本发明涉及橙皮苷和/或柚皮苷在制备改善认知功能障碍药物中的应用。
背景技术：
：老年痴呆是发生在早老期及老年期的以进行性痴呆为特征的脑功能障碍而产生的智能损害综合征。包括老年性痴呆，又叫阿尔茨海默症(alzheimerdisease，简称ad)和脑血管性痴呆(vasculardementia，简称vd)两类。其中ad是一种发生于中老年人的原发性中枢神经系统退行疾病；vd是因脑血管病变引起的脑损害所导致的痴呆。vd的病因涉及两个方面，即脑血管病和危险因素。危险因素包括脑血管病的危险因素(高血压、高血脂、心脏病、糖尿病、普通性动脉硬化、吸烟)、卒中、缺血性脑白质病变、高龄及受教育程度低等。据不完全统计，在65岁以上人群中患重度老年性痴呆的比例为5％～8％，而到80岁，此比例就上升到15％～20％。目前我国老年性痴呆患者有600万人，占全球患者总数的1/3，每年新发病约180万人，死忘105.6万人，发病形势已经十分严峻，已成为现代社会导致老年人残疾和不能独立生活的主要原因，是严重威胁老年人健康的四大疾病之一。遗憾的是，迄今为止治疗老年性痴呆仍无良策，目前国内外市场上已有或即将面市的药物主要是胆碱能药物，常见的主要是胆碱酯酶抑制剂。他克林(商品名派可致)是第一种被批准用于老年性痴呆治疗的药物，但是该药的肝脏毒性较大，现已逐渐不被临床使用。多奈哌齐(商品名安理申)与他克林相比更为安全有效，一般建议在晚上睡前服，但对失眠的患者则建议白天服药。重酒石酸卡巴拉汀(商品名艾斯能)也是老年人认知障碍的重要治疗药物。国内外临床实验也提示该药对痴呆患者的认知症状及日常活动能力具有一定的改善作用，且副作用少。石杉碱甲(商品名双益平)是中科院上海药物研究所从千层塔(huperziaserrata.)中提取的一种生物碱，是一种高选择性胆碱酯酶抑制剂，具有一定的改善记忆和认知功能的作用。中医从整体观念出发，辩证论治，将老年痴呆分为五个证型：①肾虚髓减证；②气滞血瘀证；③痰浊阻窍证；④心肝阴虚证；⑤心脾两虚证。各证候又分别有症状分组量化表，可分为轻、中、重三个等级，并结合脑电地形图、脑血流图、头颅ct扫描、步态检查、脑脊液乙酰胆碱酯酶和tau蛋白含量等实验室指标加以评估。目前，全球在神经科学领域中有关老年痴呆地病因病理尚未清楚，老年痴呆的动物模型建立和药物研究方法尚不够成熟。实验动物常用小鼠或大鼠，方法可选：①自然衰老动物模型；②小鼠长时间吸入高浓度的臭氧致脑衰老动物模型；③给小鼠长期注射d-半乳糖致衰老模型；④加速老化小鼠模型(samp系列)，损毁中枢胆碱能神经元实验性ad动物模型；⑤化学药物整体应用致记忆障碍模型；⑦转基因小鼠模拟sdat型痴呆模型等。观察方法可选：避暗法、穿梭法，跳台法、水迷路法、电迷路法等都能较好地评价实验动物的学习记忆和空间探索能力。其中，避暗穿梭实验目的是测试大鼠近期和远期的学习记忆能力。morris水迷宫实验目的是测试ad模型大鼠学习记忆能力和空间探索能力。橙皮苷的结构为：分子式：c28h34o15，细树枝状针状结晶(ph6～7沉淀所得)。m.p.258～262℃，[α]d20-76°(c2，吡啶)。略微溶于甲醇及热冰醋酸，几乎不溶于丙酮、苯及氯仿，而易溶于稀碱及吡啶。柚皮苷的结构为：分子式：c27h32o14，在110℃干燥至衡重为二水物，m.p.171℃。[α]d19-82°(乙醇)。1克溶于1000ml水，溶于丙酮、乙醇、热醋酸和热水，不溶于乙醚、己烷和氯仿。据cn1704065a记载，橙皮苷和/或柚皮苷可用做苦味剂、发汗剂，还具有降胆固醇、治疗急慢性支气管炎、促进胃动力作用，但目前尚未发现橙皮苷和/或柚皮苷具有改善认知功能障碍药物中的作用。技术实现要素：申请人意外发现，橙皮苷和/或柚皮苷在制备改善认知功能障碍药物中的应用效果显著。本发明的第一方面，提供橙皮苷和/或柚皮苷在制备改善认知功能障碍药物中的应用。其中一种优选的实施方案，所述认知功能障碍为老年痴呆。其中一种更为优选的实施方案，所述老年痴呆为阿尔茨海默症。其中一种更为优选的实施方案，所述老年痴呆为脑血管性痴呆症。其中一种优选的实施方案，所述橙皮苷和柚皮苷，质量比例为1:9-9:1。本发明的第二方面，提供一种橙皮苷和/或柚皮苷的制备方法，所述橙皮苷和/或柚皮苷是从的含橙皮苷和/或柚皮苷的药材中提取而得。其中一种优选的实施方案，所述含橙皮苷和/或柚皮苷的药材可以是枳实、枳壳、柑橘、柠檬、葡萄柚、橘红、橙等。其中一种优选的实施方案，所述提取方法为：药材细粉，用乙醇提取，提取液回收乙醇至无醇味，加入蒸馏水，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，正丁醇萃取部位经浓缩干燥后，上d101型大孔树脂柱，依次用水、25％乙醇、50％乙醇和95％乙醇洗脱，50％乙醇洗脱部位经浓缩干燥后得含橙皮苷和/或柚皮苷的混合总苷，经硅胶柱层析分离得到橙皮苷和/或柚皮苷单体纯品。本发明所述的新橙皮甙也可以根据rosenmund(rosenmund，ber.，61，2608(1958))和zemlen，bognar(ber.，75，648(1942))描述的方法或其他化学方法进行合成得到。本发明的第三方面，提供一种药物组合物，包含橙皮苷和/或柚皮苷和至少一种药用载体。可采用本领域的常规方法制备成各种剂型，如颗粒剂、片剂、胶囊剂、针剂、丸剂、凝胶剂、提取物制剂、糖浆剂、茶剂等。本发明的第四方面，提供一种药物制剂，包含橙皮苷和/或柚皮苷。其中一种优选的实施方案，所述药物制剂为口服制剂。其中一种优选的实施方案，所述药物制剂使用时的给药剂量为20-300mg/人/次，每天1-3次。本发明的有益技术效果：1、橙皮苷和/或柚皮苷对ad大鼠的空间认知障碍有明显的改善作用。2、橙皮苷和/或柚皮苷能够明显提高脑组织sod活性，同时降低mda活性。3、橙皮苷和/或柚皮苷对ad大鼠的记忆功能障碍有明显的改善作用。4、橙皮苷和/或柚皮苷对实验性ad大鼠大脑皮层谷氨酸和升高有明显的抑制作用，能增加ad大鼠大脑皮层抑制性氨基酸及γ-氨基丁酸的含量。5、橙皮苷和/或柚皮苷对实验性ad大鼠大脑组织中β-ap的升高有明显的抑制作用。6、橙皮苷和/或柚皮苷对脑缺血引起的学习记忆功能下降有明显改善作用。7、进一步，质量比为1:9-9:1的橙皮苷和柚皮苷混合物在以上各方面表现出更为显著的技术效果。具体实施方式实施例1：橙皮苷和/或柚皮苷的制备枳实细粉600g，用70％乙醇提取3次(生药∶溶剂重量比为1：8；1：6；1：6)，合并提取液，回收乙醇至无醇味，加入蒸馏水至600ml，水液依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，每次300ml。正丁醇萃取部位经浓缩干燥后得82g，上d101型大孔树脂柱，依次用水、25％乙醇、50％乙醇和95％乙醇洗脱，50％乙醇洗脱部位经浓缩干燥后得20％以上的橙皮苷和柚皮苷的混合总苷(47g)，经硅胶柱层析分离得到橙皮苷(95％，20g)和柚皮苷(95％，15g)纯品。经分别与橙皮苷和柚皮苷标准品的ir、uv、nmr、m.p.和tlc比较，确定了以上两纯品的化学结构。实施例2：橙皮苷和柚皮苷混合物的制备将实施例1所得橙皮苷(2g)和柚皮苷(18g)以1∶9比例充分混合，搅拌、研磨得橙皮苷和柚皮苷的混合物(20g)。实施例3：橙皮苷和柚皮苷混合物的制备将实施例1所得橙皮苷(10g)和柚皮苷(10g)以1∶1比例充分混合，搅拌、研磨得橙皮苷和柚皮苷的混合物(20g)。实施例4：橙皮苷和柚皮苷混合物的制备将实施例1所得橙皮苷(18g)和柚皮苷(2g)以9∶1比例充分混合，搅拌、研磨得橙皮苷和柚皮苷的混合物(20g)。实施例5：橙皮苷和/或柚皮苷对实验性ad的防治作用的实验研究1.实验材料1.1实验动物：sd大鼠，体重160～200g，雌雄不拘，清洁级，由昆明医学院实验动物中心提供。1.2药物及试剂：将实施1所得橙皮苷和/或柚皮苷纯品实验前粉碎，过100目筛，溶于新鲜蒸馏水中，配成浓度为5％的水溶液贮存于4℃冰箱中备用；d-半乳糖，amrsco公司分装；鹅膏覃氨酸(ibotenicacid，简称ibo)，sigma公司购；石杉碱甲片(双益平)，50μg/片，购于上海复旦复华药业有限公司。1.3实验仪器：大鼠立定位仪，sn-2型，日本产；牙科钻车，307-6型，上海医用分析仪器厂；agilent1100系列hplc仪，美国agilent公司。高速冷冻离心机，上海医用分析仪器厂；ls-6500型液体闪烁计数器，美国beckmen公司。避暗箱：自制，箱长60cm，宽25cm，高30cm，分明暗两室，两室间有一直径为8cm大小的圆孔。室底均布有铜栅，暗室的铜栅可以通电，选用40v电压。明室上方装有2个25w的灯泡。morris水迷宫(morriswatermaze，简称mwm)，为一不锈钢圆形水池，直径200cm，高50cm，水深30cm，水温控制在(26±1)℃。池壁标明4个入水点，由此将水池等分为4个象限，以p、o、r、l分别表示平台象限、相对于平台象限的对侧象限、右侧象限和左侧象限，正中放置一个直径11cm，高29cm的平台。实验数据均用spss11.5统计软件包处理。2.实验方法与结果2.1橙皮苷和/或柚皮苷对老年性痴呆动物模型空间认知障改善的影响(morris水迷宫行为学实验)采用ibo致动物老年性痴呆模型，造模方法参照有关文献(徐叔云等主编，药理实验方法学，第三版，人民卫生出版社)。模型建成后，将存活动物随机分为7组：①手术对照组；②模型对照组；③石杉碱甲组；④实施例1所得橙皮苷100mg剂量组(相当于成人临床剂量的一半)；⑤实施例1所得柚皮苷100mg剂量组(相当于成人临床剂量的一半)；⑥实施例2所得混合物100mg剂量组(相当于成人临床剂量的一半)；⑦实施例3所得混合物200mg剂量组(相当于成人临床剂量的等效剂量)。各组连续灌胃2个月。此后进行morris水迷宫行为学实验，连续6天，实验分为两个阶段：(1)1～5天训练大鼠；(2)第6天进行有关行为学实验，结果见下表。表1：橙皮苷和/或柚皮苷对老年性痴呆动物模型空间认知障碍改善的影响(x±s)注：与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01结果显示，橙皮苷和/或柚皮苷对ad大鼠的空间认知障碍有明显的改善作用，特别是实施例2、3混合物组与模型组比较具有更为显著性的效果。2.2血清中sod、mda活性的测定在完成水迷宫测试后，用水合氯醛麻醉后，快速开胸，于心脏采血，3500r/min离心10min后取血清，置-70℃低温保藏。按试剂盒说明书，采用紫外光分光光度法测定各组实验大鼠血清中sod、mda的活性。表2：橙皮苷和/或柚皮苷对实验大鼠血清中sod、mda活性影响数据表组别剂量/mg.kg-1sod活力/u.ml-1mda/nmol.ml手术对照组--96.70±3.389.40±1.32模型组--60.20±2.35##21.88±3.86##石杉碱甲组2×10-588.91±3.15**13.45±2.25**实施例1所得橙皮苷10094.10±3.62*13.16±3.81*实施例1所得柚皮苷10093.92±3.16*13.44±3.29*实施例2混合物100100.16±3.58**12.45±3.57*实施例3混合物200108.5±4.28**10.22±3.45**注：与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与对照组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。实验结果表明，与模型组对比，橙皮苷和/或柚皮苷均能够明显提高脑组织sod活性，同时降低mda活性，其中橙皮苷和柚皮苷的混合物(实施例2、3)显示了更为显著的有益技术效果。2.3橙皮苷和/或柚皮苷对老年性痴呆动物记忆功能障碍改善的影响实验方法：将上述实验动物在给药2个月后，先将实验用大鼠置于避暗箱明箱内，当大鼠进入暗箱后，电击1秒，然后取出动物，1周后重复实验，记录大鼠由明箱进入暗箱的时间及次数、个数，实验结果如下表。表3：橙皮苷和/或柚皮苷对老年痴呆动物记忆功能障碍改善的影响(x±s)注：与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01结果显示，橙皮苷或/和柚皮苷对ad大鼠的记忆功能障碍有明显的改善作用，橙皮苷和柚皮苷混合物剂量组与模型组比较更有显著性差异；阳性药石杉碱甲也有一定的作用。2.4橙皮苷和/或柚皮苷对老年性痴呆大鼠大脑皮层组织匀浆氨基酸类神经递质的影响实验2.3结束后，取大鼠大脑皮层超声匀浆，用hplc方法测定氨基酸类神经递质的影响。表4：橙皮苷和/或柚皮苷对老年性痴呆大鼠大脑皮层组织匀浆氨基酸类神经递质的影响(x±s)注：与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与石杉碱甲组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。结果显示，橙皮苷和/或柚皮苷对实验性ad大鼠大脑皮层谷氨酸升高有明显的抑制作用，能增加ad大鼠大脑皮层抑制性氨基酸及γ-氨基丁酸的含量，与模型组比较均有显著差异。其中橙皮苷和柚皮苷混合物(实施例2、3)更为显著。2.5橙皮苷和/或柚皮苷对老年性痴呆大鼠大脑海马组织匀浆淀粉样肽(β-ap)的影响实验结束后，取大鼠大脑海马超声匀浆，用放免测定β-ap的含量，结果如下。表5：橙皮苷和/或柚皮苷对老年性痴呆大鼠大脑海马组织匀浆淀粉样肽(β-ap)的影响(x±s)组别鼠数剂量(mg/kg)β-ap(pg/ml)手术对照组8/41.75±16.60**模型组9/66.65±12.45石杉碱甲组82×10-556.89±15.49实施例1所得橙皮苷810052.25±13.10*实施例1所得柚皮苷810053.46±14.32实施例2混合物810051.21±11.45*实施例3混合物820047.20±5.28**注：与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。结果显示，橙皮苷和/或柚皮苷100、200mg剂量组对实验性ad大鼠大脑组织中β-ap的升高有明显的抑制作用，与模型组比较有显著性差异。实施例6：橙皮苷和/或柚皮苷nano2所致小鼠记忆障碍的影响1.实验材料1.1实验动物：icr小鼠，体重18-20g，清洁级，昆明制药集团实验动物中心。1.2药物及试剂：橙皮苷和/或柚皮苷，江西青峰药业有限公司提供，同实施例1，实验前粉碎，过100目筛，溶于新鲜蒸馏水中，配成浓度为5％的水溶液贮存于4℃冰箱中备用；金纳多片，含银杏叶提取物40mg/片，德国威玛舒培博士药厂生产公司。2.方法与结果昆明种小鼠70只，随机分为7组，各组灌胃给药7天后，除正常组外各组于训练后立即皮下注射nano2120mg/kg，各组于训练后24小时末次给药，并于给药后1小时进行跳台试验，记录动物犯错误的潜伏期和错误次数，结果如下。表6：橙皮苷和/或柚皮苷nano2所致小鼠记忆障碍的影响(x±s)注：与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。结果显示，橙皮苷和/或柚皮苷100、200、300mg剂量组对nano2所致小鼠记忆障碍均有明显的改善作用，能明显减少小鼠犯错误的次数，延长小鼠犯错误的潜伏期。实施例7：橙皮苷和/或柚皮苷对实验性血管性痴呆症(vd)大鼠学习记忆功能的影响1.实验材料1.1实验动物：雄性wistar大鼠，体重450-550g，清洁级，由昆明医学院实验动物中心提供。1.2药物及试剂：橙皮苷和/或柚皮苷，江西青峰药业有限公司提供，同实施例1，实验前粉碎，过100目筛，溶于新鲜蒸馏水中，配成浓度为5％的水溶液贮存于4℃冰箱中备用；金纳多片，含银杏叶提取物40mg/片，德国威玛舒培博士药厂生产公司。1.3实验仪器：避暗箱：自制，箱长60cm，宽25cm，高30cm，分明暗两室，两室间有一直径为8cm大小的圆孔。室底均布有铜栅，暗室的铜栅可以通电，选用40v电压。明室上方装有2个25w的灯泡。实验数据均用spss11.5统计软件包处理。2.方法与结果雄性wistar大鼠，置于避暗箱明箱内，当大鼠进入暗箱后，电击1秒，然后取出动物。次日用10％水合氯醛(0.3ml/100g)体重腹腔麻醉，固定于手术板上，先于头顶部开口，暴露第一颈椎横突翼小孔，用电烙铁烧灼双侧椎动脉，造成永久性闭塞，缝合皮肤。翻过大鼠，暴露并游离双侧颈总动脉，用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉5分钟，再灌注1小时，反复3次，缺血再灌，造成严重的学习记忆障碍，术后缝合肌肉、皮肤，肌注青霉素2天抗感染(朱愉主编，实验动物的疾病模型，天津科技翻译出版社)。实验用56只大鼠，随机分成7组：①手术对照组；②模型对照组；③金纳多对照组；④橙皮苷100mg剂量组(相当于成人临床剂量的一半)；⑤柚皮苷100mg剂量组(相当于成人临床剂量的一半)；⑥实施例2所得混合物100mg剂量组(相当于成人临床剂量的一半)；⑦实施例3所得混合物200mg剂量组(相当于成人临床的等效剂量)，每组8只。术后第二天开始用药，连续给药10天，最后一次给药后1小时，将大鼠依次放入避暗箱明箱内，每次一只，记录5分钟内进入暗箱的次数、只数及潜伏期，结果如下。表7：橙皮苷和/或柚皮苷对血管性痴呆大鼠记忆功能障碍改善的影响(x±s)注：与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，spns为橙皮苷和/或柚皮苷。结果显示，橙皮苷和/或柚皮苷对脑缺血引起的学习记忆功能下降有明显改善作用。通过上述实验，证明了橙皮苷和/或柚皮苷对老年性痴呆症和脑缺血引起的空间认知障碍和学习记忆功能下降有明显的改善效果。橙皮苷和/或柚皮苷能够显著提高实验大鼠脑组织sod活性，同时降低mda活性，能增加老年性痴呆大鼠大脑皮层抑制性氨基酸、甘氨酸及γ-氨基丁酸的含量，降低兴奋性谷氨酸的毒性，并能减少ad大鼠海马组织中β-ap的产生，对脑缺血引起的学习记忆功能下降也有明显的改善作用；还能明显改善nano2所致小鼠记忆障碍。当前第1页12