一种A型赛尼卡谷病毒样颗粒疫苗及其制备方法和用途与流程

本发明涉及一种a型赛尼卡谷病毒样颗粒疫苗及其制备方法，属于生物医药技术领域。

背景技术：

a型塞尼卡谷病毒(senecavalleyvirusa，sva)属于小rna病毒科赛尼卡谷病毒属，病毒基因组为单股正链rna，约由7800个核苷酸组成。在美洲、中国引起猪的水疱病和仔猪死亡。设计sva病毒样颗粒疫苗以应对sva疾病的血清学检验和防控至关重要。

病毒样颗粒疫苗保持了病毒灭活疫苗的良好免疫原性，并且具有高度安全性，可区别感染和免疫(diva)，其生产过程中避免使了用活的病毒，可以通过无血清悬浮培养。

杆状病毒表达质粒系统(baculovirusexpressionvectorsystem，bevs)是高效抗原制备技术之一。使用杆状病毒表达盒在昆虫细胞生产病毒样颗粒抗原。表达盒产出病毒样颗粒抗原量高出300％倍，vlps在大小、形态、功能上一致。表达盒的简单修饰改造显著改善vlp-为基础疫苗造价/效率，有助于塞尼卡谷病毒样颗粒疫苗商业竞争和广泛使用。

杆状病毒载体用于重组蛋白和疫苗抗原生产，普遍采用自养性加利福尼亚多核多角体病毒(autographacalifornicamultinuclearpolyhedrosisvirus，acmnpv)。自杆状病毒表达载体系统(baculovirusexpressionvectorsystem，bevs)在80年代开发成功以来，许多重组蛋白，从细胞内酶到膜结合蛋白已在杆状病毒感染的昆虫细胞成功表达。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种a型赛尼卡谷病毒样颗粒疫苗及其高产方法，为达到上述目的，本发明提供了含新型表达盒的重组杆状病毒，提供了无血清悬浮培养驯化昆虫细胞sfhi5ph，提供了提供稳定、高效、质量可控生产a型赛尼卡谷病毒颗粒的方法，同时提供了生产a型赛尼卡谷病毒颗粒疫苗的检验和评估方法。

具体的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种a型塞尼卡谷病毒样颗粒疫苗，其有效成分为a型塞尼卡谷病毒样颗粒，所述的a型塞尼卡谷病毒样颗粒是由a型塞尼卡谷病毒p1-p2-p3的基因序列通过杆状病毒表达系统表达、组装、纯化后得到，其中，所述的a型塞尼卡谷病毒p1-p2-p3的基因序列如seqidno.1所示。

进一步的，本发明还提供了一种制备所述的a型塞尼卡谷病毒样颗粒疫苗的常规方法以及一种在常规方法基础上通过改进后的高产方法：

一种制备所述的a型塞尼卡谷病毒样颗粒疫苗的常规方法，包括以下步骤：

(1)将a型塞尼卡谷病毒p1-p2-p3的基因序列插入昆虫杆状病毒pfastbac1或pfastbac-dual载体中，经酶切鉴定及测序，筛选出阳性重组载体，并转化含有杆状病毒穿梭载体的dh10bac感受态细胞，获得重组杆状病毒穿梭载体rbacmid；

(2)将含a型塞尼卡谷病毒p1-p2-p3的基因序列的重组杆状病毒穿梭载体rbacmid转染入宿主昆虫细胞株hi5中，获得重组昆虫杆状病毒，命名为acmnpv-sva-p1-p2-p3；

(3)培养由重组昆虫杆状病毒acmnpv-sva-p1-p2-p3转染的宿主昆虫细胞hi5，使其表达a型塞尼卡谷病毒的结构蛋白，并自动组装成a型塞尼卡谷病毒样颗粒，纯化获得该a型塞尼卡谷病毒样颗粒蛋白；

(4)a型塞尼卡谷病毒样颗粒疫苗的配制

将步骤(3)纯化得到的a型塞尼卡谷病毒样颗粒蛋白与佐剂混合，制备得到所述的a型塞尼卡谷病毒样颗粒疫苗。

一种制备所述的a型塞尼卡谷病毒样颗粒疫苗的高产方法，包括以下步骤：

(1)表达a型塞尼卡谷病毒外壳蛋白的重组载体的构建

所述载体的表达盒包括编码杆状病毒顺式激活因子ie1和ie0的cdna、杆状病毒增强子序列hr1以及编码用于表达病毒样颗粒的a型塞尼卡谷病毒p1-p2-p3的基因序列，其中，所述的编码杆状病毒顺式激活因子ie1和ie0的cdna在polh启动子或pb29控制下表达，所述的编码用于表达病毒样颗粒的a型塞尼卡谷病毒p1-p2-p3的基因序列在启动子p6.9和启动子p10组成的联合启动子控制下表达；

(2)重组杆状病毒穿梭载体rbacmid的获得

将步骤(1)构建得到的表达a型塞尼卡谷病毒外壳蛋白的重组载体转化含有杆状病毒穿梭载体的dh10bac感受态细胞，获得重组杆状病毒穿梭载体rbacmid；

(3)重组昆虫杆状病毒的获得

将含a型塞尼卡谷病毒p1-p2-p3的基因序列的重组杆状病毒穿梭载体rbacmid转染入宿主昆虫细胞株hi5中，获得重组昆虫杆状病毒，命名为acmnpv-sva-p1-p2-p3；

(4)a型塞尼卡谷病毒样颗粒的表达及纯化

培养受重组昆虫杆状病毒acmnpv-sva-p1-p2-p3转染的宿主昆虫细胞hi5，使其表达a型塞尼卡谷病毒的结构蛋白，并自动组装成a型塞尼卡谷病毒样颗粒，纯化获得该a型塞尼卡谷病毒样颗粒；

(5)a型塞尼卡谷病毒病毒样颗粒疫苗的配制

将步骤(4)纯化得到的a型塞尼卡谷病毒样颗粒蛋白与佐剂混合，制备得到所述的a型塞尼卡谷病毒样颗粒疫苗。

在本发明所述的高产方法中，优选的，所述的编码杆状病毒顺式激活因子ie1和ie0的cdna的genbank登录号为nc_001623。

在本发明所述的高产方法中，优选的，所述的载体的骨架部分由pfastbacdual提供；

在本发明所述的高产方法中，优选的，所述的编码用于表达病毒样颗粒的a型塞尼卡谷病毒p1-p2-p3的基因序列如seqidno.1所示。

在本发明所述的高产方法中，优选的，步骤(4)中所述的昆虫细胞hi5为适应高ph培养基的hi5细胞，所述的培养基的ph值为7.0–7.4。

在本发明所述的高产方法中，优选的，步骤(4)中a型塞尼卡谷病毒样颗粒的制备是按照以下方法进行：采用sf-900ii无血清培养基培养适应高ph培养基的hi5细胞，使其密度达到3.6×10⁶活细胞/ml，按moi＝0.1pfu/细胞接种重组杆状病毒acmnpv-sva-p1-p2-p3，采用摇瓶或者搅拌式生物反应器在高ph条件下进行培养，125ml通气摇瓶接种35ml，2l的通气摇瓶接种300ml，培养温度为27℃、转速80-100rpm，培养24小时后，离心除去sf-900ii培养基，用ph7.0-7.4的sf-900ii-besmiss彻底换液，重悬于sf-900ii-besmiss继续培养48-96h，期间加入1nnaoh，不断取样用校准的ph计监测使培养基ph维持在7.0–7.4。

在本发明所述的高产方法中，优选的，所述的佐剂为cpgdna佐剂。

进一步的，本发明还提出了所述的a型塞尼卡谷病毒样颗粒疫苗在制备预防a型塞尼卡谷病毒感染的药物中的用途。

相较于现有技术，本发明的有益效果在于：

(1)本发明利用杆状病毒级联反应基因调节元件构建杆状病毒载体表达盒，命名为liv，使得杆状病毒表达svap1-p2-p3形成的vlps产量显著提高。该表达盒含杆状病毒顺式激活因子ie1和ie0的cdna，在polh启动子控制下表达；也包含同源重复转录增强子序列反式连到p6.9和p10的联合启动子，可使携有表达盒的杆状病毒长期滞留细胞，减小蛋白酶作用、也减少异常重组蛋白复合体的发生频率。

(2)采用本发明构建的表达盒表达sva-p1-p2-p3形成vlps，hi5细胞悬浮培养得到的病毒样颗粒的量是标准杆状病毒(polh启动子)的3倍，产率的提高但没有改变vlps的大小和形态，且liv(+)杆状病毒较早表达重组蛋白，延长感染细胞表达至少24小时。

(3)采用本发明构建的表达盒表达sva-p1-p2-p3形成vlps，显著增强了bevs生产svavlps生产效率，降低了亚单位疫苗的生产成本。

(4)本发明采用昆虫细胞hi5，特别是驯化了的适应高ph条件下无血清培养的昆虫细胞hi5，其能够高表达生产病毒样颗粒，病毒样颗粒产量进一步提升。

(5)cpg佐剂可激发体内非特异性的体液和细胞免疫反应，是候选的新型疫苗佐剂。

附图说明

图1为znwt-01-2015全长感染性克隆的构建示意图；

图2为liv表达盒的构建示意图；

图3为常规重组质粒表达盒的示意图；

图4为liv3表达盒的构建示意图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1通过杆状病毒表达系统制备sva病毒样颗粒

1.材料和方法

1.1细胞培养和病毒

昆虫细胞系hi5(trichoplusianibti-tn-5b1–4，highfive)购自美国invitrogen公司，培养温度为27℃，培养基(tnmfh培养基+10％热灭活胎牛血清+庆大霉素(50μg/ml))购自德国panbiotechgmbh公司。bac-to-bac杆状病毒表达系统以及cellfectinhii试剂购自美国invitrogen公司。

hi-5细胞密度和活力采用台盼蓝染色计数和观察。以感染后不同时间活细胞占总细胞的百分比计算细胞活力。hi-5细胞悬浮培养，细胞密度5x10⁶/ml，细胞活力为99％时进行感染。转瓶进行hi-5细胞单层培养时，细胞密度2x10⁶/ml，细胞活力为95％时进行病毒感染。

1.2.改造表达盒提高sva病毒样颗粒的产量

按照acmnpv全基因组，人工合成ac-ie-01cdna(acmnpv全基因组序列,genbank登录号nc_001623)，插入pfasbac1的bamhi和xbai酶切位点之间获得质粒polhac-ie-01。通过人工合成hr1pb29p10(liv1)、hr1polh(liv2)、hr1p6.9p10(liv3)、hr1p10(liv4)、hr1polhp10(liv5)和hr1p6.9(liv6)dna序列，克隆于pfastbacdual质粒bstz17i和xbai位点之间，得到一系列含有不同启动子的pfastbacdual重组载体，命名为pfaslivbacdual，同时polhac-ie-01序列插入pfaslivbacdual质粒bstz17i和pvuii酶切位点之间。图2为liv表达盒的构建示意图。ac-ie-01cdna也可在pb29启动子控制下通过人工合成，即将polh替换为pb29。

1.3赛尼卡谷病毒样颗粒的制备

(1)赛尼卡谷病毒样颗粒基因克隆

经fmdv、svdv、svv的rt-pcr检测阴性，svart-pcr检测为阳性猪水泡液用高度纯化病毒rna试剂盒(购自rochediagnostics,中国)提取总rna，用随机引物和转录高保真cdna合成试剂盒(rochediagnostics,中国)合成第一链cdna。为构建全长感染性cdna克隆，采用铂金taq高保真多聚酶(lifetechnologies,中国)，以基因库中加拿大分离毒(基因登记号no.kc667560)序列为模板设计引物(见表1)，通过rt-pcr获得的a-e5个片段，用含有独特的限制酶切位点引物多聚酶(lifetechnologies,中国)扩增，依次将片段a-e、poly(a)插入带有sv40启动子的psvl载体(pharmaciabiotech,wi,usa)：片段a用限制性酶sphi/saci插入质粒，后续片段b、片段c、片段e用nebuilder-hifidna组装克隆试剂盒(购自美国newenglandbiolabs)按操作说明组装到带有sv40启动子的psvl质粒中。为方便克隆，znwt-01-2016中引入一saci限制酶切位点(4213gagctc4218)。组装得到a型塞尼卡谷病毒的全长感染性cdna克隆，命名为znwt-01-2016。见图1。

znwt-01-2016的5′末端和3′末端用generacercore试剂盒(购自美国invitrogen公司)测序，测序引物见表1。a型塞尼卡谷病毒感染性克隆znwt-01-2016的cdna测序结果如seqidno.2所示。

表1.构建全长cdna克隆和病毒基因组测序引物

根据znwt-01-2016的序列设计含有ecori和sphi酶切位点的引物，以znwt-01-2016克隆为模板通过pcr扩增p1-p2-p3基因，并将克隆得到的p1-p2-p3基因插入pgem-t载体中，制备得到重组质粒pgem-t-p1-p2-p3，在大肠杆菌dh5α扩增，纯化，测序确认。

(2)表达a型塞尼卡谷病毒外壳蛋白的重组载体的构建

以重组质粒pgem-t-p1-p2-p3模板通过pcr方法扩增得到目标基因p1-p2-p3，两端分别连有ecori和sphi酶切位点，将得到目标基因分别插入pfastbac1质粒ecori和sphi酶切位点之间和插入pfaslivbacdual质粒的ecori和sphi酶切位点得到重组载体polhp1-p2-p3、hr1pb29p10p1-p2-p3、hr1polhp1-p2-p3、hr1p6.9p10p1-p2-p3、hr1p10p1-p2-p3、hr1polhp10p1-p2-p3和hr1p6.9p1-p2-p3。

构建的转化质粒见图2。常规表达重组杆状病毒质粒见图3。liv杆状病毒，含所有基因调节元件，这些元件包含ac-ie-01编码的顺式激活元件、增强子序列hr1、启动子polh、启动子pb29、启动子p6.9、启动子p10和他们联合启动子。常规杆状病毒在polh启动子表达重组sva-vlp。

(3)表达svap1-p2-p3重组杆状病毒转移载体的制备

按照bac-to-bac杆状病毒表达系统的操作手册用步骤(2)构建得到的重组载体转化含有杆状病毒穿梭载体的dh10bac感受态细胞，获得重组杆状病毒穿梭载体rbacmid。

(4)重组昆虫杆状病毒的获得

将含a型塞尼卡谷病毒p1-p2-p3的基因序列的重组杆状病毒穿梭载体rbacmid转染入宿主昆虫细胞株hi5中，获得重组昆虫杆状病毒，命名为acmnpv-sva-p1-p2-p3。

1.4赛尼卡谷病毒样颗粒的制备和鉴定

1.4.1acmnpv-sva-p1-p2-p3重组杆状病毒的培养

重组杆状病毒acmnpv-sva-p1-p2-p3以0.1感染复数(multiplicityofinfection，moi)感染hi-5细胞，台盼蓝染色监控细胞活力。

1.4.2.vlp纯化和鉴定

1.4.2.1纯化：

感染48小时的hi-5细胞离心(700xg5min、4℃)，沉淀用1×pbs洗涤二次，重悬于含蛋白酶抑制剂(complete1,roche)的蒸馏水使细胞裂解，用dnasei(rochediagnostics)在37℃消化1小时，然后加入用pbs(0.2msodiumphosphate,0.1mnacl,ph6.0)配制2％sarkosyl和5mmedta，4℃孵育过夜，2,000xg离心5min，上清进行超速离心(131,453xg，2.5h)。沉淀用vertrel(购自sigma)抽提，二次超速离心(131,453xg，2.5h)。沉淀溶于1mlpbs，4℃贮存备用。

1.4.3鉴定：

蛋白浓度使用蛋白检定试剂盒(购自bioradlaboratories)采用bradford法测定。30mg可溶性蛋白上样15％sds-page胶，用考马斯亮蓝染色。免疫印迹使用sva-vp1蛋白亲和层析纯化多克隆抗体，按1:1000稀释使用，二抗为辣根过氧化物酶标记鼠抗兔igg，1:2000稀释使用。重组可溶性vp1蛋白条带密度用密度仪扫描成像分析(chemidoctmxrs凝胶成像系统，biorad)，bsa标准曲线定量。

收集的昆虫细胞破碎后低速离心，收集含sva-vlps蛋白的上清，铺于20–69％的蔗糖梯度液上，4℃、100,000×g(beckmanoptimale-80kultracentrifuge)离心15-18小时，分步收集，每管收集液取1毫升进行sds-page电泳，考马斯亮蓝染色电泳胶，具有33kda蛋白带的收集液合并，溶于db150缓冲液，采用浮力密度为1.24-1.33g/ml的氯化铯梯度液，100,000×g(beckman)超速过夜离心。分步收集分析后，合并含sva-vlps的收集液，100,000×g(beckman)离心4小时，沉淀溶于pbs并用pbs透析过夜，透析后的sva-vlps用含50％甘油的pbs在-20℃保存备用。纯化的vlps5μl加到钛合金碳包被的网上放置2分钟，用2％(w/v)醋酸铀溶液染色，用em2000ex电镜观察。

1.5a型赛尼卡谷病毒病毒样颗粒疫苗的配制

佐剂：cpg佐剂由中国农业部兰州兽医研究所研制并提供，其制备方法按公开号为cn1814757b，发明名称为【一种cpgdna新型佐剂及其制造方法和含有该佐剂的疫苗】的中国专利申请进行，配制成抗原含0.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、30μg/ml，含佐剂2μg/ml的a型赛尼卡谷病毒样颗粒疫苗。

1.6统计学分析：

采用instat软件(美国graphpadsoftware公司产品)分析,数据用以平均值±sem表示。时间依赖性参数的差异采用方差重复检验，显著性采用dunn多重分析和不对称性t检验。

2.结果

2.1改造的杆状病毒生产sva-vlps抗原

构建在polh启动子(liv(-))或在liv表达盒(liv(+))控制下，表达sva-p1-p2-p3的重组杆状病毒，以01moi转染hi-5悬浮细胞。sds-page和免疫印迹确证：产生的vlp蛋白分子量vp1≈33kda、vp2≈40kda、vp3≈28kda、vp4≈6kda。

常规杆状病毒在感染细胞48小时有sva结构蛋白测出并达到产出高峰；liv(+)杆状病毒在感染细胞24小时后可检出sva结构蛋白，72小时表达量达到最高，在感染96小时仍有sva结构蛋白有效表达。liv(-)杆状病毒在感染细胞72小时后，sva结构蛋白产量急剧下降。liv(+)杆状病毒感染细胞72小时后，细胞活力与liv(-)杆状病毒感染细胞比较明显提高。比较含表达盒和常规重组杆状病毒在48hpi、72hpi(也就是形成vlp峰值时)的liv(-)以及liv(+)杆状病毒sva-结构蛋白产量，有显著差异，其中含有p6.9p10联合启动子的杆状病毒(liv3)其蛋白表达量是liv(-)杆状病毒的3倍。标准liv(-)杆状病毒的sav病毒样颗粒产量为56mg/l，liv3杆状病毒的sav病毒样颗粒产量为198mg/l。

实施例2改造昆虫细胞提高sva病毒样颗粒的产量

1、方法

1.1表达量最高的重组liv3杆状病毒构建如实施例1以及图4所示。重组杆状质粒使用cellfectin-ii转染hi5细胞产生感染性重组杆状病毒acmnpv-sva-p1-p2-p3；

1.2昆虫细胞系hi5悬浮培养

细胞用无血清培养基sf-900ii，在透气的erlenmeyer摇瓶(购自corning公司)，以27℃、转速80rpm、2”转动直径的条件维持和扩增培养。

1.3重组杆状病毒的检测

杆状病毒的传染性滴度用流式细胞仪(购自millipore公司)和gp64杆状病毒滴度试剂盒(购自expressionsystemsllc公司)测定。测定的免疫荧光结果用杆状病毒标准和滴度试剂盒提供的模板分析转换成噬斑形成单位(pfu)。免疫荧光和蛋白分析的阴性对照为表达gfp的杆状病毒(acmnpvgfp,abvector)或空的质粒性杆状病毒(acmnpv-nc,abvector)。细胞计数和细胞直径用vi-cellxr和携带的图像分析软件(beckmancoulter购买)检测，用预装的hi5细胞图像分析比对。通过培养时间段的vi-cellxr细胞计数获得对数生长和标准细胞生长曲线适合度，计算群落倍增时间(pdt)。vi-cellxr分析的结果用minitab16软件(minitab)分析。

1.4重组杆状病毒在ph改变的sf-900ii培养基中感染hi5细胞

对ph＝6.3的无血清培养基sf-900ii进行ph调节：用1nhcl调至ph＝6.0，1nnaoh调至ph6.6–6.8。生长培养基ph用ph计测量并校准。ph调节好的培养基用0.2μm的膜进行无菌过滤。

hi5细胞以200×g离心，倒去sf-900ii培养液，用ph6.0–6.8的sf-900ii重悬，细胞密度为3.6×10⁶活细胞/ml。在500ml透气的erlenmeyer摇瓶中，装入150毫升ph6.0–6.8的sf-900ii培养基，moi＝0.1pfu/细胞接种acmnpv-sva-p1-p2-p3，以27℃、转速80rpm、2”转动直径维持和扩增培养。在病毒感染72小时后取细胞培养悬液样品进行免疫荧光流式细胞仪检测，感染96小时后离心收获除去细胞，进行定量qelisa分析，结果用minitab16软件统计分析。

1.5hi5对高ph培养的适应和驯化

无血清培养基用n,n-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(bes)的昆虫细胞最小需要补充液besmiss1：1稀释，besmiss含50mmbes、124mm蔗糖、5mm葡萄糖、50mm氯化钠、20mm氯化钾、3mm氯化钙、10mm硫酸镁、0.1％w/v嵌段式聚醚(pluronic)f-68。所有bes-miss的成分都为生物药用级别。sf-900ii-bes-miss培养基用1nnaoh调至6.6–7.0，用滤器(emdmillipore)无菌过滤。

hi5细胞慢速轻微离心后用ph6.6sf-900ii-bes-miss培养基完全换液，按正常对照标准sf-900ii培养基培养hi5细胞的群体倍增时间(populationdoublingtime，pdt)20-24小时进行培养。培养恢复病毒期间，每隔2-5天用已经调好sf-900ii-bes-miss培养基换液，保证细胞足够营养且能克服因为细胞代谢引起的培养基酸化。用同样的程序在2月内逐步提高细胞培养基的ph，使在ph7.0时，细胞的pdt稳定在20-24小时。用sf-900ii+7.5％dmso作为冷冻液，建立高ph适应细胞库。细胞库的安瓶使用mr.frosty冷冻速率可控的冷冻箱冷冻并移到液氮罐的气相，使长时结晶。适应驯化细胞库命名为sfhi5ph，以区别母本hi5细胞。在透气的erlenmeyer摇瓶(购自corning公司)，以27℃、转速80rpm、2”转动直径、用无血清、ph7.0sf-900ii-bes-miss生长培养基悬浮培养sfhi5ph细胞，进行维持和扩增培养。使用预装hi5图像分析比对软件的vi-cellxr进行细胞计数、细胞直径测量和台盼蓝染色活性测定。通过对数生长期和标准生长曲线适合等量关系研究，用vi-cellxr计数仪检测不同培养时间的细胞数、计算细胞群体倍增时间(pdt)。结果用minitab16软件统计分析。

1.6摇瓶(shakeflasks，sf)在高ph条件下制备savvlp

采用sf-900ii无血清培养基，分别培养hi5、sfhi5ph细胞，使密度达到3.6×10⁶活细胞/ml，按moi＝0.1pfu/细胞接种acmnpv-sva-p1-p2-p3，分别进行培养。125ml通气摇瓶接种35ml，2l的通气摇瓶接种300ml，在摇动孵育箱中27℃、转速80rpm、2’转动直径培养24小时。感染细胞200×g离心除去sf-900ii培养基，用sf-900ii-besmiss彻底换液，重悬于ph7.4sf-900ii-besmiss以制备vlp。通过1nnaoh/ph单位/ml的速度无菌加入1nnaoh，不断取样用校准的ph计监测使培养ph维持在7.0–7.4。感染72、96小时的样品离心除去细胞，进行qelisa分析，使用软件minitab16(minitab)进行统计分析。

1.7用搅拌式生物反应器(stbr)在高ph条件下制备savvlp

采用sf-900ii无血清培养基培养sfhi5ph细胞使密度达到3.6×10⁶活细胞/ml，按moi＝0.1pfu/细胞接种acmnpv-sva-p1-p2-p3进行培养。3l生物反应器(biostat玻璃培养瓶反应器，用biostatmd2反应器控制系统：工作体积2l，用直径5.8cm斜叶桨、低剪切力叶轮(sartorius)100rpm搅拌，使用pid环控制反应罐的水温使保持在27℃，使用通气搅拌提供50sccm的空气，同时覆盖层进出口提供200sccm的空气进行气体交换。通过环形喷雾器使用pid控制的气体流传递40-100sccm,使溶氧控制在40％饱和度(相对于培养基与环境空气平衡)。培养24小时后，感染细胞200xg离心除去sf-900ii培养基，用sf-900ii-besmiss彻底换液，重悬于ph7.4sf-900ii-besmiss以提高vlp产量。培养ph通过pid控制的蠕动泵加入无菌的1nnaoh，使ph维持在7.2。在感染的48、72、96小时移出样品液，除去细胞，进行qelisa分析。

1.8sfhi5ph生产savvlp纯化

acmnpv-sva-p1-p2-p3感染sfhi5ph的细胞培养物离心收获，沉淀用pbs缓冲液洗涤1-3次，重悬于含蛋白酶抑制剂的蒸馏水使细胞裂解，离心取上清，依次用0.45μm的durapore滤器、0.22μmdurapore滤器(emdmillipore)澄清，加入edta使其终浓度为2mm。使用500kda超滤器浓缩15倍并透析换液至10倍体积的缓冲液中，缓冲液含150mmnacl、20mmhepes(ph8.0)。超滤产物用25μg/ml核酸内切酶处理：4℃18h，再用0.45μm的durapore滤器、0.22μmdurapore滤器(emdmillipore)依次澄清过滤。滤液上样sephacryls-400hr分子筛层析，流动相洗脱液为缓冲液(300mmnacl,20mmhepes,ph8.0)，用0.22μmdurapore滤器(emdmillipore)过滤，用sephadexg25层析柱换液，换液为20mmhepes(ph8.0)。上样q-sepharosexl粒子交换层析柱，用线性nacl梯度液(0-300mm)洗脱，洗脱液用500kda滤器浓缩10倍并用30倍体积含11mm磷酸钾、25mm柠檬酸钠、218mm蔗糖液(ph7.2)透析，透析液用0.22μmdurapore滤器(emdmillipore)过滤，-70℃保存使用。

1.9a型赛尼卡谷病毒病毒样颗粒疫苗的配制

佐剂：cpg佐剂由中国农业部兰州兽医研究所研制并提供，其制备方法按公开号为cn1814757b，发明名称为【一种cpgdna新型佐剂及其制造方法和含有该佐剂的疫苗】的中国专利申请进行，配制成抗原含0.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、30μg/ml，含佐剂2μg/ml的a型赛尼卡谷病毒样颗粒疫苗。

2结果

2.1sav结构蛋白在hi5细胞的表达

研究结果表明，p1-p2-p3可大量表达、组装近似自然的savvlp颗粒，采用无血清培养的高ph驯化细胞，对sav结构蛋白基因进行了克隆和表达，采用cpg佐剂配制成疫苗。

savvlp疫苗按生物技术药物要求，特别是用昆虫杆状病毒系统规模化生产面临许多技术挑战。特别涉及产量低而造成生产成本高的挑战。为进一步建立低廉、保真、可控sav病毒样颗粒疫苗生产工艺，本发明公开了重组杆状病毒acmnpv-sva-p1-p2-p3转染昆虫细胞hi5制备savvlp的方法。当hi5细胞用标准无血清培养基sf-900ii培养时，sav的结构蛋白vp0没有彻底酶解，观察到形成的vlp少。在分辨率5.3a°的电镜下确定savvlp冷冻电镜图，确证了vp1、vp2、vp3、vp4多克隆抗体的特异性。表明在hi5细胞中形成了savvlp。定量elisa(qelisa)检测vlp的极限值loq＝2ng/ml，hi5培养的上清中没有检测到阳性信号。acmnpv-sva-p1-p2-p3感染hi5细胞的胞质超薄切面的投射电镜观察到25-30nm直径颗粒，小于杆状病毒核衣壳蛋白的电子密度，类似真核细胞出芽形成savvlps。hi5细胞阴性对照无此颗粒发现。

hi5细胞制备vlp时，培养基ph从6.5提高到7.9时，显著提高sav的出芽生殖释放到培养液中。

2.2高ph驯化hi5细胞

不同的昆虫细胞系生长需要的ph范围一般在6.0–6.8。在不适合的ph条件下，会损伤细胞生长和活性。外界ph在6.2-6.8时，昆虫细胞hi5细胞内的ph接近7.0，由于昆虫细胞培养基稍微偏酸性以及sav对酸性的敏感，本发明提高了表面的ph,在培养基ph7.0–7.9，使sva-p1-p2-p3/hi5培养液中vlp产量有显著提高。昆虫细胞的培养基ph范围为6.0–6.4，提高ph范围为真正模拟哺乳动物的代谢以及自然性质，而使savvlp类似真病毒。

2.3高ph适应sfhi5ph生产savvlp

使用ph6.3细胞培养基，acmnpv-sva-p1-p2-p3感染hi5细胞，用中和抗体对细胞表面染色，平均荧光强度(mfi)仅高出阴性对照(nc)的4倍。感染的上清液ph6.0–6.3时，免疫印迹试验也无vp1蛋白带检出，qelisa信号阴性。这揭示在ph6.0–6.3时，是因为杆状病毒感染溶解性过程。当培养ph从6.3提高到6.8,vp1多抗染色的hi5表面mfi比阴性对照的背景提升22倍。当培养液ph从6.3提高到6.6，培养液ph从6.3提高到6.8时，感染上清中vp1和vp3的免疫印迹信号也在提高。qelisa结果显示上清液的savvlps浓度逐步上升。随着培养ph上升至6.8，vp1和vp3带的免疫印迹密度、qelisa信号减弱，不能达到阳性对照bhk-21生产sav的水平。hi5细胞表面vp1-vp0-vp3复合体构象检测信号的提升以及vlp出芽生殖分泌的提升是培养ph提高所致，揭示杆状病毒感染hi5细胞生产的savvlp的出芽使vp1-vp0-vp3复合体稳定。

2.4hi5细胞的驯化

通过qelisa检测表明：在ph6.6–6.8时，感染hi5细胞生产的savvlps，这个ph范围超出sf9、hi5细胞系的正常生理范围，接近培养昆虫细胞的极限值。由于hi5细胞系的异质多样性性质，本发明设定了采用ph压力，通过在适宜生长培养基多次传代驯化或选择在高ph条件下有效筛选生产savvlp的细胞。

在培养基直接加入碱、无菌过滤调节sf-900ii培养基到ph6.6–6.8足以说明起初的调高ph可有效提高savvlp产出，但ph提高到一定水平，培养基有可见沉淀，这种ph诱导的沉淀现象导致培养基在贮存过程的不稳定，降低hi5细胞生长速率和活性，因此有必要改良培养基配方使ph范围适合细胞的正常生长。调ph过程中，磷酸缓冲液中磷酸钙和其他双价阳离子有可能形成沉淀。为此(bes)作为缓冲液，减少磷酸浓度，采用改良了培养基sf-900ii-bes-miss。除此sf-900ii培养基，无血清baculogoldmax-xp(bdbiosciences)、和esf-921(expressionsystems)培养基在减小磷酸浓度、增高ph条件下都能提高细胞的增长速率。其他的缓冲液，包括mops、hepes、tes，在30–40mm浓度范围可减少培养基的磷酸、对细胞无毒性且具有缓冲作用。

sf-900ii-bes-miss生长培养基和标准培养基在ph7.0-7.4时，发现沉淀最少，可使hi5细胞在较大的ph范围获得驯化和适应，经过长达8周连续从ph6.0到7.4(每步0.2ph单位)不断提升的ph压力选择，获得了稳定的高ph7.0-7.4适应的昆虫细胞，冷冻保存，为区别母本细胞hi5，命名为sfhi5ph。

hi5细胞起初暴露在ph6.2的培养基培养时，台盼蓝染色分析观察细胞总数和活性略微下降，但仍约为89％的细胞是活的。通过驯化，活细胞数可恢复到96–98％，具有常规ph培养时稳定性。揭示实时压力和长期压力选择诱导使细胞长时间的耐受，获得驯化和适应。

2.5sfhi5ph的形态和稳定

根据vi-cellxr电子显微图像和数据统计分析，sfhi5ph细胞平均直径3.5μm，大于母本细胞hi5。sfhi5ph的体积19.8±0.3μm，hi5体积15.7±0.1μm，增大83％。ph适应的细胞群与母本细胞平均直径的差异具有显著性(12次独立样本的2样本t-检验，p小于0.01)。

sfhi5ph细胞二碘化丙锭(pi)染色，在普通荧光显微镜下暴露国定信号强烈。用流式细胞仪分析，sfhi5ph细胞g1期细胞平均荧光密度高出母本细胞hi51.1.8倍。这种细胞大小分布的变化和核酸浓度提高(约为2n)，与sf9、hi5适应到高温度环境的观察结果一致。

sfhi5ph在标准的昆虫细胞ph条件下仍保持了正常的生长能力，但在ph7.2时生长速度翻倍，之后pdt略微提高。hi5pdtph6.6开始提升，在ph7.0–7.4时，pdt显著提升，说明昆虫杆状细胞对ph升高的敏感。sfhi5phph正常生长范围的扩展说明细胞已经对ph的耐受形成了新的真正适应的细胞群。sfhi5ph平均细胞直径、培养活性、生长速率在适应后30代次传代内稳定(约经历90次群落倍增)，在连续培养传代过程中没有观察到表型不稳的现象。

2.6用sfhi5ph细胞生产savvlps的质量和产量

在高ph下驯化适应可正常生长，但这种在特殊的培养条件下高效细胞生长对杆状病毒生产重组产品未得到验证。为确定ph驯化是否提高savvlp的产出，sfhi5ph细胞在改良的培养基、高ph条件下感染acmnpv-sva-p1-p2-p3并生产a型赛尼卡病毒病毒样颗粒，hi5细胞在未改良培养基、低ph条件下感染acmnpv-sva-p1-p2-p3。sfhi5ph生产的savvlp产量高于其母本细胞hi5((二样本t检验,p小于0.01)，且在摇瓶小量培养到摇瓶大量培养的放大中以及搅拌式生物反应器从小到大的培养中，sfhi5ph生产的savvlp产量高于其母本细胞hi5((二样本t检验,p小于0.01)。sfhi5ph生产的vlp可达28mg/l，hi5生产的savvlp1.9mg/l，二者产量显著差异(二样本t检验,p＝0.50)。

sfhi5ph每百万细胞可产9μgvlp，而hi5每百万细胞可产1μgvlp，二样本t检验，p小于0.01。

sfhi5ph细胞用生物反应器，悬浮感染培养使大量的savvlps大量表达，获得20-30％的纯化vlp。

蔗糖梯度超速离心和免疫印迹检测显示从sfhi5ph培养、纯化vlps的浮力密度与sav浮力密度相似。

动力光散(dls)分析，sfhi5ph生产的vlp平均直径为29±2.2nm，sav平均直径为30±2.4nm，二者无显著差异(二样本t检验，p＝0.19)。sfhi5ph生产vlps和sav电子密度稍微有些差别，但颗粒大小，二十面体对称性和结构二者相似。sfhi5ph纯化后的收集液中在电镜下观察，视野中含97％的savvlp，含3％的残余杆状病毒。经sds-page纯度分析为90％，与savbhk-21生产的经纯化病毒纯度相当。

实施例3sva衣壳蛋白亲和层析多克隆抗体的制备

3.1sva衣壳蛋白抗原的制备

以基因库中a型赛尼卡谷病毒克隆(基因库登记号.kx019804)为模板，设计引物合成a型赛尼卡病毒病毒p1cdna序列，插入质粒pgem-t，制成重组质粒pgem-t--p1,重组质粒在在大肠杆菌dh5α扩增，纯化，测序确认；

(2)以基因库中a型赛尼卡谷病毒克隆(基因库登记号kx019804)为模板，设计引物，以重组质粒pgem-p1为模板，pcr扩增vp1、vp2、vp3、vp4产物，酶切分别插入pet－28a(+)进行表达，宿主菌为bl-21，表达为可溶性蛋白。表达产物经离心获得上清，上清液用0.45μm的durapore滤器(emdmillipore)澄清，超滤浓缩5倍换液到蔗糖磷酸缓冲液(11mm磷酸,7.2％w/v蔗糖，ph7.0)，上样qsepharosexl阴离子交换柱(gehealthcare)，用含25μg/ml核酸内切酶的磷酸缓冲液洗涤(emdmillipore)，用柠檬酸缓冲液(11mm磷酸、25mm柠檬酸、7.2％w/v蔗糖,ph7.2)洗脱获得vlps。用10倍体积柠檬酸缓冲液(11mm磷酸,25mm柠檬酸,7.2％w/v蔗糖，ph7.2)透析，0.22μmdurapore滤器(emdmillipore)过滤，-70℃保存使用。

3.2svavlps和衣壳蛋白多克隆抗体制备

实施例1和上述制备的病毒样颗粒抗原(vp1、vp2、vp3、vp4)，其对应多克隆抗体的制法：

新西兰白兔用250μg抗原(和完全弗氏佐剂乳化物，fca)皮下(sc)注射初免，在初免3周、6周、9周后分别用125μg(和不完全弗氏佐剂乳化物，fia)加强免疫。免疫中间过程每只兔子取血清20ml,在免疫后77天最后取血清50ml。免疫血清用50％的饱和硫酸按沉淀，用pbs在4℃透析，用蛋白gsepharosefastflow介质层析纯化(gehealthcare)，洗脱在ph7.4的pbs溶液中。

为制备重组壳蛋白或亲和层析柱，介质已经用50倍体积的1mm盐酸、10倍柱床体积蒸馏水，10倍柱床体积的结合缓冲液(0.1mnahco3,0.5mnacl,ph8.3)处理，表达纯化的重组衣壳蛋白与5mlcnbr活化sepharose4b进行反应，在4℃过夜，洗去未结合蛋白，用0.2m甘氨酸在4℃封闭12小时。为纯化所有衣壳蛋白或片段的抗体，抗血清在4℃透析过夜，用5倍柱床体积结合缓冲液洗涤，用抗体洗脱液(0.1mglycine,ph2.7)洗脱后，用液体(3mtris,ph8.8)将洗脱液立即调节ph＝8.0，按30％(v/v)用蛋白gsepharosefastflow介质纯化(gehealthcare)，洗脱在ph7.4的pbs溶液中备用。浓度为150-250μg/毫升。

实施例4sva病毒样颗粒疫苗质量控制和研究方法

4.1sds-page和免疫印迹

hi5细胞裂解液和培养上清用tris-glycine还原缓冲液(含sds、dtt)混合，75℃加热变性10分钟，上样4-20％tris-glycine预制胶，电泳后进行蛋白转移。

转移的膜用含5％脱脂牛奶的pbst(tris-bufferedsalinewithtween-20，tbst)室温封闭2小时，用pbs洗涤3次，每次5分钟。pbst1：10000稀释的第一抗体(见实施例2抗体制备)和膜在室温孵育2小时，膜用pbs洗涤3次，每次5分钟。碱性磷酸酶标记的羊抗兔igg抗体按1：2000稀释，和膜在室温下孵育2小时，,膜用pbs洗涤次，每次5分钟。用nbt/bcip1-step试剂盒(购自thermo-pierce公司)显色。倒去反应液，晾干膜并用蒸馏水洗涤，使用图像扫描仪进行扫描。

纯化的vlpsds-page电泳的胶用考马斯亮蓝染色，用用图像扫描仪进行扫描，使用图像定量分析软件进行所有蛋白定量，sds-page纯度是sav所有蛋白条带密度总和。

4.2savvlp定量elisa(qelisa)

savvlp亲和层析纯化多抗进定量elisa，量化组装的savlp。hi5制备vlp总蛋白含量用bca蛋白分析试剂(购自thermo-pierce公司)按厂家提供说明书测定。用2mg/ml的白蛋白稀释成含0.5-500mg/ml标准曲线单独试验建立标准曲线。标准品和样品25μl和bsa工作液200μl在稀释板上混合、振动，37±5℃孵育30分钟，室温冷却后放置在读板仪上，用softmaxpro软件(moleculardevices)分析结果，适合的4个结果用作建立标准曲线。

savvlp亲和层析纯化多抗在室温下包被384孔板，洗涤封闭后，1.67倍系列分别稀释15份mdvlp标准和检验样品，每个稀释度取75μl加入孔中，室温孵育60分钟，洗涤，加入生物素标记的vp1层析纯化多克隆抗体75μl(0.5μg/ml),洗涤，用链霉素碱性磷酸酶标记的荧光底物4-mup(4-甲基伞花基磷酸钠，4-mup)显色。分析样品的荧光密度(激发360nm，散光465nm)和浓度的关系建立标准曲线。分析结果符合四参数对数方程，未知样品的浓度通过vlp标准曲线类推法确定。对sav标准vlp定量限值(loq)为2ng/ml，hi5、sfhi5ph不表达sav蛋白的阴性对照的限定值确证小于2ng/ml。

4.3免疫荧光流式法

用亲和层析纯化vp1、vp2、vp3、vp4多克隆抗体表面免疫荧光染色观察胞质内vp1、vp2、vp3、vp4复合体的数量、构象。为阻止抗体内化，所有洗涤、封闭、染色液贮存在2-8℃，样品放置在冰上。

acmnpv-sva-p1-p2-p3、acmnpv-nc感染hi5细胞3天后收获、离心，用含1％牛血清白蛋白pbs(ph7.2)洗一次。洗涤的细胞重悬于用ph7.2的pbs按1：250稀释的亲和层析纯化vlps多克隆抗体(7μg/ml)中，2-8℃孵育2小时，用含1％牛血清白蛋白pbs(ph7.2)洗2次，加入羊抗兔-alexafluor488标记igg,2-8℃孵育2小时,含1％牛血清白蛋白pbs(ph7.2)洗一次，用guavaeasycyte8ht毛细流式细胞仪(购自millipore公司)分析，使用guavasoft2.2软件分析alexafluor488绿色荧光数据，minitab16软件统计分析。

4.4动态光散分析

sfhi5ph制备的savvlp直接装入40μl低容量适应杯(槽)(购自malvern仪器公司)，每次单个样品3次重复分析。在zetasizernano仪器(malvern仪器公司)和携带的软件上分析。标准vlp蛋白和水的散射参数以及三次分析的大小分布的可见值平均，输入minitab16软件计算颗粒直径和分析95％可信区间。

4.5细胞周期和二碘化丙锭分析

未感染的hi5、sfhi5ph细胞在2-8℃下，用70％乙醇(pbs配制)固定，用细胞周期检测试剂盒(guavacellcyclekit，购自millipore公司)对细胞染色，在guavaeasycyte8ht毛细流式细胞仪(购自millipore公司)分析，用携带的guavasoft2.2软件分析标准细胞周期程数据。

乙醇固定的hi5、sfhi5ph细胞单独用二碘化丙锭染色，在ix70荧光显微镜(购自olympus公司)上，采用二碘化丙锭滤光片、设定暴露时间，放大成像，用携带的spot4.7图像软件进行成像数据分析。

4.6密度梯度超速离心

a型赛尼卡谷病毒蔗糖密度梯度范围1.13–1.20g/ml。用缓冲液(150mmnacl,10mmtris,1mmedta,ph8.0)制备蔗糖梯度，sfhi5ph细胞培养液，加入0.2倍体积的5mnacl，在冰上放置10min后，轻轻放置在蔗糖梯度液顶端，所用超速离心机(beckman)的转头为sw41ti，50,000g离心4小时，离心期间温度控制在16℃，收集进行免疫印迹，用折射仪进行蔗糖溶液密度分析、vlp显微观察和分析。

纯化vlp样品保存在400目铜网空碳膜支撑的玻化冰上，用电镜观察。3微升样品悬液滴在干净的网，用滤纸印迹，立即在液体乙醇中玻化，在液氮中保存直到移出观察、成像。使用的电子显微镜为feitecnait12，在120kev操作，携带feieagle4kx4kccd照相机。维持温度在-170℃恒温镜台上，将玻化的网转入电镜，获得多层图像评估样品分布。识别到可能标的区域后，获得许多正常放大倍数52,000x(0.21nm/pixel)和21,000x(0.50nm/pixel)的高倍放大的图像，获得正常焦距下的-4μm(52,000x)、-5mm(21,000x)的图像，电子剂量为25e^-/a°²。

用自动分拣程序选择21,000x放大的图像。用xmipp处理包进行无参照物比对、分拣归类到自我组织相似的一群细胞。xmipp处理包使用可能密度估计器自我组织图绘制分类法，将一系列高倍立体的输入载体变成常规二维网格，使图上单位相似性反映到输入结果的相似性。

sfhi5ph制备savlp颗粒的计数和评估。从sfhi5ph制备的vlp的高质量颗粒图像148、199分别获得2d一般的vlp图像，从图像中可计算潜在sav颗粒(圆形，25–30nm直径)，杆状病毒颗粒(棒状，直径300–400nm)，总计567颗粒。

4.7细胞薄面投射电镜观察

acmnpv-sva-p1-p2-p3感染sf-900ii培养(ph6.3)的未适应驯化hi5细胞用2.5％戊二醛(所配溶液为含1mmcacl2的二甲砷酸盐缓冲液,ph7.3)在4℃过夜固定，采用标准的填埋、切片程序和连续网方法制备样品。网用400目有狭槽的铜支撑的硝酸纤维膜制成。样品用2％醋酸铀酰染色成像。使用的电子显微镜feitecnait12在120kev操作。电子显微镜携带feieagle4kx4kccd照相机。负染网使用室温台转入电镜。每个网格获得许多正常放大倍数52,000x(0.21nm/pixel)、21,000x(0.50nm/pixel)、15,000x(0.71nm/pixel)图像，获得正常焦距下的-4μm(52,000x)、-5μm(21,000x)、-10μm((15,000x)的图像，电子剂量为2-30e-/a°2。21,000x(0.50nm/pixel)正常放大倍数，25μm正常焦距，电子剂量为2-4e-/a°2。

实施例5sva病毒样颗粒疫苗安全性、诱导中和抗体的能力

5.1方法

5.1.1动物和免疫

1-3天的新生仔猪购自甘肃武威某猪场，经用猪口蹄疫、猪水泡口炎病、猪水泡炎病毒抗体试剂盒检测均为阴性者入选实施。实施例1制备得到的疫苗。新生仔猪每组10只，分成5组，1组为生理盐水免疫攻击组对照组，2-5组新生仔猪分别肌肉注射0.5μg、5μg、10μg、30μgsavvlps疫苗。在免疫前取血。新生仔猪免疫完成后30天进行攻毒，攻毒后每天取血，检测sva特异性抗体、中和抗体和血清中的病毒。在免疫前后观察每组猪的体重变化，观察是否有发热、厌食等现象。

5.1.2血清中和抗体分析

采用sva-st-p4分离病毒(中农威特生物科技股份有限公司保存)和免疫血清中和，血清复样，100％中和病毒滴度(100％neutralizationtitration，nt100)法测定新生仔猪血清中和抗体。bhk-21细胞(购自atcc，驯化用于检定)按每孔15,000细胞接种96孔板培养1天。倍比稀释血清分别和500tcid50sva-st-p4混合，37℃孵育1小时，加入已成单层的bhk-21细胞，37℃培养3天，固定后用染色液(0.05％结晶紫、20％甲醇)染色，通过和未感染细胞比较，确定无细胞病变对应的血清最高稀释度的倒数。用graphpadprism5软件包作图并统计分析。每组的抗体平均滴度、不同剂量免疫各个新生仔猪血清滴度按组比较。

5.2.结果：

如表2显示，仔猪接受1剂注射免疫后35天的体重增长无明显差异。也无观察到发热、厌食等现象，表明本发明的疫苗安全。

表2疫苗免疫后(天)仔猪增重

表3疫苗诱导新生仔猪中和sva抗体(log2)变化

表3显示，2-5组免疫免疫仔猪中和抗体滴度显著高于1组未免疫攻击猪的中和抗体滴度(p小于0.001),对a型赛尼卡谷病毒sva-st-p4分离病毒的中和活性显著提高。但5μg、10μg、30μg免疫组(3-5组)猪血清中和抗体滴度并无显著差异(kruskal-wallis检验和dunn’spost检验)，说明疫苗的最小剂量在0.5-5μg之间。

表3显示也a型赛尼卡谷病毒样颗粒疫苗诱导猪产生sva中和抗体，产生中和抗体快、滴度高。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中农威特生物科技股份有限公司

<120>一种a型塞尼卡谷病毒样颗粒疫苗及其制备方法和用途

<130>klpi161406

<160>2

<170>patentin3.5

<210>1

<211>3737

<212>dna

<213>senecavalleyvirusa

<400>1

aatcaggcgacgtcgagaccaacccaggccctgcttctgacaacccaatcttggaatttc60

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