本发明属于纳米药物载体技术领域，具体涉及一种载EGCG的卵清蛋白纳米粒子制备方法、表征和应用。
背景技术：
溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis, UC）是炎症性肠病中最重要的一种，其病因可能包括环境、感染、免疫和遗传等因素。携带某些特殊基因的人群可能更易患UC。据资料显示，溃疡性结肠炎在欧美国家发病率较高，以美国为例，发病率高达2‰。UC通常随着时间推移，症状逐渐恶化。随着国民生活水平的提高，UC在中国近年报道的病例也明显增多，综合多家医院病例的统计推测，溃疡性结肠炎的患病率为11.6/10万，实际病例可能更多。UC已成为中国消化系统常见疾病和慢性腹泻的主要原因，且患者多为青壮年，因此日益受到重视。
天然活性物质具有消炎、抗癌、抗氧化等生理活性，广泛分布于多种植物，海洋生物和微生物中，目前天然活性物质的开发和研究已成为国内外药品、食品研究和生命科学研究的热点。本发明中所用到的EGCG即为从茶叶中提取的生物活性物质儿茶素的主要成分，但是天然活性物质也有不可避免的缺陷，大多数天然活性物质稳定性差，易被氧化，且易在碱性或酸性条件下分解，所以研究开发优良的药物递送系统非常必要。近几年来，新颖的药物递送系统已经成为药剂学领域研究的热门，各种研究成果已被广泛应用，其中纳米载体药物递送系统则是新型药物递送系统研究的主流，而纳米载体药物递送系统研究的重点是寻找或合成具有生物相容性好、可降解、低生物毒性等优良性能的载体材料。
因此，我们用卵清蛋白这个生物相容性好、低毒性、来源广泛的球蛋白与具有良好抗炎性能的天然活性物质EGCG自组装制备成为新型的药物递送体系，给UC治疗提供一个切实可行的治疗试剂。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种载EGCG的卵清蛋白纳米粒子，其具有良好的生物相容性，稳定性，可用于溃疡型结肠炎的治疗，本发明的目的之二在于提供上述载EGCG的卵清蛋白纳米粒子的制备方法。
为实现上述发明目的，技术方案为：
载EGCG的卵清蛋白纳米粒子的制备方法包括以下步骤：
（1）称取卵清蛋白（OVA）于50 mL的离心管中，然后加入pH 6.6的PBS缓冲液，涡旋充分溶解，水化过夜；
（2）将水化过夜的卵清蛋白溶液离心后收集上清液，除去不溶杂质；
（3）将步骤（2）中的所得的溶液在80℃水浴中保持20 min；
（4）将步骤（3）的溶液水浴结束后,往溶液中立刻加入EGCG，此时溶液变成乳浊液；
（5）将步骤（4）得到的含EGCG的乳浊液涡旋30 s，然后立刻用流水冷却至室温；
（6）将步骤（5）得到的乳浊液液立刻放入冰浴中，探头超声1 min;
（7）将步骤（6）得到的乳浊液液低度离心收集上清液；
（8）将步骤（7）得到的上清液再次进行离心后，弃去上清液，收集粒子；
（9）将步骤（8）收集的粒子重新悬浮在二次水，冷冻干燥后放入-20℃冰箱储存备用。
优选的，所述步骤（1）中，OVA的质量为100 mg，水化过夜在室温下进行，pH 6.6的PBS缓冲液40 mL。
优选的，所述步骤（2） 中，离心速率为4000-6000 rpm，离心时间是10 min。
优选的，所述步骤（4）中，加入EGCG的浓度为1 mg/mL，体积为2 mL。
优选的，所述步骤（7）中，离心速率为5000-7000 rpm ，离心时间是10 min。
优选的，所述步骤（8）中，离心速率为12000-13000 rpm，离心时间为20 min。
优选的，所述步骤（9）中，冷冻干燥按照以下方法进行：在-80℃冷冻过夜后置于冻干机中冻干12～36 h。
相对于现有的技术，本发明的优点在于：
1. 本发明首先通过将卵清蛋白加热变性，然后利用降温过程使卵清蛋白和EGCG自组装成纳米粒子，整个制备方法及制备过程简单快捷，卵清蛋白来源广泛，纳米粒子制备周期短，产率高。
2. 本发明通过将EGCG与卵清蛋白自组装制备纳米粒子，对EGCG起到了保护作用，减少了其在到达病灶部位之前的氧化分解，提高了其在体内的半衰期，并且纳米粒子更易被细胞吞噬，能够更好地将EGCG带到病灶部位，增加疗效。
3. 本发明引入卵清蛋白为载体，由于卵清蛋白为球蛋白，所以其二硫键易被谷胱甘肽（GSH）还原而球状结构解体，因此载EGCG卵清蛋白纳米粒子具有GSH响应性，在体内具有更好的控释效果，易于在病灶部位积累。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：
图1是实施例2的载EGCG的卵清蛋白纳米粒子的场发射扫描电镜图。
图2是实施例2的载EGCG的卵清蛋白纳米粒子药物体外释放曲线。
图3是实施例2的静脉注射载EGCG的卵清蛋白纳米粒子和静脉注射游离EGCG对小鼠溃疡性结肠炎的治疗效果对比。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1
实施例1为载EGCG卵清蛋白纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
（1）称取卵清蛋白（OVA）于50 mL的离心管中，然后加入pH 6.6的PBS缓冲液，涡旋充分溶解，水化过夜；
（2）将水化过夜的卵清蛋白溶液离心后收集上清液，除去不溶杂质；
（3）将步骤（2）中的所得的溶液在80℃的水浴中保持20 min；
（4）将步骤（3）的溶液水浴结束后，往溶液中立刻加入EGCG，此时溶液变成乳浊液；
（5）将步骤（4）得到的含EGCG的乳浊液进行涡旋30 s，然后立刻用流水冷却至室温；
（6）将步骤（5）得到的乳浊液立刻放入冰浴中，探头超声1 min;
（7）将步骤（6）得到的乳浊液低速离心后收集上清液；
（8）将步骤（7）得到的上清液再次进行离心后，弃去上清液，收集粒子；
（9）将步骤（8）收集的粒子重新悬浮在二次水，冷冻干燥后放入-20℃冰箱储存备用。
实施例2
试验1：纳米粒子的形貌通过场发射扫描电子显微镜观察。首先将冻干的纳米粒子悬浮在在二次水或PBS缓冲液中，并且稀释到适当的浓度，然后将悬浮液滴加到硅片上风干，分析之前，纳米粒子需经过真空喷铂处理。
图1为纳米粒子的场发射扫描电镜图。从得到的电镜照片可以看出，纳米粒子呈球状，粒径分布较均一，密集堆积，这也是蛋白质纳米粒子的特征。
试验2：为了模拟药物的体内释放情况，释放液选用 pH = 7.4和pH=6.8的磷酸盐缓冲液模拟体内的酸碱度。首先，准确称取适量纳米粒子（纳米粒子的质量按载药量计算，EGCG含量为200 μg）悬浮在两毫升的释放液中，然后将纳米粒子悬浮液注入事先处理好的透析袋（WM:1000），将透析袋两端绑紧后放入盛有20 mL释放液的50 mL离心管中，然后将离心管放进摇床（150 rpm）避光处理。接下来分别在4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h各时间点取2 mL的释放液，用酶标仪测量各时间段的药物释放量。
图2为EGCG的体外释放曲线。可以看出EGCG的释放曲线可以分为两个阶段。第一阶段为累计释放24 h之前，EGCG累积释放接近50%，占总释放量的60%；第二阶段为24 h以后，EGCG的释放速率逐步放缓，最终趋于停止。
试验3：
小鼠分为4组，分别为健康组、葡聚糖硫酸钠盐（dextran sulfate sodium，DSS）处理组、游离EGCG处理组和载EGCG卵清蛋白纳米粒子处理组。首先进行小鼠结肠炎模型的诱导，健康组饮用饮用水，DSS处理组、游离EGCG处理组和载EGCG卵清蛋白纳米粒子处理组自由饮用 3.5% DSS 溶液。从DSS处理开始，每隔一天对游离EGCG处理组和载EGCG卵清蛋白纳米粒子处理组分别尾静脉注射游离EGCG和载EGCG卵清蛋白纳米粒子，其中EGCG浓度为100μg，健康组和DSS处理组尾静脉注射PBS，作为对照。
图3 a所示，健康组小鼠体重一直呈现上升趋势，DSS处理组小鼠体重下降速率最快，载EGCG卵清蛋白纳米粒子处理组小鼠体重下降速率要比游离EGCG处理组小鼠体重下贱的的慢。这说明，药物处理对小鼠的病情有缓解作用，而载药卵清蛋白纳米粒子处理组的小鼠体重最接近健康组，这说明在EGCG卵清蛋白纳米粒子的治疗效果较好。
髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）值的变化也是是判断溃疡性结肠炎的一个重要因素，MPO值越高说明炎症越严重。如图3 b所示，载EGCG卵清蛋白纳米粒子处理组和游离EGCG处理组的MPO值明显小于DSS处理组，而且载EGCG卵清蛋白纳米粒子处理组的MPO值最接近健康组，这说明载EGCG卵清蛋白纳米粒子的治疗效果更佳。