶的制备

将明胶溶解于磷酸缓冲液(PBS)中，形成15wt％的溶液，再将其与上述的ADA-PHA溶液按照体积比1∶1的比例混合，充分搅拌，发生席夫碱反应形成水凝胶。

经测定水凝胶的凝胶时间约为15min。

实施例2：

本实施例与实施例1不同的是：

C、PHA的固定

向20wt％的ADA磷酸缓冲液(PBS)中加入PHA，充分混合，其中PHA的浓度为20wt％，得到ADA-PHA溶液；

经测定水凝胶的凝胶时间约为5min。

实施例3：

本实施例与实施例1不同的是，纳米羟基磷灰石未经PDA修饰，经测定混合液超过30min未凝胶。

将实施例1-3的水凝胶进行注射凝胶时间测试：注射5分钟后凝胶结果见图1，图1中的a为实施例3中的水凝胶的凝结情况，图1中的b为实施例1中的水凝胶的凝结情况，图1中的c为实施例2中的水凝胶的凝结情况；

注射15分钟后的的凝结效果图见图2，图2中的a为实施例3中的水凝胶的凝结情况，图2中的b为实施例1中的水凝胶的凝结情况，图2中的c为实施例2中的水凝胶的凝结情况；

由图1和图2中的凝结效果图可知，随着聚多巴胺(PDA)修饰的纳米羟基磷灰石(PHA)浓度的增加，水凝胶体系的凝胶时间相应缩短。临床应用中可根据需要在一定范围内(3-20min)调整凝胶时间以适应各种类型的骨缺损修复。

实施例2制备得到的水凝胶的最终凝结效果图见图3，图3说明在生理条件下天然高分子通过席夫碱反应形成了水凝胶，不需要添加具有生物/细胞毒性的交联剂或引发剂。

实施例4：

A、PDA修饰纳米羟基磷灰石

将2g纳米羟基磷灰石(HA)(粒径为150～200nm)分散在100ml浓度为3mg/ml的多巴胺(DA)的Tris-HCl溶液中。搅拌16h后离心，可得到PDA修饰的纳米羟基磷灰石(PHA)。

B、氧化海藻酸钠(ADA)的制备

将5.0g海藻酸钠分散在25ml乙醇中形成悬浮液I，将3.25g高碘酸钠溶于25ml蒸馏中形成溶液II，随后将溶液II加入到悬浮液I中，避光搅拌反应4h后加入与2.5ml乙二醇终止反应2h，将该反应混合液加入到剧烈搅拌的200ml无水乙醇中。抽滤后将产物用蒸馏水充分溶解后装入透析袋中透析3d；最终将白色产物放入表面皿中，冷冻干燥3d，即可得到氧化海藻酸钠。

C、PHA的固定

向12wt％的ADA磷酸缓冲液(PBS)中加入PHA，充分混合，其中PHA的浓度为15wt％，得到ADA-PHA溶液。

D、水凝胶的制备

将壳聚糖溶解于磷酸缓冲液(PBS)中，形成2wt％的溶液，再将其与上述的ADA-PHA溶液按照体积比1∶1的比例混合，充分搅拌，发生席夫碱反应形成水凝胶。

经测定水凝胶的凝胶时间约为10min。

实施例5：

A、PDA修饰纳米羟基磷灰石

将2g纳米羟基磷灰石(HA)(粒径为150～200nm)分散在100ml浓度为0.5mg/ml的多巴胺(DA)的Tris-HCl溶液中。搅拌24h后离心，可得到PDA修饰的纳米羟基磷灰石(PHA)。

B、氧化纤维素(CDA)的制备

将5.0g纤维素分散在25ml乙醇中形成悬浮液I，将3.10g高碘酸钠溶于25ml蒸馏中形成溶液II，随后将溶液II加入到悬浮液I中，避光搅拌反应6h后加入与2.5ml乙二醇终止反应2h，将该反应混合液加入到剧烈搅拌的200ml无水乙醇中。抽滤后将产物用蒸馏水充分溶解后装入透析袋中透析3d；最终将白色产物放入表面皿中，冷冻干燥3d，即可得到氧化纤维素。

C、PHA的固定

向5wt％的CDA磷酸缓冲液(PBS)中加入PHA，充分混合，其中PHA的浓度为20wt％，得到CDA-PHA溶液。

D、水凝胶的制备

将明胶溶解于磷酸缓冲液(PBS)中，形成15wt％的溶液，再将其与上述的CDA-PHA溶液按照体积比1∶1的比例混合，充分搅拌，发生席夫碱反应形成水凝胶。

经测定水凝胶的凝胶时间约为5min。

实施例6：

A、PDA修饰硫酸钙颗粒

将2g硫酸钙颗粒(CS)(粒径为2～6μm)分散在100ml浓度为2mg/ml的多巴胺(DA)的Tris-HCl溶液中。搅拌16h后离心，可得到PDA修饰的硫酸钙颗粒(PCS)。

B、氧化海藻酸钠(ADA)的制备

将5.0g海藻酸钠分散在25ml乙醇中形成悬浮液I，将3.25g高碘酸钠溶于25ml蒸馏中形成溶液II，随后将溶液II加入到悬浮液I中，避光搅拌反应6h后加入与2.5ml 乙二醇终止反应2h，将该反应混合液加入到剧烈搅拌的200ml无水乙醇中。抽滤后将产物用蒸馏水充分溶解后装入透析袋中透析3d；最终将白色产物放入表面皿中，冷冻干燥3d，即可得到氧化海藻酸钠。

C、PCS的固定

向15wt％的ADA磷酸缓冲液(PBS)中加入PCS，充分混合，其中PCS的浓度为10wt％，得到ADA-PCS溶液。

D、水凝胶的制备

将明胶溶解于磷酸缓冲液(PBS)中，形成15wt％的溶液，再将其与上述的ADA-PCS溶液按照体积比1∶1的比例混合，充分搅拌，发生席夫碱反应形成水凝胶。

经测定水凝胶的凝胶时间约为10min。

实施例7：

A、PDA修饰碳酸钙颗粒

将2g碳酸钙颗粒(CC)(粒径为1μm-5μm)分散在100ml浓度为3mg/ml的多巴胺(DA)的Tris-HCl溶液中。搅拌20h后离心，可得到PDA修饰的碳酸钙颗粒(PCC)。

B、氧化透明质酸(AHA)的制备

将5.0g透明质酸溶解于在500ml蒸馏水中形成溶液I，将1.38g高碘酸钠溶于10ml蒸馏中形成溶液II，随后将溶液II加入到悬浮液I中，避光搅拌反应6h后加入与2.5ml乙二醇终止反应1h，将该反应混合液加入到剧烈搅拌的200ml无水乙醇中。抽滤后将产物用蒸馏水充分溶解后装入透析袋中透析3d；最终将白色产物放入表面皿中，冷冻干燥3d，即可得到氧化纤透明质酸。

C、PCC的固定

向20wt％的AHA生理盐水中加入PCC，充分混合，其中PCC的浓度为10wt％，得到AHA-PCC溶液。

D、水凝胶的制备

将明胶溶解于生理盐水中，形成10wt％的溶液，再将其与上述的AHA-PCC溶液按照体积比1∶1的比例混合，充分搅拌，发生席夫碱反应形成水凝胶。

经测定水凝胶的凝胶时间约为10min。