吡咯喹啉醌预防和/或治疗雄性生殖功能障碍的新用途的制作方法

本发明属于医药领域，具体涉及吡咯喹啉醌或其盐在制备用于预防和/或治疗雄性生殖功能障碍、或者改善雄性生殖功能的产品中的用途。

背景技术：

据统计，全世界范围内，所有育龄夫妻中约有15％都有不孕不育问题，而其中约有一半为男性因素。临床上，男性不育主要分为无精、少精、弱精以及精子畸形等。目前临床上通常使用的药物有核苷酸和氨基酸类制剂以及激素类药物，效果差强人意，缺少更为有效的改善精子发生和精子质量的治疗药物。

吡咯喹啉醌(pqq)化学名为4,5-二氢-4,5-二氧化-1-氢吡咯(2,3f)醌-2,7,9-三羧酸(如下式)，是20世纪70年代末被发现的一种氧化还原酶的新辅酶，可溶于水，并且具有较好的热稳定性。

其首先被发现于甲基营养菌中，并被证实为细菌脱氢酶的还原型辅因子。尽管哺乳动物本身并不能合成pqq，但可以从食物中获得，如蔬菜以及肉类。在人类和大鼠的组织中均能检测到痕量的pqq(pm-nm水平)，其中pqq在人乳中含量最高。pqq最为显著的生物学特性是其强大的抗氧化作用，其抗氧化活性约为维生素c的5000倍。大量研究表明pqq可以通过发挥抗氧化作用来维持哺乳动物的健康。缺乏pqq将会引起哺乳动物严重的健康问题，如生长阻滞以及免疫系统损伤。此外，多项研究表明pqq对小鼠脑和心血管都有很好的保护作用，并能抑制糖尿病的进展。pqq在生殖中的作用也有少量报道，但都是研究其对雌性生殖的影响。steinbergf等的研究结果显示饮食中缺乏pqq可以明显降低雌性小鼠或者大鼠的生育能力，主要表现为受孕率降低以及每窝生仔数的下降。

技术实现要素：

本发明首次研究发现吡咯喹啉醌对雄性不育动物模型具有治疗作用，为男性不育提供了一种新的防治选择。

本发明具体技术方案如下：

吡咯喹啉醌或其盐在制备用于预防和/或治疗雄性生殖功能障碍、或者改善雄性生殖功能的产品中的用途。所述产品可以为但不限于食品、保健食品或者药物。

本发明所述吡咯喹啉醌的盐包括各种无机或有机酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、扁桃酸盐和草酸盐；或者，各种无机或有机碱盐如钠盐、钾盐、三羟甲基氨基甲烷或n-甲基-葡萄糖胺。

本发明所述雄性生殖功能障碍为雄性精子发生障碍，具体的，指精子质量异常和/或精子数量和运动异常。更具体的临床表现为无精症、少精症、弱精症或畸形精子症。

本发明的另一目的在于提供一种预防和/或治疗雄性生殖功能障碍、或者改善雄性生殖功能的食品、保健食品或者药物，包含吡咯喹啉醌或其盐。较佳的，含有0.1-99.9％重量百分比的作为活性成分的吡咯喹啉醌或其盐。

进一步的，所述的食品、保健食品或者药物还包含一种或多种载体、赋形剂和/或稀释剂。可采用片剂、胶囊、冲剂、口服液形式或者为含有吡咯喹啉醌或其盐的固体或液体食品。

所述载体包括但不限于：离子交换材料、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、自乳化药物传递系统(sedds)如d-维生素e聚乙二醇1000琥珀酸酯、吐温或其他类似聚合介质等药物制剂用的表面活性剂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸部分甘油酯混合、水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅胶、硅酸镁等。聚乙烯吡咯酮、纤维素物质、聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、乙烯-聚氧乙烯-嵌段聚合物和羊毛脂、环糊精如α-、β-、γ-环糊精或其经化学修饰的衍生物如2-和3-羟丙基-β-环糊精等羟烷基环糊精或其他可溶性衍生物等均可用于促进本发明的食品、保健食品或者药物的吸收和传递。

其他辅料如填充剂(如无水乳糖、淀粉、乳糖珠粒和葡萄糖)、粘合剂(如微晶纤维素)、崩解剂(如交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素和交联pvp)、润滑剂(如硬脂酸镁)、吸收促进剂、香味剂、甜味剂、稀释剂、赋形剂、润湿剂、溶剂、增溶剂和着色剂等也可加入本发明的食品、保健食品或者药物中。

上述吡咯喹啉醌或其盐以及含有吡咯喹啉醌或其盐的食品、保健食品或者药物可通过肠道或者非肠道途径摄入。可将吡咯喹啉醌或其盐添加入任何可食用的固体或液体食物中作为功能性食品，也可将吡咯喹啉醌或其盐作为单一活性成分或者与其它一种或多种活性成分联合制成保健食品或者药品。所述保健食品可采用片剂、胶囊、冲剂、口服液形式。所述药物制剂包括注射剂、霜剂、软膏剂、贴剂、喷雾剂等。给药途径包括皮下、皮内、动脉内、静脉内、肌内、关节内、滑液内、胸骨内、鞘内、病灶内、颅内注射或输注，或者，口服、局部、直肠、经鼻、经颊、阴道、舌下、皮内、粘膜、气管、尿道给药，或者通过吸入气雾或植入蓄积或者针刺方式给药。本发明所述吡咯喹啉醌或其盐以及食品、保健食品或者药物的治疗有效量为0.001-100mg/kg/d之间(以吡咯喹啉醌或其盐计)，可用于相关疾病的单一用药或联合用药治疗，为本领域技术人员能够理解的范围。

本发明利用bmi1缺失(bmi1^-/-)的雄性小鼠模型考察了吡咯喹啉醌治疗小鼠精子发生障碍的作用。bmi1^-/-雄性小鼠是一种典型的精子发生障碍的动物模型，主要表现为小睾丸、生精结构紊乱以及附睾中几乎无成熟精子产生。研究表明，bmi1^-/-小鼠睾丸组织中出现生精细胞严重的dna损伤，并因此导致生精细胞增殖降低以及凋亡显著增加。当给予断奶后3周龄bmi1^-/-小鼠pqq饮食补充4周后，吡咯喹啉醌能够明显纠正bmi1^-/-小鼠睾丸大小、恢复其生精结构并显著增加附睾尾部精子的产生，能够显著降低bmi1^-/-小鼠睾丸组织生精细胞dna损伤，并最终促进bmi1^-/-小鼠生精细胞增殖以及抑制生精细胞凋亡。

本发明首次将吡咯喹啉醌用于治疗雄性不育，并取得较为理想的治疗效果，为临床应用治疗雄性不育提供了一种新的防治选择，具有极高的应用价值。

附图说明

图1为pqq对bmi1缺失引起的精子发生障碍的影响。(a)7周龄雄鼠睾丸大小大体照。(b)7周龄雄鼠睾丸重量。(c)casa检测7w龄小鼠附睾尾部精子数目。(d)7周龄雄鼠睾丸切片he染色(400×)。(e)7周龄雄鼠附睾切片he染色(400×)。*,p<0.05；***,p<0.001与wt小鼠相比；###，p<0.001与bmi1^-/-小鼠相比。

图2为pqq对bmi1缺失小鼠睾丸组织中氧化应激以及dna损伤的影响。(a)流式细胞术检测7周龄雄鼠睾丸组织中ros水平及(b)生精细胞平均荧光强度统计图。(c)7周龄雄鼠睾丸切片8-ohdg染色显微图片(400×)及(d)8-ohdg阳性细胞数统计图。(e)7周龄雄鼠睾丸切片γ-h2a.x染色显微图片(400×)及(f)γ-h2a.x阳性细胞数统计图。*,p<0.05；***,p<0.001与wt小鼠相比；*,#<0.05；**,#<0.01；***,#<0.001与bmi1^-/-小鼠相比。

图3为pqq对bmi1缺失小鼠睾丸生精细胞增殖及凋亡的影响。(a)7周龄雄鼠睾丸切片pcna染色显微图片(400×)及(b)pcna阳性细胞数统计图。(c)7周龄雄鼠睾丸切片tunel染色显微图片(400×)及(d)tunel阳性曲细精管比率统计图。***,p<0.001与wt小鼠相比。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例

实验动物饲养、繁殖和鉴定

本发明研究中所有实验小鼠均由南京医科大学spf级实验动物中心饲养。

本研究采用bmi-1基因敲除杂合子小鼠(bmi1^+/-)(129ola/fvb/n杂交背景)(由荷兰肿瘤研究所antonberns教授惠赠)，进行雌雄配对合笼，以获得野生型(wt)和bmi1纯合子(bmi1^-/-)小鼠。取bmi1^+/-后代小鼠尾巴，提取dna,利用bmi1特异性引物进行扩增，凝胶电泳鉴定小鼠基因型，以获得实验所需纯合子雄性小鼠。

动物实验严格遵循南京医科大学动物实验管理规定，经动物实验伦理委员会审核。

药物处理

将3周龄bmi1^-/-小鼠随机分为普通饮食组或添加pqq(sigma,usa)(4mgpqq/kgdiet)(由北京科奥协力饲料有限公司合成)饮食组，以同窝wt小鼠作为对照。7周龄时将小鼠进行处理分析。

动物取材

7周龄小鼠经麻醉后，取下小鼠睾丸和附睾，左侧置于4％多聚甲醛中，右侧于-80℃保存。

睾丸、附睾切片

4％多聚甲醛固定后组织经系列酒精上行脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、横断面切片，片厚5μm用于组织化学和免疫组织化学染色。

组织化学、免疫组化以及tunel染色

1)he染色：睾丸及附睾切片经脱蜡、水化，he染色；

2)免疫组织化学染色：睾丸切片经脱蜡、水化以及高温法抗原修复后，孵育一抗过夜。第二天孵育二抗，dab显色。一抗：pcna(abcam,usa)，γ-h2a.x(ser139)(cellsignalingtechnology,usa)，8hydroxyguanosine(8-ohdg)(abcam,usa)。二抗：生物素结合的羊抗小鼠igg(fab段)抗体(sigma,usa)、生物素结合的羊抗兔igg(全分子)抗体(sigma,usa)、生物素结合的兔抗山羊igg(全分子)抗体(sigma,usa)；

3)tunel染色：睾丸切片经脱蜡、水化，按照凋亡试剂盒(roche,usa)说明书进行染色。

流式细胞术检测活性氧(ros)

取小鼠睾丸组织制备单细胞悬液，dcfda(sigma,japan)染色。流式细胞术检测生精细胞活性氧水平。

精子计数

取小鼠附睾尾部，放入37℃预热的pbs中，横向三刀纵向2刀剪开附睾尾部，使精子游离出来。放置5mins，上机检测。

实验结果

1.pqq对bmi1缺失小鼠精子发生障碍的影响

为了明确pqq能否够改善bmi1缺失小鼠的生精障碍，本发明通过检测睾丸大小、重量以及利用casa精子计数和he染色等方法，比较分析7周龄wt、bmi1^-/-以及pqq给予的bmi1^-/-雄鼠睾丸大小、重量、精子数量以及睾丸生精结构。结果如图1-a～e所示，图1-a为7周龄雄鼠睾丸大小大体照。图1-b为7周龄雄鼠睾丸重量。图1-c为casa检测7w龄小鼠附睾尾部精子数目。图1-d为7周龄雄鼠睾丸切片he染色(400×)。图1-e为7周龄雄鼠附睾切片he染色(400×)。*,p<0.05；***,p<0.001与wt小鼠相比；###，p<0.001与bmi1^-/-小鼠相比。结果表明，相较于bmi1^-/-雄鼠，pqq处理的bmi1^-/-雄鼠睾丸体积增大、睾丸重量及精子数量明显增加，生精结构也趋于正常。

对bmi1缺失引小鼠睾丸组织中氧化应激以及dna损伤的影响

为了明确pqq能否通过抑制氧化应激从而降低bmi1^-/-雄性小鼠生精细胞的dna氧化损伤以及dna损伤反应，本发明通过流式细胞术以及免疫组化，比较分析7周龄wt、bmi1^-/-以及pqq给予的bmi1^-/-雄鼠睾丸组织中活性氧(ros)、dna氧化损伤指标8-ohdg以及dna损伤反应指标γh2a.x水平的变化。结果如图2-a～f所示，图2-a为流式细胞术检测7周龄雄鼠睾丸组织中ros水平。图2-b为生精细胞平均荧光强度统计图。图2-c为7周龄雄鼠睾丸切片8-ohdg染色显微图片(400×)。图2-d为8-ohdg阳性细胞数统计图。图2-e为7周龄雄鼠睾丸切片γ-h2a.x染色显微图片(400×)。图2-f为γ-h2a.x阳性细胞数统计图。*,p<0.05；***,p<0.001与wt小鼠相比；*,#<0.05；**,#<0.01；***,#<0.001与bmi1^-/-小鼠相比。

结果表明，相较于bmi1^-/-雄鼠，pqq给予的bmi1^-/-雄鼠睾丸组织中ros水平显著降低、8-ohdg及γh2a.x阳性细胞数明显减少。表明pqq能够抑制bmi1^-/-雄性小鼠生精细胞细胞的dna氧化损伤以及dna损伤反应。

对bmi1缺失引小鼠睾丸生精细胞增殖及凋亡的影响

为了进一步明确pqq能否通过降低bmi1^-/-雄性小鼠睾丸组织氧化应激水平、生精细胞的dna氧化损伤以及dna损伤反应，从而促进生精细胞增殖、抑制生精细胞凋亡。本发明通过免疫组化，比较分析7周龄wt、bmi1^-/-以及pqq给予的bmi1^-/-雄鼠睾丸组织中增殖指标pcna以及凋亡指标tunel水平的变化。结果如图3-a～d所示，结果表明，相较于bmi1^-/-雄鼠，pqq给予的bmi1^-/-雄鼠睾丸组织中pcna阳性细胞数显著增加而tunel阳性曲细精管比率均显著降低，说明pqq能够促进bmi1^-/-小鼠生精细胞增殖、抑制生精细胞凋亡。