一种生物防粘连材料、制备方法及其应用与流程

本发明涉及医疗器械生物材料领域，具体为一种用于防止创面发生粘连的防粘连材料、制备方法及其应用。

背景技术：

粘连是结缔组织纤维带与相邻的组织或器官结合在一起而形成的异常结构。术后粘连发生率高达90％以上，胸腔、腹腔和盆腔手术都会导致不同程度的粘连。粘连导致的临床严重并发症包括肠梗阻、不育症、慢性盆腔疼痛等，增加二次手术的几率。而且，即使进行二次手术，仍存在同样的术后再次粘连和再次出现并发症的潜在性。目前，国内外有两种途径来防止术后组织粘连，一种是依据生理/药理机制的治疗方法，主要是药物减轻炎性反应和溶解纤维蛋白，另一种是医疗器械类的物理阻隔防粘连膜。防粘连膜在创面与周边组织之间形成临时的物理隔离屏障，在组织愈合过程中起到防粘连作用，并且可以在体内自行降解或被吸收。防粘连膜通常采用由透明质酸、纤维素衍生物、壳聚糖、聚乳酸等材质制造等高分子材料制造。然而部分高分子材料存在部分问题，例如聚乳酸的降解产物为酸性，局部蓄积容易产生轻微无菌性炎症；壳聚糖凝胶或溶液易流动，不易在局部形成较高浓度，而海绵状或薄膜状壳聚糖的机械强度以及韧性不够。

有研究发现经免疫原去除处理的小肠黏膜下层组织(sis)是一种无细胞、无免疫原性、能生物降解且具有纤维弹性良好的材料。发明专利(cn103272278a)曾公开了一种以动物源性免疫原去除小肠黏膜下层组织制备植入性医用生物材料的方法，介绍了通过动物组织材料的前置处理分离、初洗、病毒灭活、免疫原去除、氯化钠处理、成型、包装灭菌获得具有不同的尺寸、厚度和力学强度的医用产品。免疫原去除基质植入体内后可诱导患者自身细胞长入，为细胞重建受损组织提供模板同时提供临时物理隔离屏障，修复为血管化、功能化的组织或器官，并且免疫原去除基质会逐步降解，与重建组织再生过程基本同步，而且不会与其它组织发生粘连。

技术实现要素：

本发明提供一种可用于防止组织创面恢复过程中与其它组织发生粘连的生物防粘连材料。该防粘连材料具有良好的生物相容性、适宜的组织粘附性以及一定的机械强度和柔韧性。此外，该防粘连材料具有合适的体内存留时间，可有效防止粘连形成又不影响伤口正常愈合。

本发明采用的技术方案为：一种生物防粘连材料，其特征在于：该生物防粘连材料以动物的小肠粘膜下层为原料，然后去除免疫原性、并保留完整的细胞外基质成分制成；该生物防粘连材料包括第一表面、第二表面和位于中间的可降解吸收结构，所述第一表面为光滑面，所述第二表面粗糙面，中间为渐变连接的可降解吸收结构。

本发明上述生物防粘连材料，包括多层小肠粘膜下层(sis)组织材料，其中根据烘干和冷冻干燥等处理步骤使得小肠粘膜下层组织材料的外露的第一表面是相对光滑的表面，小肠粘膜下层组织材料的外露的第二表面是相对粗糙的表面；具体地：所述第一表面为经真空干燥组织材料所形成的表面；所述第二表面为经冷冻干燥组织材料所形成的表面。

本发明所述动物为哺乳动物，优选为猪或牛。

本发明所述去除免疫原性是指细胞残留量小于10个、dna残留量小于10ng/mg、半乳糖苷酶(α-gal)清除率为99％以上。

本发明所述保留完整的细胞外基质成分是指保留包含胶原纤维、多糖物质、活性因子及生长因子成分。

本发明所述的胶原纤维包括i型胶原蛋白及iii型、iv型和vi型胶原蛋白。

本发明所多糖物质包含硫酸软骨素和透明质酸。

本发明所述活性因子包含纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、整合素及其配体。

本发明所述生长因子包括碱性生长因子(bfgf)和血管内皮生长因子(vegf)。

本发明所述补片为片状结构，包括2-8层免疫原去除基质材料组成，所述片状结构长1-10cm，宽1-7cm，厚度0.1-1mm。

本发明所述的光滑面为致密少孔、具有光泽，所述的粗糙面为疏松多孔、呈亚光状。

本发明所述的生物防粘连材料在体内的降解时间1-3个月。

本发明所述的生物防粘连材料的拉伸断裂强度大于40n/cm，缝合保持力大于8n。

本发明还提供一种生物防粘连材料的制备方法，其特征在于：包括原料的初处理、病毒灭活、免疫原去除、真空干燥和冷冻干燥。

具体的，所述制备方法步骤包括：

(1)组织前置处理：取小肠粘膜下层组织材料(sis)，清洗并将水滤干；

(2)病毒灭活：采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡小肠粘膜下层组织材料进行病毒灭活；

(3)清洗：在超声环境下，分别用pbs溶液处理和水清洗；

(4)免疫原去除：将步骤(3)清洗后得到的小肠粘膜下层组织材料进行免疫原去除，包括第一步采用naoh溶液，超声振荡处理，处理后用盐酸清洗换液；第二步采用含有胰蛋白酶和edta的pbs溶液，多频超声振荡；第三步采用nacl溶液，超声振荡；

(5)清洗：在超声环境下，分别用pbs溶液和水清洗；

(6)真空干燥：将由步骤(5)清洗的免疫原去除材料固定于模具上并一同干燥；

(7)冷冻干燥：将由步骤(5)经清洗的免疫原去除组织材料覆盖于经步骤(6)得到的真空干燥后的组织材料上，一同进行冷冻干燥。

发明步骤(2)采用的过氧乙酸-乙醇溶液中过氧乙酸的体积百分比浓度为0.1％-5％、乙醇的体积百分比浓度为5％-40％(用水配置成溶液)，过氧乙酸-乙醇溶液与小肠粘膜下层组织材料的体积比为(3-20)︰1，灭活时间2-4小时，温度范围为10-40℃。

发明步骤(3)清洗具体为：在超声波清洗机中用pbs溶液清洗，然后用水清洗至检测电导率为10μs/cm以下终止，得到小肠粘膜下层基质材料。其中pbs溶液ph值范围为6-8，所使用的水为经过纯化处理的纯化水。

本发明所述步骤(4)使用的免疫原去除液与小肠粘膜下层组织材料混合体积比为(20-40)：1。

本发明步骤(4)第一步采用浓度为0.1-0.5mol/l的naoh溶液，超声振荡处理1-30min，温度20-25℃，溶液与小肠粘膜下层组织材料的体积比为20-40：1，超声波功率在3000w以上；处理后用浓度为0.1-0.5mol/l的盐酸溶液清洗换液，并调整ph至中性；第二步采用含有质量百分比浓度为0.01-0.2％的胰蛋白酶和浓度为0.1-1mmol/l的edta的ph值为7的pbs溶液，多频超声振荡10-80min，多频超声至少包括两个超声频率，低频频率范围为20-40khz，高频频率为60-90khz，其中低频处理5-40min，高频处理5-40min，温度30℃，溶液与小肠粘膜下层组织材料的体积比为(30-40)：1，超声波功率在5000w以上；第三步采用采用浓度为0.8-1.5mol/l的nacl溶液，超声振荡处理10min，温度20℃，溶液与小肠粘膜下层组织材料的体积比为20-40：1，超声波功率在3000w以上。

所述步骤(5)中清洗过程为：在超声波清洗机中用pbs溶液清洗，然后用降温的注射用水清洗至检测清洗前后的注射用水电导率差为1μs/cm以下终止，得到小肠粘膜下层基质材料。其中pbs溶液ph值范围为6-8。注射用水温度优选10-40℃。

本发明步骤(6)所述的干燥是将免疫原去除组织材料置于真空环境，温度25-40℃后，时间为8-16h，制备光滑面。

本发明步骤(7)所述的冷冻干燥为：预冻至-45℃，保温1-2小时，然后调节温度至-15℃，保温5-7小时，再调节温度至0℃，保温2小时，最后调节温度至25℃，保温4小时，形成一面光滑一面粗糙中间为渐变连接结构的可降解吸收的防粘连材料。渐变连接结构的形成是由于在冻干过程中，将步骤(5)清洗的、含有水分的免疫原去除的组织材料覆盖于经步骤(6)得到的干燥后的组织材料时，水分向真空干燥的组织材料有所渗透，形成从未干燥组织材料到已经干燥组织材料的方向的含水量的变化，经冻干后，形成渐变连接结构。

本发明防粘连材料的粗糙面有利于引导创面组织细胞的生长，从而修复创面；而光滑面则有利于阻止这些细胞粘连其它组织，从而有效地防止粘连。

上述的生物防粘连材料的制备方法，还可包括以下步骤：(8)灭菌解析：采用环氧乙烷进行灭菌，灭菌条件为：温度40℃，保温时间4小时，湿度60％，环氧乙烷浓度为600mg/l，灭菌时间6小时；解析过程在通风的解析室中进行，温度控制在20℃之间，时间14天。

与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：

(1)采用胰蛋白酶和edta，使细胞与细胞外基质之间的连接被破坏；采用低频超声对细胞进行破碎，同时使用高频超声作用于破碎的细胞及细胞外基质，进一步使细胞脱离细胞外基质，达到脱细胞目的。采用上述方式，对整个细胞脱离基质过程中的各个步骤进行强化，使细胞被从基质上完全脱离。到达最佳的免疫原去除效果；

(2)多程免疫原去除工艺：一程低浓度碱性溶液除脂并破坏细胞膜，二程采用含有edta和酶的pbs溶液经超声处理进一步洗脱细胞，三程nacl溶液进一步去除残留dna，同时控制试剂浓度保护细胞外基质结构；

(3)成型工艺技术：通过真空干燥、冷冻干燥两步工艺实现补片一面光滑、一面粗糙的双面结构，光滑面有利于引导上皮细胞爬移修复，粗糙面有利于引导平滑肌细胞的组织修复；

(4)力学强化工艺：通过真空干燥成型技术增强防粘连材料的力学强底、力学稳定性，从而提高材料在体内环境中的抗酶解能力。

附图说明

图1所示的是本发明生物防粘连材料的结构图；

图2所示的是本发明生物防粘连材料的微观结构sem照片。

图3所示的是本发明生物防粘连材料的he染色图

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。

所述的猪小肠粘膜下层组织材料(sis)或牛小肠粘膜下层组织材料均适用于本发明下述实施例。

实施例1：

本实施例动物源植入性生物防粘连材料的制备方法，包括以下操作步骤：

(1)组织前置处理：

取小肠粘膜下层组织材料分割成规定尺寸宽10cm，长15cm，剔除淋巴组织，用自来水冲洗3次，再用纯化水冲洗至表面无污渍，然后将清洗后的小肠粘膜下层组织材料置于筛网等滤水装置上，静置五分钟以上，将水滤干。

(2)病毒灭活：

采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡小肠粘膜下层组织材料进行病毒灭活，该过程可在不锈钢桶中进行。过氧乙酸-乙醇溶液中过氧乙酸的浓度(体积百分比)为1％、乙醇的浓度(体积百分比)为24％，过氧乙酸-乙醇溶液与小肠粘膜下层组织材料的比例(体积比)为8：1，灭活时间2h，温度范围为20℃。

(3)清洗：

采用清洗液清洗小肠粘膜下层组织材料，清洗液为ph值为7.0的pbs溶液，pbs溶液温度为20℃，pbs溶液与小肠粘膜下层组织材料的比例(体积比)为30︰1，优选清洗3次，每次20分钟；然后采用20℃的纯化水清洗，纯化水与小肠粘膜下层组织材料比例为30︰1，至检测电导率为10μs/cm以下终止；清洗过程在超声波清洗机中进行，频率优选40khz，功率优选3000w以上。

(4)免疫原去除：

免疫原去除步骤包括第一步采用浓度为0.3mol/l的naoh溶液，超声振荡处理10min，温度20℃，溶液与小肠粘膜下层组织材料比例(体积比)为30：1；处理后用浓度为0.3mol/l的盐酸溶液清洗换液，并调整ph至中性，超声功率3000w；第二步采用含有质量百分比浓度为0.02％的胰蛋白酶和浓度为0.5mmol/l的edta的ph值为7-8的pbs溶液，多频超声振荡10min，多频超声至少包括两个超声频率，低频频率范围为30khz，高频频率为80khz，其中低频处理5min，高频处理5min，温度30℃，溶液与小肠粘膜下层组织材料比例(体积比)为(30-40)：1，超声功率5000w；第三步采用浓度为1mol/l的nacl溶液，超声振荡处理10min，温度20℃，溶液与小肠粘膜下层组织材料比例(体积比)为40：1，超声功率在3000w。

(5)清洗；

采用清洗液进行清洗，清洗过程在超声波清洗机中进行，清洗液为ph7的pbs溶液，pbs溶液温度为20℃，pbs溶液与小肠粘膜下层组织材料的比例(体积比)为30︰1，优选清洗3次，每次20分钟；然后采用20℃的注射用水清洗，注射用水与小肠粘膜下层组织材料比例(体积比)为30︰1，检测清洗注射用水与未清洗注射用水电导率之差小于1μs/cm终止，频率优选40khz，功率优选3000w以上。

(6)真空干燥：

将真空干燥箱预热至40℃后，将由步骤(5)清洗的一层或多层免疫原去除材料固定于模具上并一同放于真空干燥箱中进行干燥，时间为16小时。经干燥的组织材料具有光滑表面。所述模具包括带针底板、盖板与压块，其结构可以参考发明专利zl201310203588.6和zl201310203602.2。

(7)冷冻干燥：

将由步骤(5)清洗的一层或多层免疫原去除材料铺设于由步骤(6)得到的干燥后的组织材料，一同放置于真空冷冻干燥机中，关闭冻干室的门，打开循环泵约1min，开启压缩机对冻干箱致冷，将产品预冻至-45℃，保温2小时，开启真空泵，调节产品温度约-15℃升华，6小时后，调节产品温度0℃，保温2小时，调节产品温度25℃，保温4小时，真空冷冻干燥完成。形成的材料与光滑表面相对的一侧具有粗糙表面。

该制备方法还可包括以下步骤：

(8)灭菌解析：

采用环氧乙烷进行灭菌，灭菌条件为：温度40℃，保温时间4小时，湿度60％，环氧乙烷浓度为600mg/l，灭菌时间6小时；解析过程在通风的解析室中进行，温度控制在20℃之间，时间14天。

虽然本发明所制得的生物防粘连材料的真空干燥表面也经历了冻干处理，但是由于真空干燥表面几乎没有水分，因而冻干处理对该表面的形貌的影响可以忽略。真空干燥表面是光滑而有光泽的，即使再经过冻干仍旧是光滑而有光泽的。

本发明所得产品结构如图1-3所示。

实施例2：

对实施例1中样品进行性能检测，检测项目与结果如下：

1)dna残留：依据生物制剂残留dna检测方法《中国药典》2015年版第四部，采用荧光染色法检测实施例1所提供的样品dna残留量，结果：实施例1所提供的样品的dna残留量小于2.89±0.36ng/mg。

2)半乳糖苷酶(α-gal)清除率：取动物源性生物材料gal阳性参考品，gal抗原阴性参考品各2mg，加裂解液1ml，裂解30-90min，配制成20、10、5、2.5、1.25、0.625μg的gal标准曲线样品，测试免疫原去除前后的测试品各取50mg，加裂解液2ml，裂解30-90min；取裂解液与m86抗体反应后的上清液，加入96孔板，加二抗，加显色剂，采用elisa方法450nm检测吸光度值，按标准曲线计算出样品的gal值，免疫原去除处理前材料的gal值为20.89±2.22×10¹⁴/mg，实施例1中样品的gal值为0.12±0.01×10¹⁴/mg，半乳糖苷酶(α-gal)清除率在99.43％以上。

3)病毒检测：选择伪狂犬病毒为指示病毒，采用实时定量pcr法检测病毒的dna拷贝数，检测3批样品。结果：病毒dna拷贝数为0。

4)细菌内毒：按照gb/t14233.2-2005《医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学试验方法》进行检测，共3批样品，结果：细菌内毒小于20eu/包装。

5)胶原蛋白亚型鉴别：采用免疫组化染色法检测i、iii、iv型和vi型胶原蛋白，3μm厚连续切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水。将切片移入电饭煲水浴中(内含0.01mol/l，ph6.0的枸橼酸三钠缓冲液)，温度保持在95-100℃，煮20min，进行抗原修复，取出后在室温下自然冷却。磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤，5min×3次。二步法免疫组化：分别滴加i、iii、iv型和vi型胶原蛋白单克隆抗体一抗，浓度1：100，4℃冰箱过夜室温下孵育60min，pbs洗涤3次。滴加envision反应液，室温下孵育30min。pbs洗涤3次。0.05％的3，3一二氨基联苯胺+0.03％的h2o2显色5-10min。流水洗，苏木精衬染。递增梯度乙醇脱水，二甲苯透明，常规树脂封固。结果表明，显微镜下观察四种染色标本皆可见棕黄染色，为阳性，表明样品中可检测到i、iii、iv型和vi型胶原蛋白。

6)多糖物质含量检测：取10个样品，取样，浸提，用biocolor硫酸软骨素检测试剂盒测试硫酸软骨素含量，样品中硫酸软骨素含量平均值为5236±185μg/g；用透明质酸检测试剂盒测试透明质酸(ha)含量，结果显示，样品的透明质酸(ha)保留量平均值为296±23μg/g。

7)活性因子种类鉴别：将样品浸泡pbs24h后，固定于4％多聚甲醛5-10min，用0.1mol/lpbs洗3次，每次5min，然后用玻璃细管转至涂有多聚赖氨酸的玻片上,进行免疫组织化学染色。ln抗体、fn抗体和整合素效价均为1∶100，0.5％胰酶消化3-5min暴露抗原，0.1％tritonx100作用10min增加抗体的穿透性。免疫组织化学染色显阳性，表面样品中包含纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、整合素及其配体的等物质。

8)生长因子残留量：对实施例1中样品采用elisa法检测样品中碱性生长因子(bfgf)和血管内皮生长因子(vegf)含量，并对免疫原去除前动物组织作为对照。结果发现碱性生长因子(bfgf)免疫原去除前后含量分别为2137±187ng/l、1055±114ng/l，保留生长因子45％以上；血管内皮生长因子(vegf)含量免疫原去除前后含量分别为748±61ng/l、315±21ng/l，保留生长因子40％以上。

9)缝合抗拉强度：按照实施例1制备样品，用3-0非吸收缝合线在防粘连材料一端边缘2mm处，将缝合线与防粘连材料的另一端固定在拉力仪上，以20mm/min的速度进行拉伸，直到缝合点被撕裂，记录最大力值，结果显示，最大值可达12n。

10)抗张强度：按照实施例1制备样品，将样品裁剪成2×5cm尺寸，在相对湿度为40-60％，温度为22±2℃的条件下放置2h后立即进行试验。将试样两端固定在拉伸试验机的夹头上，以100mm/min的速度依次向外拉伸直到试样断裂，纵向试样和横向试样分别进行试验。最后的测定结果显示纵向抗张强度可达48n/cm。

11)环氧乙烷残留量：按gb/t14233.1-2008《医用输液、输血、注射器具检验方法第1部分：化学分析法》中9的规定的方法试验，结果：产品环氧乙烷残留量不超过10μg/包装。

12)重金属检查：铅、铬按gb/t14233.1-2008中5.9.1《医用输液、输血、注射器具检验方法第1部分：化学分析法》规定的方法试验，汞、砷按gb/t14233.1-2008中5.9.3《医用输液、输血、注射器具检验方法第1部分：化学分析法》规定的方法试验，产品检验液中铅、铬、汞、砷总重金属含量少于1μg/g。

实施例3：

对实施例1中样品进行生物相容性实验，检测项目包括：热原、细胞毒性、迟发型超敏反应、皮内反应、急性全身毒性、ames试验、小鼠淋巴瘤细胞突变试验、染色体畸变、植入、亚慢性毒性。

1)热原

按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水。按gb/t14233.2-2005规定的方法进行，产品无热原反应。

2)细胞毒性

按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，24±2hr制备试验液，浸提介质：含血清的mem培养基。取试验液按照gb/t16886.5-2003中规定的试验方法进行试验，结果产品的细胞毒性反应不大于1级。

3)迟发型超敏反应

按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和棉籽油。按照gb/t16886.10-2005第10部分:刺激与迟发型超敏反应试验方法规定进行试验，结果产品无迟发型超敏反应。

4)皮内反应

按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和棉籽油。按照gb/t16886.10-2005第10部分:刺激与迟发型超敏反应试验试验方法规定进行试验，结果：试验样品与溶剂对照平均记分之差小于1.0。

5)急性全身毒性

按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和棉籽油。取试验液按照gb/t16886.11-2011规定的试验方法进行试验，结果：产品无急性全身毒性反应。

6)ames试验

按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和dmso。按gb/t16886.3-2008规定的方法进行，结果：产品的ames试验为阴性。

7)小鼠淋巴瘤细胞突变试验

按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和dmso。按gb/t16886.3-2008规定的方法进行，结果：产品的小鼠淋巴瘤细胞突变试验为阴性结果。

8)染色体畸变试验

按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和dmso，按gb/t16886.3-2008规定的方法进行，结果：产品的染色体畸变试验为阴性。

9)亚慢性毒性

按gb/t16886.11规定的方法进行，结果：无亚慢性毒性反应。

综上，本发明一种生物防粘连材料：

(1)采用多种工艺复合，稀碱、酶、盐溶液分步进行，高效脱除细胞，高效去除残留dna与免疫原性，dna残留能够达到10ng/mg以下，半乳糖苷酶去除率较高，能够达到99％以上；

(2)减少对基质结构的破坏，保留基质中的活性生长因子；

(3)通过真空干燥、冷冻干燥两步工艺实现补片形成一面光滑，一面粗糙的双面结构，防粘连膜的力学强底、力学稳定性，从而提高材料在体内环境中的抗酶解能力。

(4)灭菌工艺：通过灭菌过程调整产品体内降解过程，使免疫原去除基质补片逐步降解，与重建组织再生过程基本同步，最终免疫原去除基质补片完全被宿主组织代替；

(5)双面结构一方面有利于组织细胞生长，另一方面防止不同组织发生粘连，提供有效防粘连效果。

本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。