一种基于枯草芽孢载体的幽门螺杆菌口服疫苗的制作方法

技术领域：

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种基于枯草芽孢载体的幽门螺杆菌口服疫苗。

背景技术：
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幽门螺杆菌(helicobacterpylori)为上消化道疾病的主要致病菌，它的感染不但与胃炎、胃溃疡及非溃疡性消化不良有关，而且与黏膜相关性淋巴组织(malt)淋巴瘤和胃癌也有重要关系。hp在全球人群的慢性感染率达50％以上，我国人群的平均感染率高达58.07％，其严重危害着人类的健康安全。

hp感染的治疗多采用质子泵抑制剂外加两种抗生素的“三联”疗法。尽管此方案能有效地清除已感染的hp，但存在诱导耐药菌株流行、药物副作用、费用较高和病人依从性差等问题。因此，接种hp疫苗是预防和控制hp感染的有效措施。

但是，蛋白疫苗经口服接种，由于要通过胃酸屏障和消化道严苛的环境，免疫原性都很弱。故使用适宜胃肠道定植微生物作为口服疫苗载体，为研制hp疫苗的有效途径。而目前hp疫苗研制所采用的消化道疫苗递送系统(载体系统)，一般是消化道减毒细菌(如伤寒)或病毒，但它们仍然存在回复突变和安全性问题。主要存在以下的缺陷：①现hp全菌疫苗主要成分为菌体超声破碎物和甲醛灭活的全菌体。使用甲醛灭活后的hpss1全菌体与黏膜免疫佐剂霍乱毒素(ct)免疫小鼠，发现其能有效抑制hp感染并控制再次感染。但是hp全菌体粗制抗原成分复杂，存在副作用较大、免疫效果差、易通过交叉免疫反应导致自身免疫性疾病及肠道菌群失调、不易标准化等缺点，不适用于人体接种。同时，hp为微需氧菌，在培养时对氧含量、营养、温度、湿度等条件要求非常严苛，且培养时间长，费用高，产量低，不适于大规模培养生产。因此，hp全菌体疫苗的开发不具现实意义。②亚单位抗原具结构简单、安全性好、适于工业化生产等优点。但是蛋白疫苗经口服，难以通过胃肠道严苛环境，大部分蛋白降解，降低了免疫原性。

枯草芽孢作为口服型疫苗载体，具有很多常规疫苗载体不可比拟的优点：它的生物安全性高：其属革兰阳性菌，不产生毒素，而且还是常用的益生菌之一，已用为人的功能性食品、动物饲料添加剂等。①枯草芽孢杆菌能产生多种消化酶，其具有较强的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，同时还具有降解复杂碳水化合物的酶，如果胶、葡聚糖、纤维素等酶，帮助对营养物质的消化吸收。②枯草芽孢杆菌能产生多种营养物质，其能够合成多种维生素如尼克酸、叶酸、烟酸、维生素b1、b2、b6、b12等，促进机体对蛋白质的消化、吸收。③枯草芽孢杆菌产生抗生素和细菌素，可通过拮抗作用抑制致病菌的生长，从而起到防治疾病的效果。④枯草芽孢有独特的免疫学特性：口服的芽孢在动物肠道能被胃肠道相关淋巴组织(malt)识别，发挥免疫佐剂作用，活化肠粘膜上的相关淋巴组织，使分泌型(siga)抗体分泌增强，提高免疫识别能力，并诱导t、b淋巴细胞和巨噬细胞产生细胞因子，通过淋巴细胞再循环而活化全身免疫系统，从而增强机体的非特异性和特异性免疫系统。

霍乱毒素choleratoxin(ct)是由霍乱弧菌产生的外毒素，是霍乱弧菌的主要致病因子，具有a、b两个亚单位。其中a亚单位(cta)具有adp核糖基转移酶活性，是毒素的活性中心。5个b亚单位(ctb)装配成五聚体，以高亲和力结合表达于有核细胞细胞膜上的gml神经节苷酯，为球形a亚单位结合细胞表面受体后内化所必需。ct虽能有效增强针对抗原的局部免疫和系统免疫，但是由于其毒性，限制了其应用。霍乱毒素b亚单位无毒性，具有很强的免疫原性，能刺激产生黏膜iga和血清igg抗体，具有能加强抗原表位的抗原性的特点，故本发明使用ctb作为疫苗佐剂。

技术实现要素：
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本发明的目的是提供一种廉价、安全、高效的基于枯草芽孢载体的幽门螺杆菌口服疫苗及其构建方法。

本发明是使用益生菌枯草芽孢杆菌作为载体，ctb作为佐剂，将ctb与hpureb融合表达于枯草芽孢表面，使用重组枯草芽孢对幽门螺杆菌感染进行预防。具体是将粘膜佐剂霍乱毒素b(ctb)与hp疫苗分子尿素酶b(ureb)融合表达于枯草芽孢表面，构建表面表达ctb-ureb芽孢疫苗。

本发明的基于枯草芽孢载体的幽门螺杆菌口服疫苗，其特征在于，其是将cotc-ureb或cotc-ctb-ureb基因片段转入表达载体中，然后将含有cotc-ureb或cotc-ctb-ureb的表达载体转化进入枯草芽孢杆菌中，从而得到基于枯草芽孢载体的幽门螺杆菌口服疫苗，所述的cotc的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述的ctb的核苷酸序列如seqidno.2所示，所述的ureb的核苷酸序列如seqidno.3所示。

所述的cotc-ureb是将cotc基因片段的3’端与ureb基因片段的5’端相连，所述的cotc-ctb-ureb是将cotc基因片段的3’端与ctb基因片段的5’端相连，然后将ctb基因片段的3’端相连与ureb基因片段的5’端相连。

所述的表达载体优选的与芽孢外壳蛋白cotc融合表达载体pus186-cotc。

本发明的有益效果如下：

1、作为益生菌，口服枯草芽孢杆菌可直接补充正常生理菌丛，抑制致病菌，促进营养物质的消化、吸收，抑制肠源性毒素的产生和吸收，达到调整肠道内菌群失调的目的。我们采用其作为hp疫苗的载体，一方面可发挥其益生功能，同时可对人类普遍感染、且具严重危害性的hp进行预防。将起到一举两得的效果。该疫苗形式具有良好安全性，独特的抗性及免疫学特征，是针对消化道感染病原体的理想疫苗形式，该疫苗使用方便，便于推广。

2、本发明首次将粘膜佐剂霍乱毒素b与幽门螺杆菌ureb融合表达于枯草芽孢表面，以增强重组ure枯草芽孢诱导小鼠特异性粘膜免疫，并使用重组枯草芽孢对hp进行预防探索。

附图说明：

图1是重组pet28actb-ureb质粒双酶切鉴定，其中lane1：marker；lane2：pet28actb-ureb经ecori、noti双酶切；lane3：pet28a质粒经ecori、noti双酶切；

图2是重组pus186cotc－ctb－ureb质粒双酶切鉴定，其中lane1：marker；lane2：pus186cotc－ctb-ureb经xbali、psti双酶切。

图3是芽孢外壳蛋白sds-page及westernblotting分析，a)芽孢外壳蛋白sds-page；b)芽孢外壳蛋白westernblotting分析，箭头所指为融合蛋白，lane1：marker；lane2：pus186cotc-ctb/wb600芽孢；lane3：pus186cotc-ureb/wb600芽孢；lane4.pus186cotc-ctb-ureb/wb600芽孢；lane5：pus186cotc/wb600芽孢；

图4是重组芽孢口服免疫升高小鼠ureb血清特异性igg及粪便特异性iga，a)血清ureb特异性igg；b)ureb粪便特异性iga(**p<0.01与cotc组比较)，其中naive表示阴性对照蒸馏水灌胃，cotc表示枯草质粒菌pus186cotc/wb600芽孢灌胃，cotc-ctb表示枯草质粒菌pus186cotc-ctb/wb600芽孢灌胃，cotc-ureb表示枯草质粒菌pus186cotc-ureb/wb600芽孢灌胃，cotc-ctb-ureb表示枯草质粒菌pus186cotc-ctb-ureb/wb600芽孢灌胃。

图5是脾细胞细胞因子水平，ureb与脾细胞培养72helisa检测il-4，ifn-γ，il-10(**p<0.01,*p<0.05.)，其中naive表示阴性对照蒸馏水灌胃组，cotc表示枯草质粒菌pus186cotc/wb600芽孢灌胃组，cotc-ctb表示枯草质粒菌pus186cotc-ctb/wb600芽孢灌胃组，cotc-ureb表示枯草质粒菌pus186cotc-ureb/wb600芽孢灌胃组，cotc-ctb-ureb表示枯草质粒菌pus186cotc-ctb-ureb/wb600芽孢灌胃组。

图6是重组芽孢口服降低免疫小鼠胃hp感染数量(**p<0.01,*p<0.05.)，其中naive表示阴性对照蒸馏水灌胃组，cotc表示枯草质粒菌pus186cotc/wb600芽孢灌胃组，cotc-ctb表示枯草质粒菌pus186cotc-ctb/wb600芽孢灌胃组，cotc-ureb表示枯草质粒菌pus186cotc-ureb/wb600芽孢灌胃组，cotc-ctb-ureb表示枯草质粒菌pus186cotc-ctb-ureb/wb600芽孢灌胃组。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

所述的cotc的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述的ctb的核苷酸序列如seqidno.2所示，所述的ureb的核苷酸序列如seqidno.3所示

1、ctb，ureb，ctb-ure在大肠杆菌质粒pet28a的克隆

合成ctb碱基序列，使用特异性引物(p1：cgaggatccacacctcaaaatattactgat；p2：ccgaagcttttaatttgccatactaatt)扩增ctb基因，克隆入pet28a质粒。提取幽门螺杆菌基因组dna，使用特异性引物(p1:5′-cgcgtcgacatgaaaaagattagcagaaaagaa-3′；p2:5′-aaagcggccgcctagaaaatgctaaagagttgt-3′)扩增ureb基因，克隆入pet28a质粒，得到pet28a-ureb。使用相似策略，将ctb克隆入pet28a-ureb的ureb5’端(引物p1：5′-cgcgaattcacacctcaaaatattactgatttg-3′；p2：5′-cgagtcgacatttgccatactaattgcggcaa-3′)，构建pet28a-ctb-ureb质粒(即ctb的3’端与ureb5’端相连)，使用ecori、noti对重组pet28a-ctb-ureb质粒双酶切获得ctb－ureb基因片段，与预期一致(图1)，基因序列分析验证了融合基因在pet28a质粒克隆成功。

2、ctb，ureb，ctb-ureb在枯草杆菌质粒pus186-cotc的克隆

使用已构建的重组pet28a-ctb-ureb质粒为模板，扩增出ctb(引物:p1:5′-cggtctagagacacctcaaaatattactgatt-3′；p2：5′-ccgaagcttttaatttgccatactaatt-3′)，ureb(引物p1:5′-cgctctagacatgaaaaagattagcagaaaag-3′；p2:cgcctgcagctagaaaatgctaaagagttgtg)，ctb-ureb(引物：p1:5′-cgctctagacacacctcaaaatattactg-3′；p2:5′-cacctgcagctagaaaatgctaaagagttgt-3′)基因片段，再克隆入枯草杆菌质粒pus186-cotc，由此分别得到pus186cotc-ctb、pus186cotc-ureb和pus186cotc－ctb－ureb质粒。使用xbali、psti对重组pus186cotc－ctb－ureb质粒双酶切获得ctb－ureb基因片段，与预期一致(图2)，基因序列分析验证了融合基因ctb,ureb,ctb－ureb在pus186cotc质粒克隆成功。

3、ctb，ureb，ctb－ureb融合蛋白在枯草芽孢上的表达

将pus186-cotc、pus186cotc-ctb、pus186cotc-ureb和pus186cotc－ctb－ureb质粒分别转化进入枯草芽孢杆菌wb600中，由此分别得到枯草质粒菌pus186cotc/wb600，pus186cotc-ctb/wb600,pus186cotc-ureb/wb600,pus186cotc-ctb-ureb/wb600。

芽孢的诱导生成：将枯草质粒菌pus186cotc/wb600，pus186cotc-ctb/wb600,pus186cotc-ureb/wb600,pus186cotc-ctb-ureb/wb600划线接种于lb板(含kana20μg/ml)，37℃培养过夜，挑取单克隆菌落接种于5mllb培养液(含kana20μg/ml)，37℃摇床培养过夜。按1:100接种dsm芽孢培养基(difcosporulationmedium)，37℃250r/min摇床培养24h后收集芽孢。

使用sds-dtt液及溶菌酶去除枯草芽孢杆菌繁殖体，超声使枯草芽孢杆菌破壁。每10¹⁰个芽孢所提取外壳蛋白约0.39mg，相当于每个芽孢0.039pg，由此分别得到表达cotc-ctb重组芽孢(对应pus186cotc-ctb/wb600)、表达cotc-ureb重组芽孢(对应pus186cotc-ureb/wb600)、表达cotc-ctb-ureb重组芽孢(对应pus186cotc-ctb-ureb/wb600)。cotc基因编码的蛋白质分子量为8.8kda，ctb、ureb的分子量分别为12kda、61kda，表达的重组cotc-ctb、cotc-ureb、cotc-ctb-ureb的预测分子量分别为20.8、69.8、81.8，12％sds-page显示，3融合蛋白在预期的分子量范围都可见清晰目的条带(图3a)。使用相应的抗血清，westernblotting能检测到特异性识别条带(图3b)。

特异性免疫血清的制备：以100μg纯化的重组ctb蛋白或ureb蛋白(在pet/e.coli表达体系表达、纯化)与等体积弗氏完全佐剂分别混匀，背部、足垫部位皮下注射免疫sd大鼠；相同方法，间隔2周进行第2次加强免疫(以相同剂量加不完全弗氏完全佐剂)；间隔2周进行最后一次加强免疫(不加佐剂)。末次免疫后一周采集血液，分离血清储存于-20℃备用。

4、口服ctb-ureb重组芽孢诱导小鼠免疫反应

分别用1×10⁸个芽孢(枯草质粒菌pus186cotc/wb600，pus186cotc-ctb/wb600,pus186cotc-ureb/wb600或pus186cotc-ctb-ureb/wb600)在第0、1、2、16、17、18、33、34、35天用灌胃针经口免疫各组小鼠，口服重组枯草芽孢免疫第2周；cotc-ureb(对应枯草质粒菌pus186cotc-ureb/wb600)；cotc-ctb-ureb(对应枯草质粒菌pus186cotc-ctb-ureb/wb600)口服组小鼠血清ureb特异性igg已显著升高，第4周达到高峰(图4a)。cotc-ureb，cotc-ctb-ureb口服组小鼠粪便特异性iga在第2周也已显著升高(图4b)，第4周达到高峰，并且cotc-ctb-ureb组显著高于cotc-ureb。naive，cotc-ctb与cotc组比较，血清特异性igg及粪便特异性iga均未见升高。表明ureb重组枯草芽孢能诱导针对融合抗原的粘膜及系统反应。

5、口服重组芽孢小鼠脾细胞ifn-γ，il-10，il-4水平

hp攻击四周后断颈处死小鼠，分离脾细胞(4×10⁶/well/ml)与重组ureb蛋白(2.5μg/ml)共培养72h，elisa检测培养上清ifn-γ、il-10、il-4水平，与cotc组相比，cotc-ctb、cotc-ureb、cotc-ctb-ureb免疫小鼠il-10，ifn-γ显著升高(cotc-ctb-urebvscotc，p<0.01；cotc-ctb，cotc-urebvscotc，p<0.05)；并且，cotc-ctb-ureb组所产生il-10，ifn-γ显著高于cotc-ctb、cotc-ureb组(p<0.05)；然而，重组il-4水平各组无差异(图5)。

6、口服ctb-ureb重组芽孢诱导小鼠抵抗hp攻击感染

灌胃口服(枯草质粒菌pus186cotc/wb600，pus186cotc-ctb/wb600,pus186cotc-ureb/wb600或pus186cotc-ctb-ureb/wb600芽孢)末次免疫2周后，每只小鼠灌胃口服3×10⁸个h.pss1株，攻击四周后断颈处死小鼠。与cotc芽孢免疫组比较，cotc-ctb-ureb及cotc-ureb重组芽孢口服免疫小鼠可显著降低hp攻击后的hp胃载量(p<0.01)(hp胃载量分别为:cotc组5.56±1.64×10⁵cfu/g；cotc-ureb组1.11±0.36×10⁵cfu/g；cotc-ctb-ureb组0.53±0.21×10⁵cfu/g)(图6)。cotc组与cotc-ctb组及组无差异(p>0.05)。并且，cotc-ctb-ureb芽孢免疫组胃载量显著低于cotc-ureb(p<0.05)。

序列表

<110>周珍文

<120>一种基于枯草芽孢载体的幽门螺杆菌口服疫苗

<160>3

<210>1

<211>377

<212>dna

<213>枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）

<400>1

tgtaggataaatcgtttgggccgatgaaaaatcggctctttattttgatttgtttttgtg60

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<213>霍乱弧菌(vibriocholerae)

<400>2

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<213>幽门螺杆菌（helicobacterpylori）

<400>3

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