红曲霉发酵产物提取物、制备方法及其用途与流程

本发明涉及一种红曲霉发酵产物提取的新用途，具体地说是在制备具有提升人体皮肤酸碱缓冲能力功效的护肤品或护肤品添加剂中的用途。

背景技术：

红曲霉(Monascuspurpureus Went.)中文别名红曲、红糟、红大米。散囊菌目中的一属子囊菌曲霉科真菌。存在于树木、土壤和堆积物等。在麦芽汁琼脂培养基上生长良好，菌落初为白色，老熟后变成淡粉色、紫色或灰黑色，多形成红色。红曲可用于酿酒、制醋、做豆腐乳的着色剂和调味剂，也可做中药。红曲富含多种生物活性酶和生理活性物质，如洛伐他丁、莫纳可林、麦角固醇、γ-氨基丁酸、天然植物激素、抗菌活性物、红曲多糖等红曲菌的代谢产物，具有极高的营养、保健、药用价值，是一种天然、安全、有效的保健食品、药品原料。目前对于红曲的研究主要集中在红曲的抗菌、抗氧化、降血脂、抗炎、抗癌作用方面，主要应用在食品、保健品、药品中，其中红曲色素、莫纳可林、洛伐他丁应用较广泛。因红曲颜色深且红曲色素不稳定，在护肤品方面的深入研究暂时缺乏。

皮肤表面的酸碱度是由角质层水溶性物质、排除的汗和皮脂、皮肤表面的水溶性油脂层及排除的二氧化碳共同作用下形成的，是机体生物学活动在表皮的表达，还可影响角质形成细胞甚至真皮的生物学功能。皮肤的酸碱度跟遗传有关，也受环境影响。皮肤表面的pH值通常处于微酸状态(一般范围值在4～6.5之间)，而最健康富有弹性的皮肤pH值介于5至6之间。弱酸性的肌肤可以通过调节表皮内酶的活性影响皮肤屏障的成熟，也能保护皮肤对微生物的侵害。pH值低于5的酸性皮肤，与皮肤屏障相关的酶活力不是最佳，皮肤屏障不稳固，容易出现皮肤问题；pH值高于7的碱性皮肤容易内干外油，滋长细菌，生暗疮面疮，毛孔粗大，同时皮肤更容易受到外界刺激和微生物的侵害。皮肤自身有维持一定的酸碱缓冲能力来保证皮肤处于微酸状态，但长期处于不适合的酸碱度会使皮肤屏障受损，出现各种皮肤问题。维持皮肤最佳pH值是皮肤保健、延缓皮肤老化的方法，调节皮肤表面pH值是防止和加速某些皮肤问题改善的途径。

目前有很多护肤品以弱酸性作为宣传手段，但是这类护肤品只能利用其本身的弱酸性来影响皮肤酸碱性，涂抹后，皮肤在其弱酸性护肤品环境下呈弱酸性，一旦不使用或涂抹较长时间后，皮肤酸碱度就无法维持弱酸性。皮肤对此类护肤品依赖性较强，且长时间使用皮肤自身的酸碱度调节能力会越来越弱。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于提出一种红曲霉发酵产物的新用途，具体地说是红曲霉发酵产物经提取后得到的提取物在制备具有提升人体皮肤酸碱缓冲能力功效的护肤品中的用途。

本发明的第二目的在于提出一种红曲霉发酵产物提取物。

本发明的第三目的在于提出一种利用上述提取物制备得到的护肤品。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

红曲霉发酵产物提取物在制备具有提升人体皮肤酸碱缓冲能力功效的护肤品或护肤品添加剂中的用途。

所述红曲霉发酵产物提取物在护肤品中的添加量为1～50wt％。

上述红曲霉发酵产物为红曲霉菌在富含淀粉的基质上进行发酵后获得的产物。采用本领域公知的发酵方法发酵即可，得到的发酵产物经提取后均可实现本案技术效果。

上述红曲霉菌优选为曲霉科真菌紫色红曲霉MonasusPurpureus Went CGMCCNO.0272菌株。中华人名共和国药典2015年版一部中记载。该菌种为公知菌种，可以通过市售购买获得。

上述富含淀粉的基质为大米、黑米、薏仁米、小米、玉米、玉米芯、木薯、甘薯、黄豆、黑豆、豆粕、青稞、小麦、荞麦、燕麦、高粱、麦麸、米糠中的一种或几种混合。如果是多种混合，比例可以任意调节，推荐各成分之间采用质量比均为1：1的配比混合。本案富含淀粉的基质只要在上述范围内选取，具体品种及多品种之间的配比关系不会影响本案最终效果，因为无论选取何种基质如何配比均含有足够红曲霉发酵所用的淀粉等营养物质，不会对最终发酵产物产生影响。

本发明所述的红曲霉发酵产物的发酵方法推荐三种优选方法，分别如下述：

方法一自制红曲霉曲种发酵，具体步骤如下：

(1)选料浸蒸：将所述富含淀粉的基质在流水中浸泡12～72小时，浸泡后蒸熟，冷却至20℃以下备用；

(2)曲种制备：红曲霉曲糟的制备，将红曲米粉碎至10～400目细度，按质量比1：2～100向红曲米中加入清水，煮沸后降温至15～35℃，搅拌混合均匀制成曲糟；经过蒸熟冷却后的富含淀粉的基质中拌醋0.5～10wt％和所述曲糟0.5～20wt％配制成红曲霉曲种；

(3)室内发酵：将步骤(2)制备的曲种在曲房内堆成山形，温度40～50℃，一次发酵12～24小时；后铺散于地面，通风5～30分钟后再堆成山形，温度30～40℃二次发酵3～12小时；然后铺散于地面，保持室温不低于20℃，通风6～24小时后翻动一次，再6～24小时后再翻动一次，后每隔3～10小时翻动一次；

(4)加温发酵：用麻袋将步骤(3)发酵后的曲种装好，浸水10～30分钟，再回到曲房中进行室内发酵，保证室温大于等于30℃，堆成山形，密封1～3天后，铺散于地面，通风，均匀洒上清水，之后每隔1～2天翻动一次至出曲房为止；

(5)出房干燥：发酵9～14天后出曲房，干燥，得红曲霉发酵产物。

方法二固态发酵：上述红曲霉发酵产物还可以选择下述方法制备得到的，具体步骤如下：

(1)液体种子培养：将所述红曲霉菌利用固体培养基斜面培养，温度20～45℃培养1～10天；然后摇瓶培养：用接种环刮取试管斜面孢子接种到盛有适量液体培养基的三角锥形瓶中，温度20～45℃培养1～10天，得到液体种子液；

(2)固态发酵：选取所述富含淀粉的基质，清洗、蒸熟、冷却，将步骤(1)中所述液体种子液接种到处理后的基质上，液体种子液接种量为2～50wt％；温度20～45℃、搅拌速度10～500r/min，通风量0.1～5m³/m³·min，发酵2～20天后，喷雾干燥得红曲霉发酵产物。

方法三液态发酵：所述红曲霉发酵产物还可以由下述方法制备得到的，具体步骤如下：

(1)液体种子培养：取所述红曲霉菌种进行斜面培养，采用固体培养基培养，温度20～45℃培养1～10天；然后摇瓶培养：用接种环刮取试管斜面孢子接种到盛有液体培养基的三角锥形瓶中，温度20～45℃培养1～10天，得到液体种子液；

(2)液态发酵：将所述富含淀粉的基质粉碎至6目～400目，加水5～300倍(质量比)混合均匀，85～100℃糊化0.5～3小时，冷却得到液态或半固态基质，接种2～50wt％步骤(1)中所述液体种子液至处理后的该液态或半固态基质上，在温度20～45℃、搅拌速度10～500r/min，通风量0.1～5m³/m³·min环境下发酵2～20天后，喷雾干燥得红曲霉发酵产物。

所述固体培养基和液体培养基采用富含水、碳源、氮源、无机盐微生物生长必需的营养物质的培养基即可，目前可用于培养基中的碳源、氮源物质有很多类，在此不一一列举，公知的可用于微生物生长的培养基质均可应用于本案，原因如下：根据微生物的生长特点，一般微生物在能够为它提供碳源、氮源、无机盐、水等必需营养物质的生存环境中均可生长，一般碳源的主要形式是糖类，常见的如葡萄糖、蔗糖等；氮源则是含有NH4+或NO3-的各种盐类，盐类同时还提供微生物生长必需的元素，如磷、硫、镁、铁等。固体培养基和液体培养基的区别，只是添加了琼脂等，维持培养基的固体形态。本领域技术人员也可以通过市售购买得到红曲霉菌培养基。

上述三种方法发酵而成的红曲霉发酵产物经提取后效果更佳。

上述红曲霉发酵产物可以由本领域技术人员公知的发酵产物提取方法提取，所得提取物也可以达到本案所述技术效果。本案发明人推荐采用下述方法提取，具体步骤如下：

(1)提取：将上述制备得到的红曲霉发酵产物与水按料液比m/m 1:10～1:50混合，25～100℃的温度下提取0.5～3小时，得提取溶液；

(2)粗滤：将所述提取溶液过10目～400目滤布粗滤，得提取溶液粗滤液；

(3)脱色：将所述提取溶液粗滤液脱色，得脱色溶液；

(4)精滤：将所述脱色溶液精滤至澄清，得精滤液；

(5)将所述精滤液灭菌、防腐，即得。

灭菌及防腐方法可选择本领域技术人员公知方法，灭菌推荐优选85～100℃保温0.5～1小时灭菌。防腐推荐采用体积百分比为0.3wt％～1.5wt％苯氧乙醇，或苯氧乙醇与乙基己基甘油质量比为9:1的复配物作为防腐剂。

上述步骤(3)脱色为：使用活性炭或吸附树脂脱色，脱色剂用量为0.1wt％～5.0wt％，脱色温度为25～85℃，脱色时间为0.5～2小时。

一种具有提升人体皮肤酸碱缓冲能力功效的护肤品添加剂，其中，所述添加剂由上述方法制备得到的红曲霉发酵产物经上述提取方法提取得到。

一种具有提升人体皮肤酸碱缓冲能力功效的护肤品，其中，所述护肤品由上述的护肤品添加剂及护肤品领域可接受的辅料制成。

一种具有晒后修复固护皮肤屏障功效的护肤品，其中，所述护肤品由上述的护肤品添加剂及护肤品领域可接受的辅料制成。

本案所公开的发酵方法和提取方法可起到协同作用，可使提取物的功效更为显著。

本发明的有益效果：通过人体试验结果可知，本发明具有非常优异的提升皮肤自身酸碱缓冲能力的功效，解决了现有技术中皮肤酸碱调节完全和过度依赖护肤产品的问题，使用本发明产品一定时间停用后，皮肤在碱性或酸性环境刺激下可短时间内快速自行调节pH值至5～6的健康范围值内。较之现有技术中通过护肤品酸碱性造成弱酸性外部环境而调节皮肤pH值来说，是从根本改变皮肤状况，提高了皮肤自身抵御外界侵害的能力。

附图说明

图1为本发明试用7天、14天实验组与空白组pH值变化；

图注：(1)各测试时间点空白组数据类同且变化趋势相同，作图所得曲线重合，统一由空白组曲线表示；(2)停用后7天、停用后14天与使用14天后数据类同且变化趋势相同，作图所得曲线重合，统一由使用14天后曲线表示；

图2为体外pH缓冲能力实验：加入1.0mol/L HCL后的pH缓冲曲线；

图3为体外pH缓冲能力实验：加入1.0mol/L NaOH后的pH缓冲曲线；

图4为涂抹样品不同时间点后皮肤红斑指数E变化图。

具体实施方式

为了使本领域技术人员对本发明有更详细的了解，现举例说明本发明技术内容及技术效果，但举例说明不得作为对本案保护范围的限制。

本发明所用原料及试剂均可通过市售购买获得，本发明所有仪器设备也均是本领域技术人员公知设备。

本发明原料来源见表1所示，本发明使用设备见表2所示。

表1原料及来源

表2使用设备来源及型号

本具体实施方式中使用的固体培养基及液体培养基可以通过市售购买获得，也可以自行配置。自行配置推荐培养基成分及制备方法如下：固体培养基成分为：麦芽汁10～60g/L，琼脂5～20g/L，pH自然。制备方法为：按照目标培养基各成分含量称取相应质量的各成分和水，混合均匀，121℃灭菌30min，冷却至15～35℃。液体培养基成分为：葡萄糖5～30g/L、蛋白胨5～10g/L、硝酸钠1～5g/L、MgSO4·7H2O 0.5～3g/L；制备方法为：按照目标培养基各成分含量称取相应质量的各成分和水，混合均匀，121℃灭菌30min，冷却至15～35℃。本领域技术人员公知的其他利于微生物生长的培养基也可应用于此。

实施例1本发明红曲霉发酵产物的制备

(1)选料浸蒸：选取大米，流水中浸泡36小时，浸泡后蒸熟，冷却至20℃以下备用；

(2)曲种制备：红曲霉曲糟的制备，将红曲米粉碎至10目细度，按质量比1：2向红曲米中加入清水，煮沸后降温至15℃，搅拌混合均匀制成曲糟；经过蒸熟冷却后的富含淀粉的基质中拌醋0.5wt％和所述曲糟0.5wt％配制成红曲霉曲种；

(3)室内发酵：曲种在曲房内堆成山形，保证曲房内洁净度及湿度。温度40℃，一次发酵24小时；后铺散于地面、通风30分钟后再堆成山形，温度30℃二次发酵12小时；然后铺散于地面，保持室温不低于20℃，通风12小时后翻动一次，再12小时后再翻动一次，后每隔3小时翻动一次；

(4)加温发酵：在发酵第4天，用麻袋将曲种装好，放入水池中浸水20分钟，再回到曲房中进行室内发酵，保证室温不低于30℃，堆成山形、密封3天后，铺散于地面，通风，均匀洒上清水，所洒清水总质量约为曲料质量的50％，之后每隔一天翻动一次至出曲房为止；

(5)出房干燥：发酵9天后，转移至烈日下曝晒至干燥，得红曲霉发酵产物。

实施例2本发明红曲霉发酵产物的制备

(1)选料浸蒸：选取大米和黑米，按1:1比例混合，流水中浸泡72小时，浸泡后蒸熟，冷却至20℃以下备用；

(2)曲种制备：红曲霉曲糟的制备，将红曲米粉碎至100目细度，按质量比1：50向红曲米中加入清水，煮沸后降温至35℃，搅拌混合均匀制成曲糟；经过蒸熟冷却后的富含淀粉的基质中拌醋3wt％和所述曲糟5wt％配制成红曲霉曲种；

(3)室内发酵：曲种在曲房内堆成山形，保证曲房内洁净度及湿度。温度50℃，一次发酵24小时；后铺散于地面、通风15分钟后再堆成山形，温度40℃二次发酵6小时；然后铺散于地面，保持室温不低于20℃，通风24小时后翻动一次，再24小时后再翻动一次，后每隔8小时翻动一次；

(4)加温发酵：在发酵第5天，用麻袋将曲种装好，放入水池中浸水10分钟，再回到曲房中进行室内发酵，保证室温不低于30℃，堆成山形、密封2天后，铺散于地面，通风，均匀洒上清水，所洒清水总质量约为曲料质量的50％，之后每隔一天翻动一次至出曲房为止；

(5)出房干燥：发酵10天后，转移至烈日下曝晒至干燥，得红曲霉发酵产物。

实施例3本发明红曲霉发酵产物的制备

(1)选料浸蒸：选取大米、小米和燕麦，按1：1：1比例混合，流水中浸泡12小时，浸泡后蒸熟，冷却至20℃以下备用；

(2)曲种制备：红曲霉曲糟的制备，将红曲米粉碎至400目细度，按质量比1：100向红曲米中加入清水，煮沸后降温至20℃，搅拌混合均匀制成曲糟；经过蒸熟冷却后的富含淀粉的基质中拌醋10wt％和所述曲糟20wt％配制成红曲霉曲种；

(3)室内发酵：曲种在曲房内堆成山形，保证曲房内洁净度及湿度。温度45℃，一次发酵12小时；后铺散于地面、通风5分钟后再堆成山形，温度40℃二次发酵3小时；然后铺散于地面，保持室温不低于20℃，通风6小时后翻动一次，再6小时后再翻动一次，后每隔10小时翻动一次；

(4)加温发酵：在发酵第4天，用麻袋将曲种装好，放入水池中浸水30分钟，再回到曲房中进行室内发酵，保证室温不低于30℃，堆成山形、密封1天后，铺散于地面，通风，均匀洒上清水，所洒清水总质量约为曲料质量的50％，之后每隔一天翻动一次至出曲房为止；

(5)出房干燥：发酵14天后，转移至烈日下曝晒至干燥，得红曲霉发酵产物。

实施例4本发明红曲霉发酵产物的制备

(1)液体种子培养：将所述红曲霉菌利用固体培养基斜面培养1天(温度45℃)；然后用接种环刮取试管斜面孢子接种到盛有适量液体培养基的三角锥形瓶中，进行摇瓶培养1天(温度45℃)，得到液体种子液；

(2)固态发酵：选取玉米粒，清洗、蒸熟、冷却，将步骤(1)得到的液体种子液接种到处理后的基质上，液体种子液接种量为50wt％；温度20℃、搅拌速度10r/min，通风量0.1m³/(m³·min)，发酵20天后，喷雾干燥得红曲霉发酵产物。

实施例5本发明红曲霉发酵产物的制备

(1)液体种子培养：将所述红曲霉菌利用固体培养基斜面培养10天(温度25℃)；然后用接种环刮取试管斜面孢子接种到盛有适量液体培养基的三角锥形瓶中，进行摇瓶培养10天(温度25℃)，得到液体种子液；

(2)固态发酵：选取小麦、燕麦和麦麸，各基质质量比1:1，混合，清洗、蒸熟、冷却，将步骤(1)得到的液体种子液接种到处理后的基质上，液体种子液接种量为2wt％；温度45℃、搅拌速度500r/min，通风量5m³/(m³·min)，发酵2天后，喷雾干燥得红曲霉发酵产物。

实施例6本发明红曲霉发酵产物的制备

(1)液体种子培养：将所述红曲霉菌利用固体培养基斜面培养5天(温度25℃)；然后用接种环刮取试管斜面孢子接种到盛有适量液体培养基的三角锥形瓶中，进行摇瓶培养5天(温度25℃)，得到液体种子液；

(2)固态发酵：选取大米、黑豆和麦麸，各基质质量比1:1，混合，清洗、蒸熟、冷却，将步骤(1)得到的液体种子液接种到处理后的基质上，液体种子液接种量为30wt％；温度30℃、搅拌速度200r/min，通风量3m³/(m³·min)，发酵10天后，喷雾干燥得红曲霉发酵产物。

实施例7本发明红曲霉发酵产物的制备

(1)液体种子培养：取红曲霉菌种用固体培养基进行斜面培养，温度30℃培养3天；然后摇瓶培养：用接种环刮取试管斜面孢子接种到盛有液体培养基的三角锥形瓶中，30℃恒温摇床培养3天，得到液体种子液；

(2)液态发酵：选大米，粉碎至6目，加水15倍(质量比)混合均匀，85℃糊化3小时，冷却得到液态基质，将步骤(1)中所述液体种子液接种到处理后的基质上，液体种子液接种量为5wt％，在温度30℃、搅拌速度180r/min，通风量1m³/(m³·min)发酵3天后，喷雾干燥得红曲霉发酵产物。

实施例8本发明红曲霉发酵产物的制备

(1)液体种子培养：取红曲霉菌种进行斜面培养，固体培养基培养，温度20℃培养10天；然后摇瓶培养：用接种环刮取试管斜面孢子接种到盛有液体培养基的三角锥形瓶中，20℃恒温摇床培养10天，得到液体种子液；

(2)液态发酵：选大米、甘薯和荞麦，各基质质量比1:1，混合粉碎至100目，加水5倍(质量比)混合均匀，100℃糊化0.5小时，冷却得到半固态基质，将步骤(1)中所述液体种子液接种到处理后的基质上，液体种子液接种量为50wt％，在温度20℃、搅拌速度10r/min，通风量5m³/(m³·min)发酵20天后，喷雾干燥得红曲霉发酵产物。

实施例9本发明红曲霉发酵产物的制备

(1)液体种子培养：取红曲霉菌种进行斜面培养，固体培养基培养，温度45℃培养1天；然后摇瓶培养：用接种环刮取试管斜面孢子接种到盛有液体培养基的三角锥形瓶中，45℃恒温摇床培养1天，得到液体种子液；

(2)液态发酵：选大米、小麦和麦麸，各基质质量比1:1，混合粉碎至400目，加水300倍(质量比)混合均匀，90℃糊化2小时，冷却得到液体基质，将步骤(1)中所述液体种子液接种到处理后的基质上，液体种子液接种量为2wt％，在温度45℃、搅拌速度500r/min，通风量0.1m³/(m³·min)发酵2天后，喷雾干燥得红曲霉发酵产物。

实施例10本发明红曲霉发酵产物提取物的制备

(1)提取：将实施例1制备的红曲霉发酵产物20g与纯净水按料液比m/m 1:10混合，25℃的温度下采用超声提取，超声频率为22KHz，提取时间0.5小时，得提取溶液；

(2)粗滤：将所述提取溶液常温下静置1h，上清液过200目滤布粗滤，得提取溶液粗滤液；

(3)脱色：将上述粗滤液用活性炭脱色，活性炭用量为0.1wt％，脱色温度25℃，脱色时间2h，得脱色溶液；

(4)精滤：将上述脱色溶液静置冷却至常温，进行抽滤，抽滤至澄清，得精滤液；

(5)将上述精滤液灭菌(90℃保温0.5小时)、防腐(添加0.8wt％苯氧乙醇)，即得。

实施例11本发明红曲霉发酵产物提取物的制备

(1)提取：将实施例7制备的红曲霉发酵产物20g与纯净水按料液比m/m 1:20混合，60℃的温度下加热搅拌提取(200r/min)，提取时间3小时，得提取溶液；

(2)粗滤：将所述提取溶液常温下静置1h，上清液过400目滤布粗滤，得提取溶液粗滤液；

(3)脱色：将上述粗滤液用活性炭脱色，活性炭用量为1wt％，脱色温度80℃，脱色时间0.5h，得脱色溶液；

(4)精滤：将上述脱色溶液静置冷却至常温，进行抽滤，抽滤至澄清，得精滤液；

(5)将上述精滤液灭菌(85℃保温1小时)、防腐(添加0.8wt％苯氧乙醇与乙基己基甘油(质量比为苯氧乙醇：乙基己基甘油＝9:1)复配物)。

实施例12本发明红曲霉发酵产物提取物的制备

(1)提取：将实施例4制备的红曲霉发酵产物40g与纯净水按料液比m/m 1:50混合，100℃的温度加热搅拌提取(300r/min)，提取时间1小时，得提取溶液；

(2)粗滤：将所述提取溶液常温下静置1h，上清液过10目滤布粗滤，得提取溶液粗滤液；

(3)脱色：将上述粗滤液用大孔吸附树脂进行吸附脱色，湿树脂体积为料液量的5％，树脂径高比为1:8，上样速度为2～4BV·h^-1，吸附时间为2h，得脱色溶液；

(4)精滤：将上述脱色溶液静置冷却至常温，进行抽滤，将所述脱色溶液精滤至澄清，得精滤液；

(5)将所述精滤液灭菌(85℃保温1小时)、防腐(1.0wt％苯氧乙醇)。

本发明功效实验

1.提升皮肤自身酸碱缓冲能力功效研究

皮肤酸碱缓冲能力是指皮肤在自身或外界条件下保持稳定的酸碱度的能力。该能力是皮肤自身的调节能力，并非由外界酸碱剂控制。提升皮肤自身的酸碱缓冲能力远远比单纯的弱酸性护肤品造成的人体皮肤弱酸性环境更有意义。

人体功效验证试验具体开展如下：

志愿者选取：选取60名身体、肌肤健康志愿者，年龄18～50岁，男性30名、女性30名，平均年龄30.27±7.85岁。(排除条件：1.妊娠或哺乳期妇女；2.脸颊处有色素沉着、疤痕或其他皮肤损伤；3.通过前期初筛对实验组水、乳、霜套装有过敏现象者；4.其他系统性相关疾病者；5.不愿配合试验者。)

实验分组：根据单盲、随机法分为2组(每组30人，保证每组男女各15人)：A组30人：左侧脸为实验组、右侧脸为空白组；B组30人：右侧脸为实验组、左侧脸为空白组。受试者样品涂抹区域为半脸，测试区域为脸颊(测试点为眼角垂直向下与鼻尖水平延长线的交点，最好在颧骨凸出区域)，每个测试区域大小为1cm*1cm。

测试要求：测试环境要求为室温20～22℃、湿度40～50％、无日晒无风吹的室内环境。每次pH值测试实验开展前要求受试者提前30min进入测试环境内静坐，测试仪器为皮肤酸碱度测试仪(Meter PH905，德国CK公司)，每个测试时间点测试受试者实验组及空白组测试区域pH值，每次重复检测3次，结果取平均值。

前期准备：受试者参与此项目前4周停止使用自有护肤产品、停用2周后开始使用空白组水、乳、霜基质套装(空白组水、乳、霜基质套装已通过前期试验验证确认对皮肤pH值无影响)，全脸涂抹、每天早晚2次。

试验过程：

1)样品使用：半脸涂抹试验开展：每日早晚用清水洗脸后，实验组与空白组半脸涂抹，依次均匀涂抹水、乳、霜各1mL，每日早晚2次，样品使用试验周期为14天。

其中空白组使用护肤水、乳、霜基质套装；实验组使用含5wt％实施例11制备提取物的护肤水、乳、霜套装。(实验组水、乳、霜均只用5wt％实施例11提取物替代空白组基质中5wt％水，其余无差别)。

表3护肤水基质配方

表4护肤乳基质配方

表5护肤霜基质配方

2)样品停用：在半脸涂抹试验开展14天后，全脸均停止使用样品，样品停用试验周期为14天，在停用后14天内不使用任何护肤品。只有停用样品一段时间后再进行测试才能真正反映出皮肤自身调节pH值能力是否有改善，而避免了护肤品本身pH值对皮肤pH值的影响。

数据采集：

1)样品使用阶段：

在使用样品0天、7天、14天后，使用皂基洗面奶(碱性，经检测pH为8.5)清洗全脸、随后用适量pH＝7.0的去离子水冲洗全脸皮肤表面，清洗后不使用任何护肤产品，检测清洗后0min、10min、30min、1h、3h、6h实验组及空白组测试区域pH值，总结皮肤pH值向基线变化的趋势、测定出pH值恢复到基线稳定的时间。

2)样品停用阶段：

使用14天后，全脸停止使用样品(时间点为使用后14天即为停用后0天)，在停用样品后7天、14天分别进行试验，停用后的空白期内不使用任何护肤品(每日早晚用清水洗脸，洗脸后不再涂抹任何护肤品)，分别在停用7天、14天后使用皂基洗面奶(碱性，经检测pH为8.5)清洗全脸，随后用适量pH＝7.0的去离子水冲洗全脸皮肤表面，清洗后不使用任何护肤产品，检测清洗后0min、10min、30min、1h、3h、6h实验组及空白组测试区域pH值，总结皮肤pH值向基线变化的趋势、测定出pH值恢复到基线稳定的时间。

数据统计：采用SPSS19.0数据处理系统对皮肤pH值进行统计分析，所有结果以均值表示，两组间t检验确定各组间差异的显著性，用方差分析验证多组间差异显著性。其中各测试时间点实验组与空白组进行比较，P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有极显著性差异。

表6pH值变化试验结果

结果分析：

由上表pH值变化可看出，人体肌肤在受到外界刺激(皂基洗面奶)时，pH会迅速增加呈碱性，随着时间推移会逐渐回复，一般在6h左右回复至基线；0天实验组和0天空白组数据可验证该实验可排除左右脸误差带来的影响，0天空白组、使用后7天空白组、使用后14天空白组数据数值及趋势类同，验证使用空白组水、乳、霜套装不会影响肌肤的pH缓冲能力；0天空白组、使用后7天空白组、使用后14天空白组、停用后7天空白组、停用后14天空白组数据数值及趋势类同，验证使用、停用空白组水、乳、霜套装均不会影响肌肤的pH缓冲能力。

使用后7天实验组pH值变化与空白组数据进行比较可看出，使用本发明提取物的水、乳、霜套装的皮肤可在清洗后1小时迅速恢复弱酸性pH 5.85，显现更健康的肌肤状态；而空白组需要在清洗后6小时恢复弱酸性pH 5.62。

使用后14天实验组pH值变化与空白组数据进行比较可看出，使用本发明提取物的水、乳、霜套装的皮肤可在清洗后30分钟即可迅速恢复弱酸性pH 5.93，显现更健康的肌肤状态；而空白组需要在清洗后6小时恢复弱酸性pH 5.59。

停用后7天实验组pH值变化与空白组数据进行比较可看出，使用本发明提取物的水、乳、霜套装的皮肤可在清洗后30分钟迅速恢复弱酸性pH 5.90，显现更健康的肌肤状态；而空白组需要在清洗后6小时恢复弱酸性pH 5.60。

停用后14天实验组pH值变化与空白组数据进行比较可看出，使用本发明提取物的水、乳、霜套装的皮肤可在清洗后1小时即可迅速恢复弱酸性pH 5.54，显现更健康的肌肤状态；而空白组需要在清洗后6小时恢复弱酸性pH 5.58。

使用后与停用后7天、14天实验组与空白组数据作图1，由图1曲线趋势可看出当皮肤受到外界刺激(皂基洗面奶)时，使用添加本发明提取物的水、乳、霜套装的皮肤pH值能够在更短的时间内回复至正常水平，且使用时间长短与皮肤pH值回复正常水平时间呈负相关，即肌肤使用本发明提取物的水、乳、霜套装的时间越长，受到外界刺激时皮肤pH回复至正常水平所需时间越短；同时也可以看出在停止使用本产品7天、14天后当皮肤受到外界刺激(皂基洗面奶)时，使用过添加本发明提取物的水、乳、霜套装的皮肤能够在更短的时间内回复至正常水平，且回复的时间均与使用14天后几乎一致，说明本发明提取物不是利用其本身的弱酸性来影响皮肤酸碱性，而且皮肤对本发明提取物不会产生依赖性。本发明提取物是通过提升皮肤自身的酸碱缓冲能力，以更有利于皮肤抵抗外界刺激。发明人利用其他实施例得到的提取物重复上述实验结果同上述。

2.较优添加量试验

本案提取物可以添加到不同剂型的护肤品中使用，直接使用同样具有护肤效果。但是考虑到成本等问题，发明人目前给的建议添加量为效果佳、成本也容易被客户接受的添加量。

依据上述提升皮肤自身酸碱缓冲能力功效研究的试验方法，实验组分别替换为含1wt％(实验组I)、20wt％(实验组II)、50wt％(实验组III)实施例11制备提取物的护肤水、乳、霜套装(空白组不变)，再分别开展试验考察含不同浓度的本发明所述产品提升皮肤自身酸碱缓冲能力的功效。

本发明制备的提取物具有良好的PH值缓冲能力，在使用浓度1-50％范围内均具有较好的酸碱缓冲效果。

表7不同添加浓度产品pH值变化试验结果

3.体外：pH缓冲能力试验

1)实验过程：

(1)向相同体积的各溶液中依次加入已知体积的1.0mol/L HCL溶液，用pH计测定各溶液的pH值，画出各溶液对酸的缓冲曲线1，如图2所示；

(2)向相同体积的各溶液中依次加入已知体积的1.0mol/L NaOH溶液，用pH计测定各溶液的pH值，画出各溶液对碱的缓冲曲线2，如图3所示。

2)试验结果如下：

表8去离子水、实施例11提取物及其对照品水溶液加入不同体积1.0mol/L HCL后pH值变化

表9去离子水、实施例11及其对照品水溶液加入不同体积1.0mol/L NaOH后pH值变化

3)试验结论：综合图2及图3数据可看出：本发明提取物有良好的体外pH缓冲能力，对外界不良刺激可以起到保护皮肤不受侵害的作用。发明人利用其他实施例得到的提取物重复上述实验结果同上述。

4、人体晒后修复功效研究

在固定的条件(光源和距离)下，通过光源照射引起皮肤产生可见光敏反应。皮肤色度测试仪Mexameter MX18是针对皮肤的两种主要色基黑素和血红蛋白而设计的，其结果输出以色素指数(M)和红斑指数(E)表示。本案通过使用含5wt％实施例11红曲霉发酵产物提取物的啫喱与空白啫喱对照，通过皮肤色度测试仪Mexameter MX18测定皮肤在不同时期的红斑指数E，反映皮肤红斑现象的变化，以表征含红曲霉发酵产物提取物的化妆品的晒后修复效果。

试验方法：本试验志愿者选取及紫外线照射试验方法严格参考《化妆品安全技术规范2015年版》中防晒化妆品防晒指数(SPF值)测定方法中志愿者选取原则及试验方法。

每名志愿者背部选取两块面积不小于30cm²的平坦区域，紫外线照射光源为氙弧灯日光模拟器并配有恰当的光学过滤系统，以致最小红斑量(MED值)的紫外线照射至红斑出现，区域1作为空白组(涂抹空白啫喱，涂抹量(2.00±0.05)mg/cm²)，区域2为实验组(涂抹含5wt％红曲霉发酵产物提取物的啫喱，涂抹量(2.00±0.05)mg/cm²)，其中实验组含5wt％红曲霉发酵产物提取物的啫喱只用5wt％红曲霉发酵产物提取物替换空白啫喱基质中5wt％的水，其余无差别；随后每隔6h进行一次红斑指数E，每个部位测量三次取平均值。

表10空白啫喱配方表

实验结果如下：

表11涂抹样品后不同时间点后皮肤红斑指数E

结论：实验组含5wt％红曲霉发酵产物提取物的啫喱可有效降低晒后红斑指数，减轻晒后红斑的数量，对晒中及晒后皮肤具有很好的修复效果。发明人利用其他实施例得到的提取物重复上述实验结果同上述。