一种骨髓间充质干细胞注射液及其制备方法和应用与流程

本发明涉及干细胞
技术领域：
，特别涉及一种骨髓间充质干细胞注射液及其制备方法和应用。
背景技术：
：我国乙型肝炎病毒(HBV)感染人数达1.2亿，慢性肝炎患者高达3000多万，其中乙型病毒性肝炎(乙肝)是导致肝硬化、原发性肝细胞癌(肝癌)的主要原因，每年因肝硬化、肝癌、肝功能衰竭等死亡的人数高达30～50万，严重威胁着人们的健康。对于终末期的肝炎、肝硬化，以及遗传性、代谢性肝病，原位肝移植是目前唯一确定有效的治疗手段，但肝移植术后伴有各种并发症，主要有感染并发症、排斥反应、胆道并发症、原发病复发及免疫抑制剂相关疾病等，严重影响着患者的生活质量及移植肝的长期存活率。据国内外研究报道，大约有30％～70％的肝移植受者在移植术后1年内发生过一次急性排斥反应，是导致移植物丢失的最重要的原因之一。移植物抗宿主反应(GVHD，graft-versus-hostdisease)是一种特异的免疫现象，是由于移植物组织中的免疫活性细胞与免疫受抑制的、组织不相融性抗原受者的组织之间的反应。肝移植术后发生GVHD很罕见，其发生率为0.1～0.2％，显著低于骨髓移植后GVHD的发生率，但病死率极高，超过75％。目前除再次肝移植外，常规治疗方法往往疗效欠佳甚至无效，再次移植肝给患者带来了较大的经济负担和精神肉体上的痛苦。间充质干细胞(MSCs)是多能干细胞，具有“横向分化”或“跨系分化”的能力，不仅支持造血干细胞的生长，还可以在不同诱导条件下，在体外分化为多种组织细胞。MSCs具有广阔的临床应用前景，是细胞替代治疗和组织工程的首选种子细胞。随着干细胞生物学研究不断的发展，MSC具有低免疫原性和很强的免疫调节作用(能逃避免疫识别、抑制免疫应答)、炎症趋化、组织修复等生物特性，国内外研究发现，输注MSC可以提高移植术后的免疫耐受力，延长移植物的存活时间，在治疗移植物抗宿主病上也得到有效应用，尤其在肾移植、骨髓移植等免疫排斥反应治疗中已取得较好效果，但在治疗肝移植术后急性排斥反应中的应用还较少。间充质干细胞具备干细胞的特性及多向分化潜能，可向炎症或损伤部位定向迁移并抗炎或修复损伤组织，还因其低免疫原性、较强的免疫调节及抗微生物作用而成为治疗肝移植术后急性排斥反应的重要研究方向。因此，提供一种新型的能够有效治疗GVHD的干细胞制剂具有重要的医学价值。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种骨髓间充质干细胞注射液及其制备方法和应用。该骨髓间充质干细胞注射液能有效的维持干细胞的活力，在回输后能促进间充质干细胞向肝细胞分化成熟，降低GVHD的发生率。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种骨髓间充质干细胞注射液，包括骨髓间充质干细胞、二甲基亚砜、胎牛血清、羟乙基淀粉、维生素C、香菇多糖、人血白蛋白、珠子参皂苷和溶媒。本发明制备的骨髓间充质干细胞注射液，采用骨髓来源的MSCs，其具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制，以上生物学特性使其有可能成为用于组织修复、抑制免疫排斥反应的发生和代谢性疾病细胞治疗最具临床应用前景的多能干细胞，尤其是在肝移植后治疗GVHD有着重要的应用前景。本发明在制备得到大量的骨髓间充质干细胞，将其制备成注射液，其中还添加了羟乙基淀粉、人血白蛋白、维生素C、珠子参皂苷、香菇多糖、二甲基亚砜，使骨髓间充质干细胞得到较好的活性保护，提供细胞所需的能量。其中，羟乙基淀粉为临床血液容量扩充剂，具有较好的细胞保护作用；DMSO和人血白蛋白为临床注射级成分，DMSO也是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性；人血白蛋白为细胞提供营养；维生素C可维持过氧化物酶的活性，从而保存细胞的活性；香菇多糖能提高机体免疫功能；珠子参皂苷能诱导干细胞向肝细胞分化成熟；DMSO为临床溶液介质可为勃脉力(复方电解质溶液)或葡萄糖或生理盐水，其可保持细胞的渗透压，利于细胞的保持活性。作为优选，每100mL骨髓间充质干细胞注射液中包括：骨髓间充质干细胞：(0.5～l)×108个；DMSO：0.5～1mL；FBS：4.5～9mL；羟乙基淀粉：2～4g；维生素C：0.3～0.7g；香菇多糖：0.2～0.6g；人血白蛋白：1～5g；珠子参皂苷：2～8g；溶媒：补足。优选地，每100mL骨髓间充质干细胞注射液中包括：骨髓间充质干细胞：1×108个；DMSO：0.5～1mL；FBS：4.5～9mL；羟乙基淀粉：2～4g；维生素C：0.3～0.7g；香菇多糖：0.2～0.6g；人血白蛋白：1～5g；珠子参皂苷：2～8g；溶媒：补足。在本发明提供的一实施例中，每100mL骨髓间充质干细胞注射液中包括：骨髓间充质干细胞：1×108个；DMSO：0.5mL；FBS：4.5mL；羟乙基淀粉：2g；维生素C：0.3g；香菇多糖：0.2g；人血白蛋白：1g；珠子参皂苷：2g；溶媒：补足。在本发明提供的另一实施例中，每100mL骨髓间充质干细胞注射液中包括：骨髓间充质干细胞：1×108个；DMSO：1mL；FBS：9mL；羟乙基淀粉：4g；维生素C：0.7g；香菇多糖：0.6g；人血白蛋白：5g；珠子参皂苷：8g；溶媒：补足。在本发明提供的另一实施例中，每100mL骨髓间充质干细胞注射液中包括：骨髓间充质干细胞：1×108个；DMSO：0.75mL；FBS：6.75mL；羟乙基淀粉：3g；维生素C：0.5g；香菇多糖：0.4g；人血白蛋白：3g；珠子参皂苷：5g；溶媒：补足。作为优选，溶媒为复方电解质注射液、葡萄糖注射液或生理盐水。临床输注以复方电解质注射液为最佳。作为优选，复方电解质注射液为勃脉力A复方电解质注射液。在本发明提供的实施例中，生理盐水为0.9％氯化钠注射液。作为优选，骨髓间充质干细胞为第2～5代骨髓间充质干细胞。优选地，骨髓间充质干细胞为第3代骨髓间充质干细胞。本发明还提供了该骨髓间充质干细胞注射液在制备治疗移植物抗宿主反应的药物中的应用。本发明还提供了该骨髓间充质干细胞注射液的制备方法，包括：将DMSO、FBS、羟乙基淀粉、维生素C、香菇多糖和骨髓间充质干细胞混合，得到第一混合液；将人血白蛋白、珠子参皂苷和溶媒混合，得到第二混合液；将所述第一混合液与所述第二混合液混合，得到骨髓间充质干细胞注射液。作为优选，骨髓间充质干细胞的冻存液为DMSO、FBS、羟乙基淀粉、维生素C和香菇多糖的混合液，冻存方法为预冷后移入液氮罐低温冻存。作为优选，骨髓间充质干细胞的复苏方法采用恒温水浴复苏。在本发明提供的实施例中，该骨髓间充质干细胞注射液的制备方法包括：细胞冻存液(DMSO、FBS、羟乙基淀粉、维生素C、香菇多糖)置于4℃冰箱预冷，将其重悬骨髓间充质干细胞，并于-198℃液氮中保存；使用时将冻存的细胞于37℃恒温水浴锅中复苏，将复苏的细胞悬液注入到混合液(人血白蛋白、珠子参皂苷和溶媒)中混匀，得到骨髓间充质干细胞制剂。作为优选，预冷的温度为4℃。作为优选，冻存温度为-198℃。作为优选，复苏温度为37℃。本发明提供了一种骨髓间充质干细胞注射液及其制备方法和应用。该骨髓间充质干细胞注射液包括骨髓间充质干细胞、二甲基亚砜(DMSO)、胎牛血清(FBS)、羟乙基淀粉、维生素C、香菇多糖、人血白蛋白、珠子参皂苷和溶媒。本发明具有如下有益效果之一：1、本发明采用骨髓间充质干细胞制备干细胞注射液，取材方便，不违反伦理问题；2、本发明制备的注射液能有效的保存干细胞的活性，可直接复苏使用，不用清洗，使用方便；3、本发明制备的注射液可以促进肝细胞的再生，改善肝脏微环境，从而促进内源性肝细胞的再生，参与损伤肝脏的修复；本发明制备的注射液在回输后能促进间充质干细胞向肝细胞分化成熟，降低GVHD的发生率。附图说明图1示骨髓间充质干细胞的鉴定结果；其中1-1示P3代细胞培养72h后在显微镜下放大40倍的图片；1-2示P3代细胞培养72h后在显微镜下放大100倍的图片；图2示骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化的染色鉴定结果；2-1示P3代骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞后在显微镜下放大40倍的图片；2-2示P3代骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞后在显微镜下放大100倍的图片；2-3示P3代骨髓间充质干细胞诱导分化为成脂细胞后在显微镜下放大40倍的图片；2-4示P3代骨髓间充质干细胞诱导分化为成脂细胞后在显微镜下放大100倍的图片。具体实施方式本发明公开了一种骨髓间充质干细胞注射液及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。术语解释：间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为胰岛、神经、血管内皮、骨、软骨、肌肉、肝脏、心肌等多种组织细胞。移植物抗宿主病(GVHD)是肝移植术后发生的以发热、皮疹、腹泻以及骨髓抑制等为主要表现的全身性免疫疾病，患者最终因全身感染或骨髓衰竭而死亡。本发明提供的骨髓间充质干细胞注射液及其制备方法和应用中所用原料药或辅料均可由市场购得。羟乙基淀粉为羟乙基淀粉130/0.4。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1骨髓间充质干细胞的制备方法1、骨髓间充质干细胞原代分离在无菌条件下，抽取人骨髓，立即加入到事先准备好的装有5mL低糖DMEM的离心管中，充分混匀，200目过筛，得到细胞悬液，再将过滤后得到的细胞悬液缓慢加入到Percoll分离液的上层，细胞悬液与Percoll分离液的体积比为1:1(Percoll是经过聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒悬液，对细胞无毒性和刺激性，厂家为美国GE)，Percoll分离液的密度为1.082kg/L，700g离心20min,收集白膜层单个核细胞，再用PBS洗涤，500g离心5min，重复洗涤离心一次，得到骨髓间充质干细胞。将收集得到的骨髓间充质干细胞用含有10％胎牛血清、双抗(终浓度为100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素)的低糖DMEM重悬，按(0.5～1)×106个/mL接种于T75的培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育，3d后换液，去除未贴壁细胞，之后每3d换1次液，观察细胞生长状况，直到细胞融合度达到80％以上，用0.25％胰酶于37℃消化2～5min，细胞完全脱落后，用完全培养基终止消化，获得纯化后的原代骨髓间充质干细胞。2、骨髓间充质干细胞的传代将获得的原代骨髓间充质干细胞用2倍体积的含有10％胎牛血清的DMEM进行传代培养，每隔1d换液，直到细胞融合度达到80％以上。反复传代，传至2～5代后，观察细胞生长状态，用胰酶消化后使用PBS缓冲溶液洗涤，离心收集。3、骨髓间充质干细胞的鉴定鉴定上述制备的第3代胎盘间充质干细胞，包括：1)显微镜下观察显微镜下观察，可以看出5d后的细胞已经形成较典型的骨髓间充质样，并有明显的贴壁现象(图1)。2)流式细胞仪检测对第3代胎盘间充质干细胞进行流式细胞仪检测，表达CD44、CD105、CD73、CD90和HLA-ABC(表达量高于90％)，不表达CD45、CD34和HLA-DR(表达量于1％)，检测结果如表1所示：表1流式细胞仪检测结果标记抗体阳性比率(％)CD340CD4495.1CD450.2CD7399.26CD9098.9CD10596.8HLA-DR0.13HLA-ABC98.373)诱导分化培养取第3代骨髓间充质干细胞进行体外诱导分化为成脂肪细胞和成骨细胞，染色观察，可看出本发明制备的骨髓间充质干细胞经过适宜条件可向成脂肪细胞和成骨细胞分化，证明本发明制备的骨髓间充质干细胞具有多向分化能力(图2)。以上鉴定结果参照“国际细胞治疗协会(ISCT)”所定制的标准，可证明本发明所制备的细胞具备间充质干细胞的特性。实施例2骨髓间充质干细胞注射液的制备配制100mL干细胞注射液：将冻存的骨髓间充质干细胞于37℃恒温水浴复苏，得到细胞悬液，其中包含骨髓间充质干细胞(细胞终浓度l×106个/mL)、DMSO0.5ml(体积百分含量为0.5％)、FBS4.5mL(体积百分含量为4.5％)、羟乙基淀粉2g(质量体积比终浓度为2％)、维生素C0.3g(质量体积比终浓度为0.3％)、香菇多糖0.2g(质量体积比终浓度为0.2％)；将复苏得到的细胞悬液注入到输液袋的混合液中，混合液中含有浓度为10％的人血白蛋白原液10mL(质量体积比终浓度为1％)、珠子参皂苷：2g(质量体积比终浓度为2％)和0.9％氯化钠注射液85mL，制备完毕。上述制备的骨髓间充质干细胞注射液留样进行内毒素检测、细菌真菌检测、支原体检测，检测结果均为阴性为合格。实施例3骨髓间充质干细胞注射液的制备配制100mL干细胞注射液：将冻存的骨髓间充质干细胞于37℃恒温水浴复苏，得到细胞悬液，其中包含骨髓间充质干细胞(细胞终浓度l×106个/mL)、DMSO1ml(体积百分含量为1％)、FBS9mL(体积百分含量为9％)、羟乙基淀粉4g(质量体积比终浓度为4％)、维生素C0.7g(质量体积比终浓度为0.7％)、香菇多糖0.6g(质量体积比终浓度为0.6％)；将复苏得到的细胞悬液注入到输液袋的混合液中，混合液中含有浓度为20％的人血白蛋白原液25mL(质量体积比终浓度为5％)、珠子参皂苷：8g(质量体积比终浓度为8％)和0.9％氯化钠注射液65mL，制备完毕。上述制备的骨髓间充质干细胞注射液留样进行内毒素检测、细菌真菌检测、支原体检测，检测结果均为阴性为合格。实施例4骨髓间充质干细胞注射液的制备配制100mL干细胞注射液：将冻存的骨髓间充质干细胞于37℃恒温水浴复苏，得到细胞悬液，其中包含骨髓间充质干细胞(细胞终浓度l×106个/mL)、DMSO0.75ml(体积百分含量为0.75％)、FBS6.75mL(体积百分含量为6.75％)、羟乙基淀粉3g(质量体积比终浓度为3％)、维生素C0.5g(质量体积比终浓度为0.5％)、香菇多糖0.4g(质量体积比终浓度为0.4％)；将复苏得到的细胞悬液注入到输液袋的混合液中，混合液中含有浓度为10％的人血白蛋白原液30mL(质量体积比终浓度为3％)、珠子参皂苷：5g(质量体积比终浓度为5％)和0.9％氯化钠注射液62.5mL，制备完毕。上述制备的骨髓间充质干细胞注射液留样进行内毒素检测、细菌真菌检测、支原体检测，检测结果均为阴性为合格。对比例1配制100mL干细胞注射液：将冻存的骨髓间充质干细胞于37℃恒温水浴复苏，得到细胞悬液，其中包含骨髓间充质干细胞(细胞终浓度l×106个/mL)、DMSO1ml(体积百分含量为1％)、FBS9mL(体积百分含量为9％)、羟乙基淀粉4g(质量体积比终浓度为4％)、维生素C0.7g(质量体积比终浓度为0.7％)、香菇多糖0.6g(质量体积比终浓度为0.6％)；将复苏得到的细胞悬液注入到输液袋的混合液中，混合液中含有浓度为20％的人血白蛋白原液25mL(质量体积比终浓度为5％)和0.9％氯化钠注射液65mL，制备完毕。上述制备的骨髓间充质干细胞注射液留样进行内毒素检测、细菌真菌检测、支原体检测，检测结果均为阴性为合格。对比例2配制100mL干细胞注射液：将冻存的骨髓间充质干细胞于37℃恒温水浴复苏，得到细胞悬液，其中包含骨髓间充质干细胞(细胞终浓度l×106个/mL)、DMSO0.5ml(体积百分含量为0.5％)、FBS4.5mL(体积百分含量为4.5％)；将复苏得到的细胞悬液注入到输液袋的混合液中，混合液中含有浓度为10％的人血白蛋白原液10mL(质量体积比终浓度为1％)、珠子参皂苷：2g(质量体积比终浓度为2％)和0.9％氯化钠注射液85mL，制备完毕。上述制备的骨髓间充质干细胞注射液留样进行内毒素检测、细菌真菌检测、支原体检测，检测结果均为阴性为合格。对比例3配制100mL干细胞注射液：将冻存的骨髓间充质干细胞于37℃恒温水浴复苏，得到细胞悬液，其中包含骨髓间充质干细胞(细胞终浓度l×106个/mL)、DMSO0.75ml(体积百分含量为0.75％)、FBS6.75mL(体积百分含量为6.75％)；将复苏得到的细胞悬液注入到输液袋的混合液中，混合液中含有浓度为10％的人血白蛋白原液30mL(质量体积比终浓度为3％)和0.9％氯化钠注射液62.5mL，制备完毕。上述制备的骨髓间充质干细胞注射液留样进行内毒素检测、细菌真菌检测、支原体检测，检测结果均为阴性为合格。试验例功能鉴定1、细胞活率检测1.1将实施例2-4和对比例1-3中冻存的细胞分别从液氮中取出，进行37℃水浴锅中复苏，2min内完成复苏过程，并注于混合液中；取少量混合液中的细胞悬液进行台盼蓝染色计数，同样方法分别测定6个月、12个月、24个月复苏后分别保存2h、6h、12h和24h的细胞活率，结果如表2所示：表2细胞活率检测结果从表2可以看出，本发明的骨髓间充质干细胞经过长时间保存后复苏，其活力依旧较高，并且达到国家要求的一般细胞治疗活率大于等于85％，并且细胞活率经过24个月的冻存复苏制备的制剂保存24h后活率均高于对比例。2、诱导分化将冻存24个月后复苏的细胞进行无血清间充质干细胞培养基培养，观察细胞形态，向成脂、成软骨和成骨分化，经染色在显微镜下观察均成阳性，证明其依旧保持多向分化能力。3、流式检测将实施例2-4的骨髓间充质干细胞冻存24个月后进行流式检测，检测结果如表3：表3流式检测结果标记抗体阳性比率(％)CD340.3CD4493.6CD450.49CD7397.4CD9099.81CD10599.2HLA-DR0.42HLA-ABC98.9从以上流式结果可以看出经过冻存24个月的骨髓间充质干细胞与新鲜制备的间充质干细胞表型一致，证明本发明制备的骨髓间充质干细胞长期保持对细胞表型及干性无影响。4、骨髓间充质干细胞注射液对肝移植大鼠治疗的安全性和有效性实验购买已经建立原位肝移植模型的大鼠30只，将其平均分为A、B、C三组，A组注射本发明实施例2的骨髓间充质干细胞注射液、B组注射免疫抑制剂、C组注射生理盐水，A、B两组分别回输4个疗程，1个星期为一个疗程，每个星期连续回输3天，1剂/天，按1×106个/kg量输注。经过连续30天的观察，结果如下：A组：全部都存活，其中有1只发生轻度的感染，其它恢复正常。B组：有3只出现不同程度的术后并发症，其中1只出现移植物抗宿主病。C组：70％出现不同程度的术后并发症，其中2只是出现移植物抗宿主病死掉。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
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的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3