本发明属于药物、微生物或组合物制剂领域，特别涉及一种多层微球的制备方法。
背景技术：
：微球是一种药物、微生物或组合物新剂型，是利用如淀粉、壳聚糖、聚乳酸、明胶等高分子聚合物材料作为载体，将固体或液体药物、微生物或组合物包裹固化而形成的微小球状实体的固体骨架物，其直径大小不一，一般在1-300μm，甚至更大，属于基质型骨架微粒。微球中药物、微生物或组合物的释放可以通过骨架溶蚀[如聚乳酸(polylacticacid,PLA)和乳酸/羟基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolicacid,PLGA)的降解]、表面溶蚀(如聚邻酯和聚酐类聚合物的降解)、整体崩解、水汽膨胀、解离扩散及解吸附等方法，使微球中包裹的药物、微生物或组合物释放速度变慢，成为长效制剂，可减少给药次数，消减药物、微生物或组合物峰谷现象。然而，微球在人体内释放时间不长，药物、微生物或组合物释放不稳定。微囊(Microcapsule)，是利用天然的或合成的高分子材料(统称为囊材)作为囊膜壁壳，将固态或液态药物、微生物或组合物包裹成为的药库型微型胶囊。通常粒径在1～250μm之间的称微囊，粒径在0.1～1μm之间的称亚微囊，粒径在10～100nm之间的称纳米囊。利用天然的或合成的高分子材料(统称为囊材)作为囊膜壁壳，将固态或液态药物、微生物或组合物包裹成为的药库型微型胶囊。通常粒径在1～250μm之间的称微囊，粒径在0.1～1μm之间的称亚微囊，粒径在10～100nm之间的称纳米囊。微囊具有多方面的优点，例如增加药物、微生物或组合物的稳定性、延长药物、微生物或组合物的作用时间、防止药物、微生物或组合物在胃内破坏或对胃的刺激作用、掩盖药物、微生物或组合物的不良臭味、防止药物、微生物或组合物的挥发损失、使某些液体药物、微生物或组合物固体化以便运输应用与贮存、减少复方制剂中的配伍禁忌、使制剂具有缓释性控释性、提高药物、微生物或组合物生物利用度。然而，现有方法制备的微囊仍然存在较多的缺陷，例如药物、微生物或组合物释放不稳定等。技术实现要素：技术问题:为了解决现有技术的缺陷，本发明提供了一种多层微球的制备方法。技术方案:本发明提供的一种多层微球的制备方法，包括以下步骤：(1)微球的制备：将药物、微生物或组合物加入海藻酸钠水溶液中混合，滴入氯化钙水溶液和色拉油的乳浊液中，沉淀过滤、水洗，即得药物或微生物微球；(2)壳聚糖层的制备：将步骤(1)制得的药物或微生物微球浸入壳聚糖溶液中，搅拌，再加入戊二醛水溶液于2-6℃下继续搅拌6-12h，沉淀过滤、水洗，得包覆壳聚糖层的药物或微生物微球；(3)海藻酸钠层的制备：将步骤(2)包覆壳聚糖层的药物或微生物微球浸入海藻酸钠溶液中，搅拌，再加入戊二醛水溶液于2-6℃下继续搅拌6-12h，沉淀过滤、水洗，得双层包覆的药物或微生物微球；(4)重复步骤(2)和/或(3)，即得多层微球。步骤(1)中，所述海藻酸钠水溶液的质量百分比浓度为0.1-0.5％，优选0.2％；药物、微生物或组合物和海藻酸钠水溶液的用量比为1g:(10-200)ml，优选1g:100ml；混合液中，氯化钙水溶液和色拉油的体积比为1:(5-15)，优选1:10；氯化钙水溶液的摩尔浓度为0.05-0.20mol/L，优选0.1mol/L。步骤(1)中，所述微生物为益生菌，优选地，所述微生物包括罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR02、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR08、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳双歧乳杆菌中的一种或几种。步骤(1)中，所述微生物组合物包括膳食纤维5-15份，菊粉2-10份，聚葡萄糖0.5-1.5份，低聚异麦芽糖1-5份，低聚果糖0.5-1.5份，副干酪乳杆菌30-40亿CFU，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR0230-40亿CFU，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR0818-26亿CFU，乳双歧乳杆菌14-22亿CFU。步骤(1)中，所述微生物组合物包括水苏糖2-8份，菊粉3-9份，蔓越莓提取物1-4份，低聚异麦芽糖2-6份，胶原蛋白0.5-2.5份，植物乳杆菌30-40亿CFU，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR0235-40亿CFU，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR0835-45亿CFU，嗜酸乳杆菌10-15亿CFU。步骤(2)中，所述壳聚糖溶液的质量百分比浓度为0.5-2％，优选1％；搅拌速度为100-300r/min，优选200r/min；所述戊二醛水溶液的质量百分比浓度为0.5-1.5％，优选1％。步骤(3)中，所述海藻酸钠溶液的质量百分比浓度为0.1-0.5％，优选0.2％；搅拌速度为100-300r/min，优选200r/min；所述戊二醛水溶液的质量百分比浓度为0.5-1.5％，优选1％。有益效果:本发明提供的多层微球制备工艺简单、成本低廉、重现性好、工艺可控、适合工业化生产，同时其药物、微生物或组合物释放非常稳定。附图说明图1为本小鼠体内实验结果图。具体实施方式本发明中：罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR02，其分类命名为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR02，在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学，邮政编码为430072，其保藏编号为：CCTCCNo.M2016546，保藏日期为2016年10月10日。菌株的分离1、菌种和培养基和培养条件(1)菌源来自中国某军区健康士兵粪便。(2)培养基平板培养基：1000mL蒸馏水，蛋白胨10g，葡萄糖20g，酵母粉9g，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，半胱氨酸0.5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温1ml，琼脂粉15-20g，pH5.5-6.5。2、菌株的分离和鉴定(1)菌株的分离预先经灭菌处理后的手套箱中取适量新鲜粪便置于盛装有无菌培养基的无菌试管中，充分震荡涡旋混匀；以上述充分震荡涡旋混匀的粪便溶液为原液，做十倍梯度稀释至合适梯度，取100μl均匀涂布于MRS+0.05％半胱氨酸固体平板培养基上，随后取出置于厌氧罐中，37℃厌氧培养过夜。次日可见平板上长有形态大小各异的菌落，结合罗伊氏乳杆菌典型菌落形态特征，挑取若干有代表性的菌落作二代划线纯化处理，平板厌氧活化1天，得培养物，随后做菌株鉴定。(2)菌株的鉴定革兰氏染色形态学鉴定：a、涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，在玻片上用记号笔做记号，便于观察，随后将玻片倒置，然后用移液器吸取10μl无菌生理盐水均匀涂布在记号处，继而用移液枪挑取纯培养物均匀溶于生理盐水中，涂布面不宜过大。b、干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。c、固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜(不超过60℃)，放置待冷后，进行染色。d、初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。e、水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。f、媒染：用100-1000ul移液枪吸取约300ul碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min。g、水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。h、脱色：斜置载玻片，滴加95％乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20-30S，随即水洗。i、复染：在涂片薄膜上滴加沙黄染液1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。j、水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。k、干燥、观察：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后滴一滴浸油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色，紫色的是革兰氏阳性菌，红色的是革兰氏阴性菌。结果显示：该菌株为革兰氏阳性菌。16SrRNA序列的测定：16SrRNA基因的PCR扩增使用的引物是一般细菌的引物——8F(5′-CACGGATCCAGAGTTTGAT(C/T)(A/C)TGGCTCAG-3′)和1510R(5′-GTGAAGCTTAGGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3′)产物委托有资质的第三方实验室进行sanger测序。应用BLAST算法在GenBank数据库中把序列和16SrRNA基因进行比较，应用MEGA4.0程序建立邻接树。BLAST分析(如SEQIDNo.1所示)表明TR02菌十分接近罗伊氏乳杆菌(99％亲缘性)。鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR08鼠李糖乳杆菌，其分类命名为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)TR08，在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学，邮政编码为430072，其保藏编号为：CCTCCNO.M2016548，保藏日期为2016年10月10日。菌株的分离1、菌种和培养基和培养条件(1)菌源来自中国某军区健康士兵粪便(2)培养基平板培养基：1000mL蒸馏水，蛋白胨10g，葡萄糖20g，酵母粉9g，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，半胱氨酸0.5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温1ml，琼脂粉15-20g，pH5.5-6.5。2、菌株的分离和鉴定(1)菌株的分离预先经灭菌处理后的手套箱中取适量新鲜粪便置于盛装有无菌培养基的无菌试管中，充分震荡涡旋混匀；以上述充分震荡涡旋混匀的粪便溶液为原液，做十倍梯度稀释至合适梯度，取100μl均匀涂布于MRS+0.05％半胱氨酸固体平板培养基上，随后取出置于厌氧罐中，37℃厌氧培养过夜。次日可见平板上长有形态大小各异的菌落，结合乳杆菌典型菌落形态特征，挑取若干有代表性的菌落作二代划线纯化处理，平板厌氧活化1天，得培养物，随后做菌株鉴定。(2)菌株的鉴定革兰氏染色形态学鉴定：a、涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，在玻片上用记号笔做记号，便于观察，随后将玻片倒置，然后用移液器吸取10μl无菌生理盐水均匀涂布在记号处，继而用移液枪挑取纯培养物均匀溶于生理盐水中，涂布面不宜过大。b、干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。c、固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜(不超过60℃)，放置待冷后，进行染色。d、初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。e、水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。f、媒染：用100-1000ul移液枪吸取约300ul碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min。g、水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。h、脱色：斜置载玻片，滴加95％乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20-30S，随即水洗。i、复染：在涂片薄膜上滴加沙黄染液1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。j、水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。k、干燥、观察：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后滴一滴浸油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色，紫色的是革兰氏阳性菌，红色的是革兰氏阴性菌。结果显示：该菌株为革兰氏阳性菌。16SrRNA序列的测定：16SrRNA基因的PCR扩增使用的引物是一般细菌的引物——8F(5′-CACGGATCCAGAGTTTGAT(C/T)(A/C)TGGCTCAG-3′)和1510R(5′-GTGAAGCTTAGGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3′)产物委托有资质的第三方实验室进行sanger测序。应用BLAST算法在GenBank数据库中把序列和16SrRNA基因进行比较，应用MEGA4.0程序建立邻接树。BLAST分析(如SEQIDNo.2所示)表明TR02菌十分接近鼠李糖乳杆菌(99％亲缘性)。微生物组合物1：包括膳食纤维5份，菊粉10份，聚葡萄糖0.5份，低聚异麦芽糖1份，低聚果糖1.5份，副干酪乳杆菌30亿CFU，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR0240亿CFU，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR0826亿CFU，乳双歧乳杆菌14亿CFU。其制备方法，包括以下步骤：分别称取膳食纤维、菊粉、聚葡萄糖、低聚异麦芽糖、低聚果糖，混匀；再加入副干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR02、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR08、乳双歧乳杆菌，混匀，即得。微生物组合物2：包括膳食纤维15份，菊粉2份，聚葡萄糖1.5份，低聚异麦芽糖5份，低聚果糖0.5份，副干酪乳杆菌40亿CFU，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR0230亿CFU，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR0818亿CFU，乳双歧乳杆菌22亿CFU。微生物组合物3：包括膳食纤维8份，菊粉5份，聚葡萄糖1.2份，低聚异麦芽糖4份，低聚果糖0.8份，副干酪乳杆菌33亿CFU，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR0237亿CFU，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR0820亿CFU，乳双歧乳杆菌20亿CFU。微生物组合物4：包括膳食纤维10份，菊粉7份，聚葡萄糖0.8份，低聚异麦芽糖2份，低聚果糖1.2份，副干酪乳杆菌37亿CFU，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR0233亿CFU，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR0824亿CFU，乳双歧乳杆菌16亿CFU。微生物组合物5：包括膳食纤维9份，菊粉6份，聚葡萄糖1份，低聚异麦芽糖3份，低聚果糖1份，副干酪乳杆菌35亿CFU，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR0235亿CFU，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR0822亿CFU，乳双歧乳杆菌18亿CFU。微生物组合物6：包括水苏糖2份，菊粉9份，蔓越莓提取物1份，低聚异麦芽糖2份，胶原蛋白0.5份，植物乳杆菌40亿CFU，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR0235亿CFU，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR0835亿CFU，嗜酸乳杆菌10亿CFU。其制备方法，包括以下步骤：分别称取水苏糖、菊粉、蔓越莓提取物、低聚异麦芽糖、胶原蛋白，混匀；再加入植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR02、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR08、嗜酸乳杆菌，混匀，即得。微生物组合物7：包括水苏糖8份，菊粉3份，蔓越莓提取物4份，低聚异麦芽糖6份，胶原蛋白2.5份，植物乳杆菌30亿CFU，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR0240亿CFU，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR0845亿CFU，嗜酸乳杆菌15亿CFU。微生物组合物8：包括水苏糖4份，菊粉7份，蔓越莓提取物3份，低聚异麦芽糖3份，胶原蛋白2份，植物乳杆菌33亿CFU，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR0239亿CFU，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR0839亿CFU，嗜酸乳杆菌11亿CFU。微生物组合物9：包括水苏糖6份，菊粉5份，蔓越莓提取物2份，低聚异麦芽糖5份，胶原蛋白1份，植物乳杆菌37亿CFU，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR0237亿CFU，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR0841亿CFU，嗜酸乳杆菌13亿CFU。微生物组合物10：包括水苏糖5份，菊粉6份，蔓越莓提取物2.5份，低聚异麦芽糖4份，胶原蛋白1.5份，植物乳杆菌35亿CFU，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR0238亿CFU，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR0840亿CFU，嗜酸乳杆菌12亿CFU。下面对本发明作出进一步说明。分别利用熊去氧胆酸、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR02、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR08、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳双歧乳杆菌及微生物组合物1至10制备本发明多层微球，见实施例1至17。实施例1多层微球的制备方法，包括以下步骤：(1)微球的制备：将罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR02加入海藻酸钠水溶液中混合，滴入氯化钙水溶液和色拉油的乳浊液中，沉淀过滤、水洗，即得罗伊氏乳杆菌微球；其中，所述海藻酸钠水溶液的质量百分比浓度为0.2％；罗伊氏乳杆菌和海藻酸钠水溶液的用量比为1g:100ml；混合液中，氯化钙水溶液和色拉油的体积比为1:10；氯化钙水溶液的摩尔浓度为0.1mol/L。(2)壳聚糖层的制备：将步骤(1)制得的罗伊氏乳杆菌微球浸入壳聚糖溶液中，搅拌，再加入戊二醛水溶液于4℃下继续搅拌8h，沉淀过滤、水洗，得包覆壳聚糖层的罗伊氏乳杆菌微球；其中，所述壳聚糖溶液的质量百分比浓度为1％；搅拌速度为200r/min；所述戊二醛水溶液的质量百分比浓度为1％；(3)海藻酸钠层的制备：将步骤(2)包覆壳聚糖层的罗伊氏乳杆菌微球浸入海藻酸钠溶液中，搅拌，再加入戊二醛水溶液于4℃下继续搅拌8h，沉淀过滤、水洗，得双层包覆的罗伊氏乳杆菌微球；其中，所述海藻酸钠溶液的质量百分比浓度为0.2％；搅拌速度为200r/min；所述戊二醛水溶液的质量百分比浓度为1％；(4)重复步骤(2)和/或(3)，即得制得多层微球，本实施例省略步骤(4)。实施例2多层微球的制备方法，包括以下步骤：(1)微球的制备：将鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR08加入海藻酸钠水溶液中混合，滴入氯化钙水溶液和色拉油的乳浊液中，沉淀过滤、水洗，即得鼠李糖乳杆菌微球；其中，所述海藻酸钠水溶液的质量百分比浓度为0.5％；鼠李糖乳杆菌和海藻酸钠水溶液的用量比为1g:200ml；混合液中，氯化钙水溶液和色拉油的体积比为1:15；氯化钙水溶液的摩尔浓度为0.20mol/L。(2)壳聚糖层的制备：将步骤(1)制得的鼠李糖乳杆菌微球浸入壳聚糖溶液中，搅拌，再加入戊二醛水溶液于2℃下继续搅拌12h，沉淀过滤、水洗，得包覆壳聚糖层的鼠李糖乳杆菌微球；其中，所述壳聚糖溶液的质量百分比浓度为2％；搅拌速度为300r/min；所述戊二醛水溶液的质量百分比浓度为1.5％；(3)海藻酸钠层的制备：将步骤(2)包覆壳聚糖层的鼠李糖乳杆菌微球浸入海藻酸钠溶液中，搅拌，再加入戊二醛水溶液于2℃下继续搅拌12h，沉淀过滤、水洗，得双层包覆的鼠李糖乳杆菌微球；其中，所述海藻酸钠溶液的质量百分比浓度为0.5％；搅拌速度为300r/min；所述戊二醛水溶液的质量百分比浓度为1.5％；(4)重复步骤(2)和/或(3)，即得制得多层微球，本实施例省略步骤(4)。实施例3多层微球的制备方法，包括以下步骤：(1)微球的制备：将熊去氧胆酸加入海藻酸钠水溶液中混合，滴入氯化钙水溶液和色拉油的乳浊液中，沉淀过滤、水洗，即得熊去氧胆酸微球；其中，所述海藻酸钠水溶液的质量百分比浓度为0.1％；熊去氧胆酸和海藻酸钠水溶液的用量比为1g:10ml；混合液中，氯化钙水溶液和色拉油的体积比为1:5；氯化钙水溶液的摩尔浓度为0.05mol/L。(2)壳聚糖层的制备：将步骤(1)制得的熊去氧胆酸微球浸入壳聚糖溶液中，搅拌，再加入戊二醛水溶液于6℃下继续搅拌6h，沉淀过滤、水洗，得包覆壳聚糖层的熊去氧胆酸微球；其中，所述壳聚糖溶液的质量百分比浓度为0.5％；搅拌速度为100r/min；所述戊二醛水溶液的质量百分比浓度为0.5％；(3)海藻酸钠层的制备：将步骤(2)包覆壳聚糖层的熊去氧胆酸微球浸入海藻酸钠溶液中，搅拌，再加入戊二醛水溶液于6℃下继续搅拌6h，沉淀过滤、水洗，得双层包覆的熊去氧胆酸微球；其中，所述海藻酸钠溶液的质量百分比浓度为0.5％；搅拌速度为100r/min；所述戊二醛水溶液的质量百分比浓度为0.5％；(4)重复步骤(2)和/或(3)，即得制得多层微球，本实施例省略步骤(4)。实施例4-17分别利用植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳双歧乳杆菌及微生物组合物1至10制备本发明多层微球，方法同实施例3，制得实施例4至17的多层微球。实施例1至17的微球在模拟肠液中的释放时间，见表1。表1实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5实施例6释放时间10h9h11h10h10h9h实施例7实施例8实施例9实施例10实施例11实施例12释放时间10h9h10h9h11h11h实施例13实施例14实施例15实施例16实施例17对比例释放时间11h9h10h9h10h6h实施例1的微球进行6个月稳定性实验结果，见表2。表2实验分组活菌数起始值4.0E+11CFU/g实施例1的多层微球1.2E+11CFU/g实施例1步骤1制得的罗伊氏乳杆菌微球7.4E+10CFU/g罗伊氏乳杆菌2.5E+10CFU/g结果显示：菌株经多层包埋后，为期六个月的稳定性试验表明，活菌数较之于初始值虽有下降，但仍保持在千亿级水平；而单层包埋(实施例1步骤1制得的罗伊氏乳杆菌微球)与未包埋(罗伊氏乳杆菌)条件下，活菌数次方数出现了下降，但前者的活菌数大于后者，证实了包埋后的菌株稳定性高于未包埋者。实施例1制得的微球在DDS诱导的实验性肠炎小鼠体内治疗效果。方法：1.动物：雄性BALB/C小鼠，5-6周龄，体重18-22g。2.实验性肠炎模型建立：将DSS(硫酸葡聚糖钠)加入蒸馏水中配制成5％的DDS溶液，给小鼠自由饮用7天。3.分组及给药方法：正常组(Normal)：给予正常饮食；肠炎小组模型组(DDS)：给予5％的DSS溶液自由饮用7天；Lactobaillus包埋组：即【罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR02】包埋释放后治疗组：给予5％的DSS溶液自由饮用7天，从第2周开始给予实施例1的微球腹腔注射3次/周连续2周；Lactobaillus未包埋组：即【罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR02】治疗组：给予5％的DSS溶液自由饮用7天，从第2周开始给予罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR02腹腔注射3次/周连续2周。结果显示：见图1，硫酸葡聚糖(DSS)诱导肠炎小鼠模型较之于正常组(Normal)在表型上表现为小鼠体重显著下降；而经益生菌治疗效果表明，可一定程度上缓解肠炎症状，且多层包埋(Lactobaillus包埋组)后治疗效果优于未包埋(Lactobaillus未包埋组)。当前第1页1 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