本发明属于生物医学材料技术领域，特别涉及一种新型神经导管支架及其制备方法和应用。
背景技术：
周围神经损伤是临床常见疾患，其愈后差，致残率非常高，给病人、家庭和社会带来巨大的经济损失和精神负担[hudsonetal,2000,lundborgetal,1982,zhangetal,2017]。在我国这类神经损伤每年约发生200万例。现如今，临床上针对周围神经的离断损伤和小缺损，常采用显微外科技术进行端-端外膜缝合、束膜缝合或联合缝合手术，以期恢复神经的连续性；然而对于较大的神经缺损，自体移植仍然是目前临床的修复“金标准”[pulleyetal,2016]。但是自体移植存在再生速度缓慢、自体神经来源有限、以及供体和受体不匹配等缺点，此外自体移植也会对造成供区的神经缺损。因此寻找一种良好的神经替代物成为当前神经再生的研究热点。
为了解决周围神经损伤，诸多学者提出并开始研究组织工程方法-人工神经导管。利用生物材料构建神经导管支架，为神经细胞提供良好的营养、生长代谢、力学支撑和三维空间，从而引导神经的再生；该支架具有减轻缝合口张力，提高神经束对合精确度，防止瘢痕组织侵入再生等优点[lavasani2011]。理想的神经导管支架首先要满足神经细胞生长所需要的基本要求，即(1)支架必须具备类似神经的管状结构，并且易于细胞粘附和生长；(2)具有生物活性促进神经组织的再生；(3)良好的物理机械性能和柔韧性；(4)支架具备良好的组织相容性和无毒性；(5)导管能够具有良好的降解性能。
目前，基于天然的细胞外基质ecm多呈现纳米显微网状结构，合成具有纳米纤维状结构的生物材料支架模拟ecm是进行神经修复的一个基本策略。由纤维基纳米材料通过静电纺丝技术制备的神经支架能够较好地模拟天然神经外基质微环境。利用电纺纳米纤维能够精确模拟神经组织ecm的尺寸和结构，在探索神经细胞和纳米纤维支架之间的相互作用关系方面有着极高的可行性和仿生优越性。静电纺丝技术的优势在于制备二维结构的纳米纤维膜，然而在制备三维结构的纳米纤维支架方面仍然面临挑战。另外石墨烯作为新兴纳米材料，由于其优异的力学、电性及物化特性，使其在生物医学应用方面得到了广泛关注。相关研究表明石墨稀及石墨烯衍生物能够促进神经细胞的增殖以及能调控神经干细胞向神经元细胞分化，因此其在神经再生领域具有潜在的应用价值。通常情况下，用于神经组织工程研究的石墨烯多采用二维石墨烯结构，然而将二维石墨烯组装成三维宏观结构是石墨烯走向实际应用的途径之一，目前还没有相关文献和专利进行报道。
目前所采用的神经导管为单通道导管[chionoetal,2010,guetal,2011]被用来引导神经修复；随着组织工程的发展，研究的深入发现具有内部填充物的非中空结构的神经导管支架对于神经修复具有更好的引导作用，这可以分为多通道导管[deruiteretal,2008]，或者是在导管中添加引导纤维导管[huangetal,2012,matsumotoetal,2000]等。然而这些传统的技术制备的支架缺乏生物活性，渗透性及力学性能，使其没有很好的引导神经再生，因此制备新型的三维神经支架仍是必要的。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种新型神经导管支架及其制备方法和应用，克服现有二维神经导管支架缺乏生物活性，渗透性及力学性能，使其没有很好的引导神经再生，无法修复长距离神经缺损的缺陷。
本发明通过制备取向多通道结构的方法和纳米纤维海绵的方法及引入生物活性的纳米材料石墨烯及石墨烯衍生物相结合，以期达到在结构上更好的仿生神经束膜结构，制备具有生物活性的多通道纳米纤维海绵填充的神经导管支架，达到修复长距离神经缺损的目标。
本发明的一种神经导管支架，以三维石墨烯或石墨烯衍生物多通道活性纳米纤维海绵为填充内芯，以轴向取向纳米纤维为外管。
所述石墨烯衍生物选自氧化石墨烯、氧化还原石墨烯、羧基化石墨烯或氟化石墨烯。
本发明的一种新型神经导管支架的制备方法，包括：
(1)将石墨烯或石墨烯衍生物超声分散于浓度为质量体积比为8～15％的纺丝液中，得到含有石墨烯或石墨烯衍生物的纺丝液，静电纺丝，干燥，得到石墨烯或石墨烯衍生物纳米纤维膜；其中，石墨烯或石墨烯衍生物的浓度为质量体积比为0.1～10％；
(2)将步骤(1)得到的纳米纤维膜剪碎加入叔丁醇中，匀浆粉碎处理，得到含固率为1～5％的碎纤维混合液；倒入多通道模具中，冷冻干燥；加入交联剂，交联成型；浸泡在谷氨酸溶液中，经干燥成型，得到三维石墨烯或石墨烯衍生物多通道活性纳米纤维海绵；
(3)以步骤(2)得到的三维石墨烯或石墨烯衍生物多通道活性纳米纤维海绵作为神经导管的芯层，固定在轴向取向纺丝接收器上，采用浓度为质量体积比为6～15％的纺丝液在外层进行轴向取向纺丝，得到轴向取向纳米纤维，即得。
所述步骤(1)中静电纺丝的工艺参数为：电压10～13千伏，接收距离10～15cm，纺丝速率0.6～1.4ml/h。
所述步骤(1)中干燥的工艺参数为：干燥为真空干燥，真空度为-35～-25kpa，干燥温度为22～26℃，干燥时间为24～48h。
所述步骤(2)中的交联剂为0.5％的戊二醛的酒精溶液。
所述步骤(2)中的谷氨酸的浓度为5％。浸泡在谷氨酸溶液中的目的是中和残留的戊二醛。
所述步骤(2)中的多通道为5～20个。
所述步骤(3)中轴向取向纺丝的工艺参数为：电压8～15千伏，接收距离8～15cm，纺丝速率0.6～1.4ml/h。
所述步骤(1)和(3)中的纺丝液是通过以家蚕丝素蛋白、柞蚕丝素蛋白、胶原、明胶、壳聚糖、层粘连蛋白、聚乳酸pla、聚乙醇酸pga、聚己内酯pcl、聚乳酸-聚己内酯plcl中的一种或几种天然或合成聚合物为原料，溶于溶剂中，搅拌至完全溶解制得。
所述溶剂为六氟异丙醇。
本发明的新型神经导管支架在诱导神经组织的修复与再生中的应用。
本发明从材料生物性能、生物活性和拓扑结构入手制备多功能型神经导管支架。导管以含石墨烯或石墨烯衍生物多通道纳米纤维海绵为填充内芯，以取向纳米纤维为外管，使其不仅在结构上模拟神经细胞外基质的结构，而且在功能上引导神经细胞进行迁移和生长，进而实现周围神经的功能修复。支架材料选用生物相容性好的天然材料中的一种或多种、力学性能优良的高聚物及具有生物活性的石墨烯或石墨烯衍生物，采用静电纺丝技术，匀浆技术，模板成型技术，冷冻干燥技术相结合制备内部为生物活性的石墨烯或石墨烯衍生物多通道纳米纤维海绵，外部为轴向取向纳米纤维管状支架，使其从结构和功能上诱导神经组织的修复与再生。
本发明以研究三维石墨烯在神经领域应用为主，并同时优化导管设计，制备得到性能优良的神经导管支架，并探究其在神经修复上的应用前景，为神经缺损修复提供了新思路，可大量制备所需产品。
有益效果
(1)本发明的制备方法简单易行，原料安全可靠，未使用到任何其他有害有毒的化学试剂，可重复性好，使其在神经组织工程方面具有很好地应用前景，易实现工业化生产。
(2)本发明巧妙的利用静电纺丝技术，均浆技术，模板成型技术，冷冻干燥技术，交联技术相结合，制备出物理化学性能优异，生物相容性好，具有生物活性，可降解，模拟神经束膜结构，具有多通道孔隙结构纳米纤维填充神经导管支架。
(3)本发明的神经导管支架以多通道纳米纤维海绵作为内部填充物，一方面纳米纤维海绵是由纳米结构的碎纤维组成，能够对神经细胞的生长具有很好的调控作用；另一方面该海绵结构中具有较多的微米级的多通道，通道取向和神经长入方向一致，能够充分的让神经细胞三维渗入生长。本发明的神经导管支架的外层为轴向取向结构对于神经的修复具有更好的引导作用，尤其是对于长距离神经的修复，能够修复长距离超过10cm的神经缺损。
(4)本发明能最大限度的模拟周围神经组织结构并实现其功能性的神经导管，使其不仅在结构上模拟神经细胞外基质的结构，而且在功能上引导神经细胞进行迁移和生长，并能控制神经支架的降解速度。
(5)与未含石墨烯纳米纤维支架材料及中空管状支架相比，本发明石墨烯的加入具有以下优点：1)石墨烯及石墨烯衍生物具有较大的比表面积，可以与纳米纤维材料充分接触，产生协同作用，提高了复合纳米纤维神经组织支架材料的生物活性；2)低添加量的情况下，可显著提高支架材料的机械性能，使支架具有较高且符合神经组织的力学性能，能够支撑神经再生所需要的力学支撑，结合物理化学引导，使其基于多通道活性纳米纤维海绵结构神经导管有望成为理想中的神经组织工程支架，对于生物医用材料及组织工程领域具有重要的意义；3)通过调节石墨烯的含量可以控制神经支架材料的物理化学性能、亲疏水性，力学性能以及细胞粘附性。
附图说明
图1为本发明实施例3中含有石墨烯的纳米纤维结构的sem(左)，tem(右)。
图2为本发明实施例3中未含石墨烯多通道纳米纤维海绵神经导管(左)与石墨烯多通道纳米纤维海绵神经导管(右)的sem。
图3为本发明实施例3中支架力学性能(左)及亲疏水性能(右)。
图4为本发明实施例3中支架的细胞粘附性结果，其中从左至右依次为放大不同倍数的形貌图，箭头所指为同一个位置。
图5为本发明实施例3中神经再生透射电镜图，其中从左至右依次为未含石墨烯三维多通道纳米纤维海绵结构的空管支架(左)，含有石墨烯三维通道纳米纤维海绵结构的支架(中)和自体神经(右)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明实施例中所采用的石墨烯及石墨烯衍生物来自于南京先丰纳米材料有限公司，采用的pla,pcl,plcl等聚合物来自于山东岱罡生物医用材料有限公司，所采用的丝素蛋白为实验室自制。
实施例1
(1)将10g明胶和4gpla溶解于10ml六氟异丙醇中，并不断搅拌至完全溶解，得到浓度为10％(质量体积比)的纺丝液；将3mg的氧化还原石墨烯加入上述纺丝液中超声分散，得到石墨烯/明胶/pla的纺丝液，纺丝条件：电压13千伏，接收距离10cm，纺丝速率1.4ml/h，静电纺丝得到纳米纤维膜，置于真空干燥箱中保存备用。
(2)将步骤(1)得到的纳米纤维膜剪碎，称取2g的碎片加入到盛有10ml的叔丁醇的烧杯中，利用高速匀浆机将纳米纤维膜碎片进行匀浆粉碎处理，直至纤维膜被完全打碎并均匀分散于叔丁醇溶液中。将分散均匀的纳米纤维混合液倒入多通道的模具，冷冻干燥，得到未交联的三维纳米纤维海绵。因明胶易溶于水，因此需要对其进行交联，加入0.5％的戊二醛的酒精溶液进行交联成型。将成型的支架浸泡在浓度为5％谷氨酸的溶液中，中和残留的戊二醛，并干燥成型，得到三维多通道活性纳米纤维海绵。
(3)将步骤(2)得到的支架作为神经导管的芯层，固定在实验室特有的轴向取向纺丝仪器上，采用石墨烯/明胶/pla的纺丝液，在其外层进行轴向取向纺丝，纺丝条件：电压10千伏，接收距离12cm，纺丝速率1.0ml/h，得到长度为60mm，内径为2mm的石墨烯多通道纳米纤维海绵引导型神经导管支架。
实施例2
(1)将10g明胶溶解于10ml六氟异丙醇中，并不断搅拌至完全溶解，得到浓度为12％(质量体积比)的明胶溶液；将6gpcl溶解于六氟异丙醇中，并不断搅拌至完全溶解，得到浓度为8％(质量体积比)的pcl溶液液；将10ml上述明胶溶液分别与5ml上述pcl溶液混合，搅拌均匀，得到明胶/pcl的纺丝液；将4mg的石墨烯加入上述纺丝液中超声分散，得到石墨烯/明胶/pcl的纺丝液，纺丝条件：电压10千伏，接收距离10cm，纺丝速率1.2ml/h，静电纺丝得到纳米纤维膜，置于真空干燥箱中保存备用。
(2)将步骤(1)得到的纳米纤维膜剪碎，称取0.5g的碎片加入到盛有10ml的叔丁醇的烧杯中，利用高速匀浆机将纳米纤维膜碎片进行匀浆粉碎处理，直至纤维膜被完全打碎并均匀分散于叔丁醇溶液中。将分散均匀的纳米纤维混合液倒入多通道的模具，冷冻干燥，得到未交联的三维纳米纤维海绵，因明胶易溶于水，因此需要对其进行交联，加入0.5％的戊二醛的酒精溶液进行交联成型。将成型的支架浸泡在浓度为5％谷氨酸的溶液中，中和残留的戊二醛，并干燥成型，得到三维多通道活性纳米纤维海绵。
(3)将步骤(2)得到的支架作为神经导管的芯层，固定在实验室特有的轴向取向纺丝仪器上，采用石墨烯/明胶/pcl的纺丝液，在其外层进行轴向取向纺丝，纺丝条件：电压8千伏，接收距离15cm，纺丝速率0.6ml/h，得到长度为30mm，内径为4mm的石墨烯多通道纳米纤维海绵引导型神经导管支架。
实施例3
(1)将蚕丝在95℃环境下，置于含5g/lna2co3的溶液中脱胶3次，每次30min，浴比1：50。脱胶后得到柞蚕丝素纤维，60℃烘干。将柞蚕丝素纤维按浴比1：10置于饱和的liscn溶液中，50℃±2℃下溶解70min，获得的柞蚕丝素蛋白溶液装入截留分子质量为8-10kda的透析袋中，用去离子水透析3天，经冷冻干燥，得到柞蚕丝素蛋白。
(2)称取步骤(1)得到的丝素蛋白0.8g，plcl0.2g溶于10ml六氟异丙醇中，搅拌至完全溶解，得到浓度为10％(w/v)的纺丝液，将2mg的氧化石墨烯加入纺丝液中超声分散制备氧化石墨烯/丝素蛋白/plcl的纺丝液。将纺丝液进行静电纺丝，纺丝条件：电压14千伏，接收距离10cm，纺丝速率1.0ml/h，接收到一定厚度的纳米纤维膜，取下后放入密闭容器内，在温度为25℃、真空度为-30kpa的条件下真空干燥48h，去除残留溶剂，得到氧化石墨烯/丝素蛋白/plcl复合纳米纤维膜。
(3)将步骤(2)得到的纳米纤维膜剪碎，称取1g的碎片加入到盛有10ml的叔丁醇的烧杯中，利用高速匀浆机将纳米纤维膜碎片进行匀浆粉碎处理，直至纤维膜被完全打碎并均匀分散于叔丁醇溶液中。将分散均匀的纳米纤维混合液倒入多通道的模具，冷冻干燥，得到未交联的三维纳米纤维海绵，因丝素易溶于水，因此需要对其进行交联，加入0.5％的戊二醛的酒精溶液进行交联成型。将成型的支架浸泡在浓度为5％谷氨酸的溶液中，中和残留的戊二醛，并干燥成型，得到三维多通道活性纳米纤维海绵。
(4)将步骤(3)得到的支架作为神经导管的芯层，固定在实验室特有的轴向取向纺丝仪器上，采用丝素蛋白/plcl的纺丝液，在其外层进行轴向取向纺丝，纺丝条件：电压8千伏，接收距离14cm，纺丝速率0.8ml/h，得到长度为50mm，内径为2mm的氧化石墨烯多通道纳米纤维海绵引导型神经导管支架。
由于神经导管支架作为神经内部填充支架材料，其结构及性能都将影响到神经细胞沿三维多孔长入，继而影响神经再生的速度及再生神经的功能。因此有必要研究支架的化学结构、结晶结构和孔径及孔隙率等。
1、对本实施例制得的氧化石墨烯纳米纤维膜进行sem和tem测试，结果如图1所示，可知氧化石墨烯的加入使得纤维直径降低，且存在于纤维的表面。
2、对本实施例制得的未含氧化石墨烯纳米纤维海绵神经导管支架与氧化石墨烯多通道纳米纤维海绵神经导管支架进行sem测试，结果图2所示，可知氧化石墨烯多通道纳米纤维海绵神经导管支架呈三维的纳米纤维结构，并且有许多微通道组成很好的模拟了周围神经ecm的结构。
3、对本实施例制得的氧化石墨烯多通道纳米纤维海绵神经导管支架进行力学测试及亲疏水性能测试，结果如图3所示，可知氧化石墨烯多通道纳米纤维海绵神经导管支架力学性能良好能够支撑神经再生。氧化石墨烯的加入能够提高支架的亲水性能。
4、体外降解的研究：将不同密度的氧化石墨烯三维纳米纤维海绵剪成一定规格称重。然后将样品浸入pbs缓冲溶液中在37℃下缓慢降解。每隔一星期取样一次，使之充分干燥后准确称重，每一个样点取三个样品的平均值，由此得到不同纳米纤维的重量损失与降解时间的关系；同时将通过sem观察海绵在降解过程中形貌的变化。从而系统研究其体外降解行为。结果表明随着交联时间的增加，降解越缓慢。
5、体内降解的研究：海绵支架的体内降解情况将由动物实验检测，将氧化石墨烯三维支架植入到大鼠皮下，分别在植入后的1、3、5、7个月时打开创面观察三维支架是否已经降解，并且将支架取出测定其力学性能，由此检测材料的降解情况。同时，对取出的样品进行he染色分析，进一步观察支架的降解情况。结果表明支架在两个月时间内可以完全降解。
6、细胞的增殖：氧化石墨烯三维多通道纳米纤维海绵支架置于75％的酒精蒸汽缸中进行灭菌处理2h后，利用pbs依次清洗支架以及空白培养板4次，每次在孔板中加入足量的pbs以浸没材料，以此除去未挥发的酒精蒸汽。在每一个样品上种植等量的sc细胞。加入培养液，在co2恒温箱中培养。经1、3、5、7天培养后，用mtt方法测定sc细胞在不同支架材料上的增殖，并观察其形貌，结果如图4所示，可知氧化石墨烯多通道纳米纤维海绵神经导管支架能够引导细胞生长长入，表明氧化石墨烯三维多通道纳米纤维海绵支架更好的促进了细胞的增殖长入。
7、(1)神经缺损的桥接：取健康成年大鼠作为研究对象，构建10mm鼠的坐骨神经损伤模型。实验侧断端分别由下列3组神经导管和自体神经进行桥接。每组每个时间点做3个样品。
ⅰ组轴向取向纳米纤维神经导管桥接神经断端
ⅱ组内部填充氧化石墨烯三维多通道海绵的轴向取向纳米纤维神经导管桥接神经断端
ⅲ组自体神经桥接神经断端
(2)术后1,3，5，7个月时对桥接神经的再生情况进行以下检测。
①大体观察：术后观察犬的伤口愈合情况、足踝部溃疡、跛行、肌肉萎缩程度。
②电生理测定：游离坐骨神经,用sdr-4型生理示波器测定犬坐骨神经的神经传导速度(ncv)和复合动作电位的波幅(amp)。
③组织学检查：距犬的坐骨神经远端吻合口约2mm处切取再生神经，4％戊二醛固定24小时以上，1％锇酸后固定，环氧树脂定向包埋。半薄切片，甲苯胺蓝髓鞘染色；超薄切片，醋酸双氧铀柠檬酸铅染色。光镜和透射电镜下观察轴突再生和髓鞘形成情况。神经再生透射电镜图结果如图5所示，可知相比于空管支架，氧化石墨烯三维多通道支架能够更还好的促进神经再生并接近于自体神经。
④免疫组织化学染色：将犬行心脏灌注法固定，切取再生神经部位同上，用4％多聚甲醛固定24小时后，脱水，行横断面和纵切面切片。用抗犬神经细丝蛋白单克隆抗体进行免疫染色。
⑤小腿三头肌湿重测量：整切取两侧小腿三头肌，沾去附着的血液，天平称量湿重，两侧对比观察肌肉恢复率(实验侧/正常侧)。
⑥图象分析：用hpias-1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统测定再生神经有髓神经纤维的数目、直径、髓鞘厚度、轴突直径，对再生神经进行形态学分析。
(3)统计学分析：采用spssio.0统计软件单因素方差分析和snk法进行多样本均数的两两比较，p<0.05为差异有统计学意义。