本发明涉及一种a型赛尼卡谷病毒灭活疫苗及其制备方法和应用，还涉及一种猪a型赛尼卡病毒的全长感染性cdna克隆以及由该全长感染性cdna克隆拯救得到的猪a型赛尼卡病毒。本发明属于生物医药技术领域。
背景技术：
a型赛尼卡谷病毒(senecavalleyvirusa，sva)是小rna病毒科赛尼卡谷病毒属的唯一成员，能够引起母猪严重的水泡病和新生仔猪死亡，可能通过猪尿液传播。2014和2015年,美国、巴西母猪发生水疱病、仔猪死亡爆发流行，造成巨大经济损失。
防控赛尼卡谷病毒的关键在于制备赛尼卡谷病毒灭活疫苗，传统赛尼卡谷病毒灭活疫苗的制备方法是通过采用猪a型赛尼卡谷病毒在猪睾丸二倍体细胞或猪肾传代细胞增殖，进而灭活后制得，但病毒在增殖过程中存在生长慢、滴度低等的问题，且这些细胞有内源性病毒污染，大大限制了大规模工业生产。
对此，本发明提供了一种猪a型赛尼卡谷病毒的全长感染性克隆，克服了猪a型赛尼卡谷病毒在猪睾丸二倍体细胞或猪肾传代细胞上生长慢、滴度低等的问题,拯救获得的a型赛尼卡谷病毒在mrc-5、bhk-21细胞的连续传代，纯化了病毒、提高了其生长性，本发明为赛尼卡谷病毒感染的防控提供了有效的技术手段。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种a型赛尼卡谷病毒灭活疫苗及其制备方法和应用。该疫苗能够使猪产生抗赛尼卡谷病毒感染和赛尼卡谷病毒引起疾病的保护性免疫。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种a型赛尼卡谷病毒灭活疫苗，其含有灭活后的猪a型赛尼卡谷病毒全病毒颗粒抗原以及佐剂，其中所述的猪a型赛尼卡谷病毒全病毒颗粒抗原是由猪a型赛尼卡病毒全长感染性cdna克隆通过病毒拯救获得的，所述的感染性cdna克隆的核苷酸序列如seqidno.1所示。
在本发明中，优选的，所述的佐剂为含有20-50g/l多聚赖氨酸羟甲基纤维素聚肌胞(polyiclc)，0.1-0.5g/l的edta以及0.01-0.1g/l的吐温-20的磷酸缓冲液，调节ph值8.0，优选的，所述的佐剂为含有25g/l多聚赖氨酸羟甲基纤维素聚肌胞(polyiclc)，0.2g/l的edta以及0.05g/l的吐温-20的50mm磷酸缓冲液，调节ph值8.0。
进一步的，本发明还提出了一种制备所述的a型赛尼卡谷病毒灭活疫苗的方法，包括以下步骤：
1)猪a型赛尼卡病毒全病毒颗粒抗原的制备
(1)猪a型赛尼卡谷病毒的拯救
构建含有猪a型赛尼卡谷病毒的全长感染性cdna克隆的表达载体，其中所述cdna克隆具有sedidno.1所示的核苷酸序列；优选的，所述的表达载体是通过将sedidno.1所示的核苷酸序列克隆入psvl载体中构建得到的；
(2)猪肾细胞系ibrs-2用含10v/v％胎牛血清的mem基础培养基培养到70-90％铺满，将步骤(1)构建得到的表达载体转染ibrs-2，37℃，5％co2孵育箱培养，培养48小时后的上清移到st细胞上继续培养，观察细胞病变效应，在感染后出现明显细胞病变效应时收获病毒，即为拯救得到的猪a型赛尼卡谷病毒；
(3)病毒的传代适应
拯救得到的猪a型赛尼卡谷病毒经过st细胞、mrc-5细胞的传代适应培养获得适应mrc-5细胞的猪a型赛尼卡谷病毒，然后接种bhk-21细胞进行传代适应培养，获得适应bhk-21细胞培养的猪a型赛尼卡谷病毒的病毒培养液；
(4)澄清
病毒培养液用8μm的聚丙烯预过滤器过滤，再经0.45μm和0.2μm的过滤器过滤澄清，测定病毒滴度；
(5)超滤透析
澄清的病毒液用100kd膜超滤透析；
(6)纯化
透析后的病毒液加入mgcl2，使其终浓度为2mm，按15u/ml加入核酸酶作用2小时，离心，进行不连续氯化铯密度梯度离心，然后进行连续氯化铯密度梯度离心，每步离心结束后，收集光栅区带，用含有10v/v％甘油、50mmhepesph8.0的200mmtris–hcl冷透析缓冲液透析；
(7)灭活
纯化的病毒用rpmi1640稀释，用双乙亚胺灭活，用硫代磷酸钠中和；
(8)透析
用100kda的膜浓缩至原体积的1/6，用含有150mmnacl的pbs缓冲液透析，获得a型赛尼卡谷病毒全病毒颗粒抗原；
2)佐剂的制备
向磷酸缓冲液中加入多聚赖氨酸羟甲基纤维素聚肌胞(polyiclc)，edta以及吐温-20，使其终浓度分别达到20-50g/l，0.1-0.5g/l以及0.01-0.1g/l，调节ph值8.0；优选的，向50mm磷酸缓冲液中加入多聚赖氨酸羟甲基纤维素聚肌胞(polyiclc)，edta以及吐温-20，使其终浓度分别达到25g/l，0.2g/l以及0.05g/l，调节ph值8.0；
3)疫苗制备
将获得的a型赛尼卡谷病毒全病毒颗粒抗原加入所制备得到的佐剂中，使病毒蛋白量达到5-10μg/ml，按照0.5-1.0ml/头份进行分装。
在本发明所述的方法中，优选的，所述的不连续氯化铯密度梯度离心中采用的氯化铯的浓度为1.24g/ml以及1.4g/ml，连续氯化铯密度梯度离心中采用的氯化铯的浓度为1.33g/ml。
不连续氯化铯密度梯度离心的主要目的在于去除主要的细胞污染物和缺陷性病毒颗粒。连续氯化铯密度梯度离心的主要目的在于将感染性病毒颗粒和缺陷性病毒颗粒分开。
再进一步的，本发明还提出了所述的a型赛尼卡谷病毒灭活疫苗在制备预防和治疗由a型赛尼卡谷病毒感染导致的疾病药物中的用途。
本发明的一种猪a型赛尼卡病毒全长感染性cdna克隆，其核苷酸序列如seqidno.1所示。
znwt-01-2015cdna克隆构建如图1，基因组5′末端为sv40启动子，基因组全长7293nt，3′末端polya含11nt，与基因库sva(基因库登记号no.kc667560.1)比较，5′末端含额外的t，5′utr区域12位点发生t到c突变，7236位点发生t到c的突变，3′utr区域7265位点发生了c到t突变。在2c区为引入saci限制性酶切位点,4216引入c到t突变，4216从c到t的突变为寂静突变，不改变编码氨基酸序列。
一种表达载体，含有本发明所述的猪a型赛尼卡病毒的全长感染性cdna克隆，优选的，所述的表达载体是通过将sedidno.1所示的核苷酸序列克隆入psvl载体中构建得到的。
进一步的，本发明还提出了所述的猪a型赛尼卡谷病毒的全长感染性cdna克隆以及所述的表达载体在拯救猪a型赛尼卡谷病毒中的应用。
一种拯救猪a型赛尼卡谷病毒的方法，其包括以下步骤：
(1)构建含有猪a型赛尼卡谷病毒的全长感染性cdna克隆的表达载体，其中所述cdna克隆具有sedidno.1所示的核苷酸序列；优选的，所述的表达载体是通过将sedidno.1所示的核苷酸序列克隆入psvl载体中构建得到的；
(2)猪肾细胞系ibrs-2用含10v/v％胎牛血清的mem基础培养基培养到70-90％铺满，将步骤(1)构建得到的表达载体转染ibrs-2，37℃，5％co2孵育箱培养，培养48小时后的上清移到st细胞上继续培养，观察细胞病变效应，在感染后出现明显细胞病变效应时收获病毒，即为猪a型赛尼卡谷病毒。
更进一步的，本发明还提出了按照所述的方法制备得到的猪a型赛尼卡谷病毒。以及
所述的猪a型赛尼卡谷病毒在制备检测猪a型赛尼卡谷病毒中和抗体试剂以及制备a型赛尼卡谷病毒灭活疫苗中的应用。
相较于与现有技术，本发明的优点在于：
1、本发明提供了猪a型赛尼卡谷病毒全长感染性cdna克隆，克服了猪a型赛尼卡谷病毒在猪睾丸二倍体细胞或猪肾传代细胞上生长慢、滴度低的问题；
2、拯救得到的猪a型赛尼卡谷病毒经过st细胞、mrc-5细胞的传代适应培养获得适应mrc-5细胞的猪a型赛尼卡谷病毒，然后接种bhk-21细胞进行传代适应培养，纯化了病毒、提高其生长性。bhk-12细胞是动物疫苗标准的疫苗基质，易于大规模的生产，且疫苗质量可控。
2、采用多聚赖氨酸羟甲基纤维素聚肌胞作为佐剂制成灭活疫苗，1头份免疫高效、完全保护、免疫持久，一头份就可产生完全保护，保护持续期1年。相比亚单位、病毒样颗粒疫苗，生产成本低，相比减毒活疫苗安全。
附图说明
图1为znwt-01-2015全长感染性克隆的构建示意图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1a型赛尼卡谷病毒的克隆和拯救
1.材料和方法
1.1.细胞和病毒培养
用于st、pk-15、ibrs-2细胞培养的含10％胎牛血清、100单位/ml青霉素、100mg/ml链霉素的mem基础培养基购自美国gibco公司，培养条件37℃、5％co2。
1.2构建和克隆
经fmdv、svdv、svv的rt-pcr检测阴性，svart-pcr检测为阳性猪水泡液用高度纯化病毒rna试剂盒(购自rochediagnostics,中国)提取总rna，用随机引物和转录高保真cdna合成试剂盒(rochediagnostics,中国)合成第一链cdna。为构建全长感染性cdna克隆，采用铂金taq高保真多聚酶(lifetechnologies,中国)，以基因库中加拿大分离毒(基因登记号no.kc667560)序列为模板设计引物(见表1)，用含有独特的限制酶切位点引物通过rt-pcr获得的a-e5个片段，依次将片段a-e、poly(a)插入带有sv40启动子的psvl载体(pharmaciabiotech,wi,usa)：片段a用限制性酶sphi/saci插入质粒，后续片段b、片段c、片段e用nebuilder-hifidna组装克隆试剂盒(购自美国newenglandbiolabs)按操作说明组装到带有sv40启动子的psvl质粒中。组装得到a型赛尼卡谷病毒的全长感染性cdna克隆，命名为znwt-01-2015。见图1，为方便克隆，znwt-01-2015中引入一saci限制酶切位点(4213gagctc4218)。得到的重组质粒命名为psvlsd-01-2015。
znwt-01-2015的5′末端和3′末端用generacercore试剂盒(购自美国invitrogen公司)测序，测序引物见表1。
表1.构建全长cdna克隆和病毒基因组测序引物
1.3.病毒的拯救
猪肾细胞系ibrs-2用含10v/v％胎牛血清基础培养基(mem)(美国gibco公司产品)在12孔板上培养到70-90％铺满，将psvlsd-01-2015按0.1–1000ng/ml用lipofectamine3000(购自lifetechnologies)转染，37℃，5％co2孵育箱培养。转染培养48小时的上清移到st细胞上继续培养，每天观察细胞病变效应，在感染后出现明显细胞病变效应时(感染18-48小时)收获病毒，命名为vznwt-01-2015克隆。
1.4.病毒的检测
vznwt-01-2015克隆在st细胞上传代2次，用试剂盒qiaampviralrnaminikit(购自美国qiagen公司)按说明书提取rna，用superscriptiiireversetranscriptase(购自美国invitrogen)合成cdna，使用sva-f3547/sva-r5200(表1)进行pcr。pcr产物用胶纯化并用saci酶切和测序确认。
1.5.病毒生长动力学和噬斑分析
pk-15在24孔板培养，100％铺满时感染vznwt-01-2015克隆，moi＝0.1。1小时孵育后移去上清，用mem洗涤细胞，加入新鲜培养液，分别在感染6、12、24、36、48h后收获上清液，在pk-15细胞上进行滴定，以tcid50/ml表示病毒滴度。
1.6猪体感染试验
总计8头3周龄的猪，随机分成2组，1组(n＝5)鼻内接种vznwt-01-2015病毒液5毫升，其滴度108tcid50/ml，2组(n＝3)接种基础培养液。每日观察临床症状和温度，观察14天。在感染后0、3、7、14天收集血清、口腔液、鼻拭子、粪便拭子。14天结束实验，进行宏观病理评估并收集组织和皮肤样本。
1.7定量rt-pcr
定量rt-pcr评估血清、口腔液、鼻拭子、粪便拭子病毒载量。病毒vznwt-01-2015基因组用magmax-96viralrna分离试剂盒(购自美国lifetechnologies)按提供的说明书进行。使用path-idtmmultiplexone-steprt-pcrkit(购自美国appliedbiosystems)在cfx96touchreal-timepcr检测系统上进行qrt-pcr,其参数：48℃10min,95℃10min，在进行45个循环，每个循环95℃15s，60℃60s。克隆系列10倍稀释到106tcid50/ml—1×101tcid50/ml，建立检测标准曲线。由标准曲线确定病毒载量tcid50/ml。
1.8.中和抗体分析
采用免疫荧光灶分析，简单描述：血清样本56℃加热30min灭活，用含2％马血清的mem2倍稀释，每孔加入100微升，与100微升含200tcid50的病毒vznwt-01-2015混合，37℃孵育1小时后，取150微升加入90-100％铺满pk-15细胞，37℃孵育。感染18小时后，细胞用冷甲醇在20℃固定30min。用特异的vp2亲和层析纯化多克隆抗体染色，alexafluors488affinipure羊-兔igg(h+l)抗体(购自美国jacksonimmunoresearchinc)作为第二抗体。每孔细胞用evosfl细胞成像系统(购自美国lifetechnologies,)。中和抗体为能够阻止90％病毒生长的最高血清稀释度。
1.9sva特异抗体应答
间接免疫荧光法分析猪接种病毒后的sva特异性抗体。96孔板培养pk-15细胞，100％铺满后，以moi＝0.01感染病毒vznwt-01-2015，感染14小时后用冰冷甲醇20℃固定30min。猪血清起初1：5稀释，再2倍系列稀释加入固定细胞孵育。37℃孵育1小时后，单层细胞用pbs洗涤三次，1：200稀释fitc偶联的第二抗体混合物(羊抗猪igm、羊抗猪iga、羊抗猪igg)和细胞一起孵化，pbs洗涤3次，每个孔的细胞用evosfl细胞成像系统(美国lifetechnologies公司产品)观察,。可检测到sva蛋白的最高稀释的血清为sva特异性抗体滴度。
2.结果
2.1.a型塞尼卡谷病毒感染性cdna克隆的构建
a型赛尼卡谷病毒感染性克隆znwt-01-2015的cdna测序结果如seqidno.1所示，与基因库sva病毒(基因库登记号no.kc667560)的核苷酸同源性为93.4％。全长感染性克隆znwt-01-2015的cdna克隆构建如图1，基因组5′末端为sv40启动子，基因组全长7293nt，3′末端polya含11nt，与基因库sva(基因库登记号no.kc667560.1)比较，5′末端含额外的t，5′utr区域12位点发生t到c突变，7236位点发生t到c的突变，3′utr区域7265位点发生了c到t突变。在2c区为引入saci限制性酶切位点4216引入c到t突变，4216位点从c到t的突变为寂静突变，不改变编码氨基酸序列。
2.2.sva全长cdna克隆znwt-01-2015的体外恢复和病毒特征
转染1000ng/ml和100ng/mlpsvlznwt-01-2015的ibrs-2单层细胞在转染后2天出现细胞病变效应，0.1–10ng/ml转染的ibrs-2细胞在转染后3天出现病变。收集转染后48小时的转染细胞上清在st细胞上传代，感染12小时后，用vp1亲和层析纯化的多克隆抗体染色，st细胞内可检测到vp1蛋白。ibrs-2细胞转染培养上清在st细胞上传代2次，在感染后18-48小时后，st细胞上出现细胞病变效应。病毒滴度达到1×108tcid50/ml。这些结果说明病毒vznwt-01-2015从全长感染性克隆znwt-01-2015中恢复拯救。
saci酶切和测序结果表明：其基因组3551–5227nt的2c区saci限制性酶切位点灭活。也就是2c区的rt-pcr产物1677bp片段不被saci酶切。
vznwt-01-2015病毒以moi＝0.01感染pk-15细胞，分别在感染后6、12、24、36、48h后收获。病毒滴度高峰发生感染36小时后，病毒滴度为108.6tcid50/ml。
2.3猪体感染试验
vznwt-01-2015病毒感染保育猪，总计10头3周龄猪分为2组。1组感染克隆病毒vznwt-01-2015(n＝5)，2组模拟感染细胞培养液(n＝5)。1组4/5头猪有临床症状：呼吸窘迫、昏睡。3/5头猪在感染6天后出现高热，肛门温度达105℉。4/5头猪的唇上出现水泡，且持续3-4天。2/5头猪感染7天后，在后腿猪蹄特别是冠状带有明显溃疡损伤。2组未观察到临床症状。感染14天后，1组有1头猪水泡溃疡结痂痊愈，其余4头猪的猪蹄冠状带都有圆形腐蚀状损伤并出现四肢损伤。14天后进行解剖，1组2/5猪肠系膜淋巴结肿大，3/5头猪肺部轻微损伤。在扁桃体、心脏、肝脏、脾、肾脏和肠无肉眼观察的病理现象。
2.4vznwt-01-2015病毒在猪体内生长特性
从vznwt-01-2015病毒感染猪收集血清、鼻拭子、口腔液确定病毒是否复制和排毒。1组猪中，只有1头猪感染3天和7天的血清样本qrt-pcr结果显示有病毒rna，4/5头猪鼻拭子qrt-pcr结果阳性，所有猪口腔液、粪便qrt-pcr结果阳性。感染14天后在血清和鼻拭子样本中已经检测不出病毒rna。但口腔液样本中可测到病毒rna，相当于101.0tcid50/ml。2组的所有样本qrt-pcr检测无病毒rna。
实施例2.猪a型赛尼卡谷病毒的传代和适应
1.1材料
vznwt-01-2015为实施例1克隆和拯救的病毒，克隆拯救的病毒特征见实施例1。仔猪1-3周龄，sva抗体elisa试剂盒、st细胞、mrc-5细胞、bhk-21细胞购自美国atcc。
1.2传代和培养方法
75cm2方瓶培养st细胞，细胞培养液为含有10％v/v胎牛血清的dmem培养液，37℃培养，细胞单层后接种1mlsva抗体检测为vznwt-01-2015阳性的猪水泡液，在2v/v％胎牛血清的dmem培养液中32℃培养，每日观察细胞病变效应(cytopathiceffect，cpe)。3天后，培养细胞80％脱落，收集病毒液，接种1ml到另一准备好的st细胞长满单层的75cm2方瓶，其余病毒液贮存于-80℃冰箱备用。重复传代5次，其中在st细胞上传代两次得到的vznwt-01-2015病毒作为攻毒毒株，命名为svaa-st-p2。
mrc-5细胞在75cm2的方瓶中长满单层，细胞培养液为含8-10v/v％胎牛血清的dmem培养液，按0.01-0.1moi接种经st细胞培养及传代后的vznwt-01-2015病毒液1毫升，37℃培养6-8天，盲传2-3代，分离细胞上有病变的病毒。分离的病毒连续在mrc-5细胞传至多代，产生持续稳定的细胞病变效应，得到适应mrc-5细胞培养的vznwt-01-2015病毒。
bhk-21细胞在75cm2的方瓶中长满单层，细胞培养液为含8-10v/v％胎牛血清的dmem培养液，接种适应mrc-5细胞培养的vznwt-01-2015病毒液1毫升，经32℃4小时的吸附，换液后32℃培养，起初6周传代一次，每次传代细胞经冻融超声。经8-10次传代后，bhk-21细胞开始有细胞病变效应，继续传代，并进行滴度测定，获得持续稳定的细胞病变效应，得到适应bhk-21细胞培养的vznwt-01-2015病毒。
1.3检测、鉴定方法：
1.3.1a型赛尼卡谷病毒分子检测：
以基因库塞尼卡病毒公开基因组((dq641257,kc667560,kr063107,kr063108,kr063109,kt757280,kt757281,kt757282,kt321458、kx349733)d区保守序列设计引物：sva3d-f1:5‘-agaatttggaagccatgctct-3’sva3d-r1:5‘-gagccaacatagaracagattgc-3’probe,svv3d-pr1:5‘-fam-ttcaaaccaggaacactactcgaga-bhq1-3’采用实时rt-pcr扩增bhk-21细胞适应毒基因组3d区序列，并测序。
1.3.2水泡炎病毒elisa检测、猪水泡口腔炎elisa检测、猪口蹄疫病毒检测按试剂盒说明书进行。
1.3.3基因稳定性检测：
以seqidno.1所示的克隆的a型塞尼卡病毒原始毒基因组序列为模板设计引物。采用rt-pcr扩增分离毒、不同代次细胞适应毒的基因组2b-2c区，并测序。
1.3.4分离病毒全基因组测序：
病毒适应后、浓缩抽取rna，以seqidno.1所示的克隆的a型塞尼卡病毒原始毒基因组序列为模板设计引物，进行rt-pcr和测序。
2.结果
2.1、病毒传代和鉴定
2.1.1病毒在mrc-5二倍体细胞扩增
将得到的经st细胞培养及传代后的vznwt-01-2015病毒按0.01-0.1moi接种单层二倍体mrc-5细胞，传至8-10代，病毒滴度可达109.0logtcid50/ml。以seqidno.1所示的克隆的a型塞尼卡病毒原始毒基因组序列2b-2c区间为模板设计引物，对在mrc-5上p10代适应毒进行rt-pcr扩增，结果为阳性，扩增片段序列测序和分离毒同源性100％。a型塞尼卡病毒mrc-5上p103d区实时pcr检测阳性。
2.1.2病毒在bhk-21细胞上的传代和适应
用75cm2的方瓶培养bhk-21细胞单层后，用不含胎牛血清的dmem培养液洗3次，接种人二倍体mrc-5细胞适应的a型赛尼卡谷病毒vznwt-01-20151ml，经32℃4小时的吸附，换液后32℃培养，起初6周传代一次，每次传代细胞经冻融超声。经8-10次传代后，bhk-21细胞开始有细胞病变效应，继续传代，并进行滴度测定，传至病毒滴度达到最高并维持10代。最终病毒滴度达107.8logtcid50/ml。对p10、p20的bhk适应病毒基因组2b-2c区间测序的结果：与znwt-01-2015克隆比较，核苷酸同源性99.9％，氨基酸同源性为99.8％。对p30代次毒经全基因测序发现该病毒含7297个碱基对(含3末端polya40bp),与znwt-01-2015克隆核苷酸、氨基酸同源性分别为99.0％和99.9％。a型塞尼卡病毒bhk-21-p30代次3d区实时pcr检测阳性。作为灭活猪赛尼卡谷病毒疫苗原始种子批病毒，命名为猪a型赛尼卡谷病毒30代次bhk-21适应株(sva-bhk-21-p30)。
实施例3.病毒疫苗和抗体的制备
1、抗原的制备
1.1病毒培养
bhk-2137℃培养3-4天，培养液ph7.2±0.2，sva-bhk-21-p30以0.01moi感染，32℃培养3-4天收获病毒培养液。
1.2澄清
病毒培养液用8μm的聚丙烯预过滤器过滤，再经0.45μm和0.2μm的过滤器过滤澄清，测定病毒滴度(tcid50)。
1.3超滤透析
澄清的病毒液用100kd膜超滤透析(20mmtris，150mmnacl,ph＝7.5)。
1.4纯化
透析后的病毒液加入mgcl2，使其终浓度为2mm，按15u/ml加入核酸酶作用2小时。277k离心机上1500g离心10分钟，进行不连续氯化铯密度梯度离心(1.24-1.4g/ml)，然后进行连续氯化铯密度梯度离心(1.33g/ml)，每步离心结束后，收集光栅区带，用1l冷透析缓冲液[200mmtris–hcl,50mmhepesph8.0,10％(v/v)甘油]透析。紫外分光光度计测定260nm的光吸收值，od260nm＝9.5×1012病毒颗粒，用sds-page电泳检测可见vp1、vp2、vp3、vp4各电泳带，相对于分子量为33kda、40kda、28kda、6kda。
1.5灭活
纯化的病毒用rpmi1640稀释至108tcid50/ml,用0.1m双乙亚胺37℃灭活1小时，0.1mm硫代磷酸钠37℃中和2小时。灭活方法：纯化的病毒用rpmi1640稀释至108tcid50/ml，用0.1m双乙亚胺37℃灭活1小时，0.1mm硫代磷酸钠37℃中和2小时。
灭活验证试验：1ml灭活液加入装有50ml培养液的150cm2细胞瓶，37℃培养1周，换新鲜培养液继续培养1周。同时接种1ml的未灭活病毒液到相同细胞瓶观察细胞病变效应。
1.6透析
用100kda的膜浓缩至原体积的1/6，用pbs缓冲液(50mm磷酸缓冲液，150mmnacl,ph7.5)透析。
2、佐剂的制备(100ml)
100ml50mm磷酸缓冲液中，加入2.5g多聚赖氨酸羟甲基纤维素聚肌胞(polyiclc，平均分子量500000da)，0.02gedta、0.005g吐温-20，调节ph值8.0。
化合物polyiclc由本发明人自行合成，多聚赖氨酸poly-l-lysine(分子量1000-4000da，cat.no.p0879)、聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyic，cat.no.p0913)和羟甲基纤维素(carboxymethylcellulose,低粘度，cat.no.c5678)均购自sigma-aldrich公司(st.louis,mo)。聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyic，平均分子量200000-500000da，500ml；4.0mg/ml)、多聚赖氨酸(poly-l-lysine，250ml；6.0mg/ml)和2％羟甲基纤维素(carboxymethylcellulose，250ml)由无热源0.85％nacl溶液配制，稳定的多聚赖氨酸羟甲基纤维素聚肌胞(polyiclc)按文献制备(levy,baeretal.1975)。聚肌苷酸-聚胞苷酸在71℃加热1小时重新退火慢慢冷却，加入等体积生理盐水，使含6.0mg/ml多聚赖氨酸和2％羟甲基纤维素，聚肌苷酸-聚胞苷酸在混合液中的最终浓度为1mg/ml，4℃备用。polyiclc用量按猪、猴注射化合物的文献推算为20mg/100kg，疫苗有效剂量1ml含20-50mgpolyiclc。
3、疫苗制备
将获得的a型赛尼卡谷病毒全病毒颗粒抗原加入所制备得到的佐剂中，使病毒蛋白量达到5-10μg/ml。按照0.5-1.0ml/头份进行分装。
4、a型赛尼卡谷病毒纯化多克隆抗体制备
按经典方法，纯化灭活的全病毒颗粒超免兔子，获取高滴度的抗体血清，血清经饱和硫酸铵、g蛋白层析、纯化病毒偶联的sephorose-4b柱层析纯化，获得亲和层析纯化的抗体，经检验标明该抗体和a型赛尼卡谷病毒反应特异、敏感。
5、a型赛尼卡谷病毒全病毒颗粒抗原含量测定
以亲和层析纯化的a型赛尼卡谷病毒多克隆抗体为基础建立间接elisa法定量a型赛尼卡谷病毒的含量。利用平行线法测定猪体中和抗体的水平和纯化全病毒抗原量的关系，纯化的a型赛尼卡谷病毒为5μg时可产生保护性中和抗体，定为5单位，通过间接elisa法可估算灭活猪赛尼卡谷病毒疫苗的效价。
实施例4灭活赛尼卡谷病毒疫苗对小母猪的安全性以及免疫原性
1、方法
1.1实验分组
70只健康无sva抗体1-3周猪随机分成7个组，包含：仅鼻腔滴注10μg灭活后的a型赛尼卡谷病毒全病毒颗粒抗原的实验组a、仅鼻腔滴注25mg多聚赖氨酸羟甲基纤维素聚肌胞成份的实验组b，分别鼻腔滴注含5μg、10μg、20μg、50μg灭活后的a型赛尼卡谷病毒全病毒颗粒抗原+25mg多聚赖氨酸羟甲基纤维素聚肌胞的实验组c-f，对照组鼻腔滴注磷酸缓冲液，每组10只。所有实验组、对照组进行一次免疫，免疫后30天，用5.0tcid50svaa-st-p2毒攻击。取免疫后0、3、6、9、14、21、28、35、42、49、56、70天的血样和攻毒后0、3、4、7、10、15、22天的血样进行elisa、中和试验。病毒定量之前贮存于-70℃。仔猪的安全性观察包括仔猪的体温、食欲、增重观察。
1.2检测方法
sva特异性抗体用间接elisa法检测：从猪体收集分离血清贮存于-20℃备用。用纯化sva抗原包被，稀释猪血清，用辣根过氧化物酶标记的鼠抗猪抗体检测。在室温下操作，在650nm处测定光吸收值(bio-rad680微板读数仪)，通过阳性和阴性样品的比值确定sva抗体是否阳性。
血清中和抗体检测法：血清倍比稀释，分别和5×103tcid50/ml的病毒液混合，37℃孵化1小时，移入长满单层st细胞96孔板，分析3天后细胞病变效应，阻止50％细胞病变效应的血清稀释度的倒数则为中和抗体滴度。
病毒血症检测：sva抗体阳性猪血清进行实时荧光系统检测pcr(bio-radiq5realtimepcrdetectionsystem),20μl(iqsybrgreensupermix；bio-rad)反应体积包含10μl混合物，1μl猪血清样本cdna提取物，8.5μl不含rna酶的水，采用引物赛尼卡谷病毒基因库vp1最保守的短序列为模板，设计合成：
正向引物5’-gggtaacactgacaccgattt-3’；
反向引物5’-tcgagatcgatcaaacaggaac-3’
取2.5μl，每次反应设立sva1：10稀释的标准曲线。反应条件：48℃5min，95℃10min，然后40个循环，每次循环，95℃变性5s，60℃1min。可扩增到87bp的片段。每次反应评估的prrsv含量转化成循环阈值ct,由bio-radiq5qpcr软件和标准曲线相关系数确定病毒含量(拷贝/毫升)。
1.3攻击毒培养：用实施例1所述st细胞培养方法培养svaa-st-p2，st三次噬斑克隆纯化，用含10v/v％胎牛血清的dmem在37℃、5％co2条件下培养3天。用st细胞培养法测定病毒滴度。用含4％小牛血清的mem稀释到6.0logtcid50/ml，仔猪口腔滴注2ml攻毒。
2.结果：
如表1显示，仔猪接受1剂注射免疫后在56天的体重增长无明显差异。也无观察到发热、厌食等现象，表明本发明的疫苗安全。
表1疫苗免疫后(天)仔猪增重
表2.疫苗诱导仔猪中和sva抗体(log2)变化
表2显示含灭活后的a型赛尼卡谷病毒全病毒颗粒抗原以及多聚赖氨酸羟甲基纤维素聚肌胞的灭活纯化疫苗诱导产抗生抗sva中和抗体，产生中和抗体快、滴度高。
表2结果显示a组猪在免疫后7-14天sva中和抗体阳转，攻毒后所有的猪在3天抗体阳转。接种佐剂的b组在攻毒前没有检测到sva中和抗体，攻毒后14-28天可检测到sva中和抗体。c-f组的猪在接种免疫后的1周内抗体阳转，攻毒后所有的猪在3天抗体阳转，a组抗体滴度高于b组，c-f组免疫后1周抗体滴度和攻击后1周的抗体滴度高于a组，且有显著差异(p＜0.05)，但c-f组抗体滴度无显著差异(p＞0.05)。攻毒前，b组猪没有检测到sva中和抗体，攻毒后检测到中和抗体，抗体平均滴度在4.0-8.9log2之间。攻毒后，a组的猪中和抗体在14-21天阳转。c-f组中和抗体滴度在攻毒后5-7保持高峰，a组在攻毒后第5天抗体滴度最高。b组的中和抗体和c-f组中和抗体滴度和高峰时间均有显著差异(p＜0.05)。
攻毒前，实验组a以及实验组c-f的猪，血清并未查到病毒，说明疫苗中sva灭活彻底，疫苗安全。攻毒后，所有免疫的猪不包括b组，发生病毒血症时间缩短。a组攻毒4天后，病毒滴度达到高峰，平均达到1.4log10tcid50/ml，后续开始下降，在攻毒后3周后无病毒检测到。b组攻毒14天后，病毒滴度达到高峰，平均达到4.9log10tcid50/ml，后续开始下降，在攻毒后28天无病毒检测到。a组和b组病毒血症出现时间、高峰期有显著差异。c-f组在攻毒后17-21天，病毒血症清除。c组在攻毒后第4天病毒滴度最高达2.3log10tcid50/ml，7天后病毒滴度下降，3周后检不到病毒。c-f组病毒血症发生时间、高峰时间、病毒清除时间均无显著差异，但和a组、b组有显著差异，结果如表3所示。
表3疫苗免疫仔猪攻毒后的病毒血症
上述结果表明，本发明的疫苗对仔猪，一次肌肉注射免疫可减小病毒血症时间、保护仔猪无水泡症状和死亡，且本发明疫苗对仔猪安全、有效。
实施例5.滴鼻猪赛尼卡谷病毒疫苗对母猪安全性和免疫保护期
1、方法：
1.1攻击毒培养：用实施例1所述st细胞培养方法培养svaa-st-p2，st三次噬斑克隆纯化，用含10％胎牛血清的dmem在37℃、5％co2条件下培养3天。用st细胞培养法测定病毒滴度。用含4％小牛血清的mem稀释到6.0logtcid50/ml，用含4％小牛血清的mem稀释到8.0tcid50/ml，母猪口腔滴注5ml攻毒。
1.2分组、免疫、攻毒、观察
选用不同体重年龄至少在6月龄的母猪，用试剂盒检测筛选sva抗体阴性的猪90头分成9组，每组10只。1组在分娩前3周鼻腔滴注实施例3制备得到的疫苗，间隔2周鼻腔滴注疫苗二次免疫，体积为2毫升(10μg抗原+25mgplcic/ml)。2组超声检测确证已经怀孕的母猪，在怀孕期的30-45天鼻内滴注2剂实施例3制备得到的疫苗，3组用注射用水分别在0、14天鼻内滴注。
4-9组母猪在分娩前3周鼻腔滴注实施例3制备得到的疫苗，间隔2周鼻腔滴注疫苗二次免疫，体积为2毫升(10μg抗原+25mgplcic/ml)。在最后1剂免疫完成后分别在30、60、90、120、180、210天攻毒，攻击、免疫前后观察猪的健康状况、体重变化、体温变化，检测血清的中和抗体滴度，观察攻毒感染后猪的健康状况、病毒血症是否出现和发生时间。
1.3血清中和抗体检测法：
血清倍比稀释，分别和5×103tcid50/ml的病毒液混合，37℃孵化1小时，移入长满单层st细胞96孔板，分析3天后细胞病变效应，阻止50％细胞病变效应的血清稀释度的倒数则为中和抗体滴度。
2、结果
所有滴鼻2次免疫的母猪体温正常、平均增重大于注射用水滴注的猪，没有观察到系统和局部的副反应。说明发明疫苗不影响母猪的生长发育，鼻腔免疫母猪安全。
2次鼻内滴注免疫怀孕母猪平均体温正常、平均增重大于注射用水的母猪，滴鼻免疫母猪没有观察到发热和鼻腔症状，也无其他副反应。说明疫苗滴鼻免疫对怀孕母猪安全。
2组2次鼻内滴注免疫已经怀孕的10头母猪，平均每窝产仔9.8头，分娩28天后，仔猪体温、增重正常，无死胎和仔猪发育不全现象，发明的疫苗2次鼻内滴注免疫使用，对怀孕母猪妊娠和产仔的生殖没有影响，对新生仔猪发育无也影响。
2组超声检测确证已经怀孕的母猪10头，在怀孕期的30-45天鼻内滴注2次发明的疫苗，间隔2周进行免疫，10头怀孕母猪都产生中和抗体，平均滴度512。
3组母猪免后30天，攻毒前10/10产生了svv特异性中和抗体，攻毒后有10/10猪无病毒血症，攻毒后母猪产生中和抗体，平均滴度为512；4组免疫后60天攻毒，有1/10产生病毒血症，病毒血症时间1天，中和抗体平均滴度为512；5组免后90天攻毒后，有1/10产生病毒血症，病毒血症时间为2天，10/10小母猪产生中和抗体，滴度为512；6组免疫后120天攻毒，有1/10小母猪病毒血症，发生时间为2天，10/10母猪产生了中和抗体，滴度为256；7组免疫后150天攻毒，9/10母猪产生中和抗体，平均中和抗体滴度128，10/10小母猪全部存活；8组免后180天感染，1/10的猪有病毒血症，时间为2天，10/10小母猪中和抗体水平仍保持在128；9组免疫后210天感染，10/10猪都产生中和抗体，抗体滴度为32，1/10猪有病毒血症，时间为3天。
以上结果表明，本发明的疫苗对母猪免疫保护期期应在180天，免疫次数2次，滴鼻免疫，间隔2周，免疫有效期为180天。
鼻内滴注免疫发明的疫苗2次能诱导血清sva中和抗体生成，减少病毒血症发生，减少小母猪感染死亡，对病毒感染引起的死亡保护率为100％，免疫保护期为180天。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>中农威特生物科技股份有限公司
<120>一种a型赛尼卡谷病毒灭活疫苗及其制备方法和应用
<130>klpi161405
<160>1
<170>patentin3.5
<210>1
<211>7293
<212>dna
<213>senecavalleyvirusa
<400>1
ttttgagttggcgtctgggccctcatgcccagtccttcctttccccttccggggggtaaa60
ccggctgtgtttgctagaggcacagaggagcaacatccaacctgctcttgtggggaacgg120
tgcggctccaattcctgcgtcgccaaaggtgttagcgcacccaaacggcgcatctaccaa180
tgctattggtgtggtctgcgagttctagcctactcgtttctcccctatccactcactcac240
gcacaaaaagtgtgttgtaactacaagacttagccctcgcacgagatgtgcgataaccgc300
aagattgactcaagcgcggaaagcgctgtaaccacatgctgttagtccctttatggctgc360
gagatggctatccacctcggatcactgaactggagctcgaccctccttagtaagggaacc420
gagaggccttcttgcaacaagctccgacacagagtccacgtgattgctaccaccatgagt480
acatggttctcccctctcgacccaggacttctttttgaatatccacggctcgatccagag540
ggtggggcatgatccccctagcatagcgagctacagcgggaactgtagctaggccttagc600
gtgctttggatactgcctgatagggcgacggcctagtcgtgtcggttctataggtagcac660
atacaaatatgcagaactctcatttttctttcgatacagcctctggcacctttgaagacg720
taaccggaacaaaagtcaagatcgttgaataccctagatcggtgaacaatggtgtttacg780
attcgtccactcatttagagatactgaacctacagggtgaaattgaaattttaaggtctt840
tcaatgaataccaaattcgcgccgccaaacaacaacttggactggacatcgtatatgaac900
tacagggtaatgttcagacaacctcaaagaatgattttgattcccgcggcaataatggta960
acatgaccttcaattactacgcaaacacttatcagaattcagtagacttctcgacctcct1020
cgtcggcgtcaggcgccggacccgggaactcccggggcggattagcgggtctcctcacaa1080
atttcagtggaatcttgaaccctcttggctacctcaaagaccacaataccgaagaaatgg1140
aaaactctgctgatcgagtcataacacaaacggcgggcaacactgccataaacacgcaat1200
catcactgggtgtgttgtgtgcctacgttgaagacccgaccaaatctgaccctccgtcca1260
gcagcacagatcaacccaccaccacttttactgccatcgacaggtggtacactggacgcc1320
tcaattcttggacaaaagctgtaaaaaccttctcttttcaggccgtcccgctccctggag1380
ccttcctgtctagacagggaggcctcaatggaggggccttcacggctaccctacatagac1440
atttcttaatgaagtgcgggtggcaggtgcaggtccaatgcaatttgacacaattccacc1500
aaggtgctcttcttgttgccatggtccccgaaaccacccttgatgtcaagcccgacggca1560
aggcaaagagcctacaggagctgaatgaagagcagtgggtagaaatgtctgacgattacc1620
ggaccgggaaaaacatgccttttcagtctcttggcacatactatcggccccctaactgga1680
cttggggccctaatttcatcaacccctatcaagtaacagttttcccacaccaaattctga1740
acgcgagaacctctacctcggtagacataagtgtcccatacatcggggagactcctacac1800
aatcctcagagacacagaactcctggaccctcctcgttatggtgcttgtccccctggact1860
acaaggagggagccacaactgacccagaaattacattttccgtaaggcctacaagtcctt1920
acttcaatgggcttcgtaaccgctacacgaccgggacggacgaggaacaggggcccattc1980
ccacagcacccagagaaaattcgcttatgtttctctcgaccatccctgacgacactgtcc2040
ctgcttacgggaatgtgcgtacccctcccgtcaattaccttcctggtgaaataaccgacc2100
tcttacaactggcccgtatacccactctcatggcgtttgggcgggtgcctgaacctgaac2160
ctgcctcagacgcttatgtgccctacgttgccgttcccacccagttcgatgacaagcctc2220
tcatctccttcccgatcaccctttcagatcctgtctaccagaatactctggtaggcgcca2280
tcagttcaaatttcgccaactaccgggggtgtatccaaatcactctgacattttgtggac2340
ctatgatggcaagagggaaattcctactctcgtattctcccccaaatggaacacaaccac2400
agaccctttctgaagccatgcagtgcacatattctatttgggatataggcttaaactcta2460
gttggacctttgtcatcccctacatctcgcccagtgactaccgtgaaactcgggccatta2520
ccaattcggtttattctgctgatggctggtttagcctgcacaagctgaccaaaattactc2580
taccacctgattgcccacagagcccctgtattctctttttcgcctctgctggtgaggatt2640
acaccctccgtctccccgttgattgtaatccttcttatgtgttccactccaccgacaacg2700
ccgagactggggttattgaggcgggtaacactgacaccgatttctctggtgaattggcgg2760
ctcctggctctaaccacactaatgtcaagttcctgtttgaccgatctcgattactgaatg2820
taattaaggtactggagaaggacgccgtcttcccccgccctttccccacagcaactggta2880
cacaacaggacgatggttacttttgtcttctaacaccccgcccaacagtcgcctcccgac2940
ccgccactcgtttcggcctgtacgtcagtccgtctgacagtggcgttctcgccaacactt3000
cactggatttcaatttttacagcttggcctgtttcacttactttagatcagaccttgaag3060
tcacggtggtctcactggagccagatctggaattcgctgtagggtggttcccctctggca3120
gtgagtaccaggcttccagctttgtctacgaccaactgcatgtaccctaccactttactg3180
ggcgcactccccgcgctttcgccagcaagggtgggaaggtatctttcgtgctcccttgga3240
actctgtctcatccgtgcttcccgtgcgctgggggggcgcttccaagctttcttctgcca3300
cgcggggtctgccggctcatgctgactgggggactatttacgcctttatcccccgtccca3360
acgagaagaaaagcaccgctgtaaagcatgtggccgtgtacgttcggtacaagaacgcgc3420
gtgcctggtgccccagcatgcttccctttcgcagctacaagcagaagatgctgatgcaat3480
caggcgacgtcgagaccaacccaggccctgcttctgacaacccaatcttggaatttcttg3540
aagcagaaaatgatctagtcactctggcctctctctggaagatggtacactctgttcaac3600
agacctggagaaagtatgtgaagaacgacaatttttggcccaatttactcagtgagttag3660
tgggggaaggctccatcgccttggccgccacgctgtctaaccaagcttcagtaaaagctc3720
tcttgggcctgcattttctctctcgagggctcaattacacagacttttactctttactga3780
tagagaaatgctctagtttctttactgtagaaccgcctcctccaccagctgaaaatctga3840
tgaccaagccctccgtgaagtcgaaattccgaaagctgtttaagatgcaaggacccatgg3900
acaaagtcaaagactggaaccaaatagccgccggcttgaagaattttcaatttgttcgtg3960
acctagtcaaagaggtggtcgactggctccaggcctggatcaacaaagagaaagccagcc4020
ctgtcctccagtaccagttggagatgaagaagctcgggcccgtggctttggctcatgatg4080
ccttcatggccggttccgggccccctcttagtgacgaccagattgaatacctccaaaacc4140
tcaaatctcttgccctaacactggggaagactaatttggcccaaagtctcaccactatga4200
tcaatgccaagcgagctcccgcccaacgagtcgaacccgttgtggtggtcctcagaggca4260
agccgggatgcggcaagagcttggcctccacgttgattgcccaggctgtgtccaagcgtc4320
tctacggctcacaaagtgtgtattctcttcctccggacccagacttcttcgacggataca4380
aaggacagtttgtaaccttgatggatgatttgggacaaaacccggatgggcaagatttct4440
ccaccttttgtcagatggtgtcgaccgcccaatttcttcccaacatggcggaccttgcag4500
agaaggggcgcccctttacctccaatcttatcattgcaactacaaacctcccccacttca4560
gccctgtcaccattgctgatccttctgcggtctctcgtcggatcaactacgacttgactc4620
tagaagtatctgaggcctacaaaaagcacacacggctgaattttgacctggctttcaggc4680
gcacagacgccccccccatttatccttttgctgcccatgtgcctttcgtggacgtggctg4740
tgcgcttcaaaaatggccaccagagcttcaatctcctagagttggtcgactctatttgtg4800
cagacattcgagccaagcaacaaggtgcccgaaatatgcagactctagttctacagagcc4860
ctaacgagaatgatgacacccccgtcgacgaggcgctgggtagagttctcactcccgctg4920
cggtcgacgaggcgcttgtcgacctcgctcaagaggccgatccggttggccgcttggcta4980
ttcttgccaaactaggtcttgctctagctgcggtcacccccggcttgataatcttggcag5040
tgggactctataggtacttctctggctctgatgcagaccaagaagaaacggaaagtgagg5100
aacctgctaaagcgcctaggagcgagaatgcttatgacggcccgaagaaaaactctaagc5160
cccctggagcgctctctcttatggaaatgcaacagcccaacgtggacatgggctttgagg5220
ctgcggtcgctaagaaagtggtcgtccccattacattcatggttcccaacagaccttctg5280
gacttacacagtccgcccttcttgtggccggccggaccttcctaattaatgagcatacat5340
ggtccaacccctcctggaccagtttcacaatccgtggtgaggtgcacactcgtgatgagc5400
ctttccaaacggttcattttactcaccatggtgttcccacagacctgatgatggtacgtc5460
tcggaccgggcaactctttccctaacaatctagacaagtttggacttgaccagatgccgg5520
cacgtaactcccgtgtggttggcgtttcggctagttacggtaatttcttcttctctggga5580
atttccttgggtttgttgactccatcacctctgaacaaggaacttatgcaagacttttta5640
ggtacagggtgaccacctacaagggatggtgcggttcggccctggtctgtgaggccggtg5700
gtgtccggcgcatcattggcctgcattctgctggtgccgctggtatcggcgccgggacct5760
acatctcaaaattaggactgatcaaagcccttaaacacctcggtgaacctctggctacaa5820
tgcaaggactgatgactgagctagagcctggagtcaccgtgcatgtaccccggaaatcta5880
aattgagaaagacgaccgcacacgcggtgtacaaaccggagtttgaacctgctgtgttgt5940
caaaatttgatcccagactgaacaaggatgttgacctagatgaggtaatttggtctaaac6000
acactgccaacgtcccttatcaacctcctttgttctacacatacatgtcagagtacgctc6060
atcgggttttctcctttttgggaaaagacaatgacattctgaccgttaaagaagcaatcc6120
tgggcatccctggactagaccctatggatccccacacagctccgggtctgccctacgcca6180
ttagcggccttcgacgtactgatctcgtcgattttgtgaacggtacggtagacgcagcac6240
tggccatgcaaatccagaaattcttagacggtgactactctgatcatgtcttccaaactt6300
ttctgaaagatgaaatcagaccctcagagaaggtccgagcgggaaaaacccgcattgtcg6360
atgtgccctccctggcacactgcattgtgggcagaatgctgctcgggcgtttcgccgcca6420
agtttcaatcccatcccggctttcttcttggttctgctatcgggtccgaccctgatgtct6480
tctggaccgtcataggggctcagctcgagggaagaaagaacacgtacgacgtggactaca6540
gtgcctttgactcttcacacggcactggctccttcgaggctctcatctctcactttttca6600
ccgttgacaatggttttagccctgcgctgggaccgtatctcagatccctggctgtctcgg6660
tgcacgcttacggcgagcgtcgcatcaagattaccggaggccttccctctggttgtgccg6720
cgaccagccttctgaacacagtgctcaacaatgtgatcatcaggactgctctggcattga6780
cttacaaggaatttgagtatgacatggttgatatcatcgcctacggtgacgaccttttgg6840
ttggtacggattatgatctggacttcaatgaagtggcgcggcgcgctgccaaactggggt6900
ataagatgactcctgccaacaagggttccgtcttccctccgacttcctctctctccgatg6960
ctgtttttctaaaacgcaaattcgtccaaaacaatgacggcttatataaaccagttatgg7020
atttaaagaatttggaagccatgctctcctacttcaaaccaggaacactactcgagaagc7080
tgcaatctgtttctatgttggctcaacattctggaaaagaagaatatgatagattgatgc7140
accccttcgctgactacggtgccgtaccgagtcacgagtacctgcaggcaagatggaggg7200
ccttgttcgattgacctagatagcccaacgcgcttcggtgccgccggcgattctgggaga7260
actctgtcggaacagaaaagggaaaaaaaaaaa7293