专利名称：使用双链rna消除病毒对核苷类似物的耐药的制作方法
核苷类似物通常用作抗病毒剂，尤其用作抗可逆性病毒(retroviruses)剂。病毒经历基因变异或突变，导致对这些抗病毒剂相对耐药。一旦发生耐药，病毒迅速繁殖，于是加速了潜在的疾病发作。感染的早期部署双链RNA(dsRNA)可以降低病毒耐药出现的速度。即使是感染后期，基因突变已经发生，dsRNA也能恢复病毒对其它无效的抗病毒剂的敏感性。这点可以由临床上长期使用两种模式相结合治疗导致的出乎意料的结果中看出。这种临床结果是，宿主免疫功能大大恢复，可检测的病毒甚微。这种结果是单独使用任何一类抗病毒剂所没有的。
病毒性疾病的长期治疗，特别是可逆的病毒性疾病，与病毒抗药性出现有关(参考文献1和2)。理想情况是，使用核苷类似物进行化疗时，核苷能插入到病毒基因信息之中，并导致基因缺陷或不完全，从而降低病毒生长循环效率。有缺陷的或者不完全的病毒后代形成感染的能力降低。不过，通过修饰本身的基因构造，病毒可以相对出现耐药，从而即使存在核苷类似物，也可以产生感染性的病毒后代。典型的基因变化出现在聚合酶基因(即在生长循环的第一步指导抗病毒核苷插入的病毒组分)，使得病毒可以受抗病毒封锁形态影响。目前最好的研究例子是可逆病毒间的相互作用，例如HIV(人体免疫缺陷病毒)和3′-叠氮基-3′-去氧胸苷，后者亦称作为AZT或Zidovudine。导致对AIT具有抗药性的变种常常同时对其它药物，例如二脱氧肌苷(DDI)和二脱氧胞苷(DDC)(不限于这两种化合物)耐药。
已经发现了在使用核苷类似物治疗前，在适当的时间使用有效量错误匹配的dsRNA，可以使HIV感染(HIV阳性)的病人推迟或降低，或既推迟又降低出现核苷类似物耐药病毒的程序。这些程序使得病人在HIV感染后期，需要使用核苷类似物抗病毒剂时，对药物敏感。
还描述了使用有效量错误匹配的dsRNA，改进可逆病毒感染病人的外周血液单核血细胞(PBMC)群，尤其是T4或CD4淋巴细胞的治疗程序。
dsRNA可以是含有部分尿嘧啶碱基或鸟嘌呤基的聚肌苷和聚胞苷的复合物，例如这类硷基的含量从1/4至1/29(poly I.poly(C4-29X＞U或G))。
dsRNA的通式可以是rIn·r(C11-14′U)n或者是rIn·r(C12′U)n。下面讨论dsRNA的其它合适的例子。
“错误配对的dsRNA”用来描述那些配对链之间的氢键(碱基堆积)相对完整，即氢键受到干扰被中断的平均数在连续的每29个碱基对残基中不足1个碱基时。“错误配对的dsRNA”应按此理解。
本发明提倡使用的错误配对的dsRNA以选自poly(Cn′U)和poly(Cn′G)的共聚核苷酸为基础，其中n为4至29的整数，而且共聚核苷酸是通过沿聚核糖胞苷键(rCn)把rIn·rIn修饰并插入未配时碱基(尿嘧啶或鸟嘌呤)而生成的聚核糖肌苷酸和聚核糖胞苷酸的复合物的错误配对的类似物。另外，通过修饰聚核糖肌苷酸(rIn)的核糖骨架，例如把2′-O-甲基核糖残基包括于其中，从poly(I)·poly(C)dsRNA衍生错误配对的dsRNA。错误配对的复合物可以使用RNA-稳定化的高聚物，例如聚赖氨酸或纤维素进行复合。Carter和Ts′o在美国专利4，130，641和4，024，222中描述了rIn·rCn′的错误配对类似物中优选的类似物，通式为rIn·(C11-14′U)n或rInl·r(C29′G)n′，这些发明列为参考文献。按照本发明，其中描述的dsRNA一般都适用。优选的错误配对的dsRNA为rIn·(C11-14′U)n或AMPLIGEN(HEN Resarch，Inc，Rockn ille，MD，USA)，可以买到冻干粉。
本发明中使用的错误配对的dsRNA的其它例子包括poly(I)·poly(C4′，U)poly(I)·poly(C7′，U)poly(I)·poly(C13′，U)poly(I)·poly(C22，U)poly(I)·poly(C20，U)poly(I)·poly(C29，U)和
poly(I)·poly CP23G＞p适用于实施本发明的另一类dsRNA是确定结构的短链dsRNA，例如通式为5′-封锁-(I)n-封锁3′3′-封锁-(C)n-封锁5′的寡核苷酸。其中m和n各自都大于5至小于100，I为单磷酸化肌苷，C为单磷酸化胞苷，而且一根链上的封锁基与相对链上的封锁基互补。或者是通式为5′-封锁-〔(I)xA〕j-封锁3′5′-封锁-〔(C)yU〕k-封锁3′的寡核苷酸。其中x和y各自大于5小于25，j和k至少等于1并小于10，I和C同上，A为I以外的核苷酸，U为碱基与A配对的核苷酸。
另外，短链寡核苷酸可以具有下述结构5′(I)n-铰链-(C)m3′其中n，m，I和C的定义同上。
这些寡核苷酸可以在与相对链上的核苷酸不互补的一根链上含有取代基。这些寡核苷酸最好被互补的非均匀高聚体的内部配对所稳定，理想地，封锁基和铰链基或二者都含有互补非均匀高聚体的区域。这些寡核苷酸理想地含有单一链尾。这些寡核苷酸在PCT/US89/02172中已有描述。
病人需要根据临床改善情况每周一次或每日一次静脉输200至700mg rI·r(C11-14′U)。dsRNA的用量和给药次数将使病人的全身血液循环在用药后于远离输液部位的地方测定到dsRNA水平达0.01μg至1，000μg/升。
例证性的核苷类似物抗病毒剂包括Ziodovudine(象这里普遍使用的AZT或叠氮胸腺啶或Retrovar)，即3′-叠氮-3′-去氧胸腺定，是用于因人体免疫缺陷病毒(HIV，HTLV-I，HTLV-Ⅱ，HTLV-Ⅲ，LAV，ARV和各种菌株的类似信息物)引起的AIDS和AIDS相关复杂情况需要全身性治疗的核苷类似物抗病毒剂。成人剂量是每天每四小时给药200mg。一个70kg体重的病人，对应的剂量是每四小时每公斤体重2.9mg。每天每公斤体重的剂量已用达60mg。如同后面的讨论将进一步显示的，与错误配对的dsRNA配位时，使用的核苷类似物的可逆病毒剂量通常小于正常剂量和习惯用量。
图1是描述298位病人死亡或AIDS“全身感染”的时间(月数)表，与症状出现前AZT“早期”(方格)治疗或症状出现后AZT“晚期”(圆圈)治疗相比较，采用无致命的HIV情况的病人的比例表示。
图2，比较早期使用dsRNA或它与AZT并用对可逆病毒生长的控制与单独使用AZT病例中可逆病毒迅速生长。在图2中，HIV培养按参考文献3进行，使用的PBMC来自例＃1至例＃3培养4天，7天和14天之后，收集PBMC，溶于GUSCN之中，并按方法中描述的使用分子杂化技术测定HIVRNA。PBMC＝外周血液中单核细胞;GUSCN为氰酸胍溶液，用于溶解细胞并释放病毒物质。
图3，比较dsRNA和AZT作为单一治疗剂时与安慰剂及dsRNA和AZT联合治疗时，在指明的周数上长期保持HIV疾病中CD4细胞按CD4T淋巴细胞中的中质变化的相对效果。
图4，把AZT和dsRNA联合治疗的天数与T4水平的变化百分数相关联，表明dsRNA Ampligen
把HIV疾病中T4细胞的稳定周期扩展到超出了单独使用AZT预期的稳定周期。指出了联合用药的每个成员的中间剂量。
图5，把Ampligen
和AZT联用的天数与T4细胞平均百分变化(增加)相关联，表明Ampligen
增加和/或者稳定HIV疾病中T4细胞水平在AZT有效的时间周期内仍超出该时间周期。
图6是12个月中安慰剂、单独使用AZT、Ampligen
单一治疗以及Ampligen
和AZT联合治疗时无致命的HIV病人的比例图解。
在图4和图6中，病人数目在有关数据点附近的括号中指明，在图3和图5中用N＝指明。
在图2中，按照参考文献3中描述的方法，使用来自例1和3的外周血液单核细胞完成HIV共培养。共培养4天，7天和14天之后，收集外周血液单核细胞并溶于氰酸胍溶液中，后者是用来溶解细胞并释放病毒物质的。用分子杂化测定HIV RNA，下面将详细描述。
图1说明在HIV感染病人的充分公布的Veterans组的“早期”(例如失重，盗汗等症状出现之前)或者“晚期”(即包括由真菌或细菌引起的HIV相关的感染在内的这类症状出现以后)使用AZT治疗时，致命情况(发展成全身感染的AIDS或死亡)的发展。
从图1可以明显看出，“早期”使用AZT不延长寿命。取自发展了致命情况的病人的血样表明AZT耐药病毒(本文以AZT 表示)浓度增加，而在大约40个月观察周期中仍无致命情况的病人一般有对AZT都变为敏感的病毒(AZTS)。
以下，更充分的特征是从尽管AZT治疗，疾病仍然发展的病人身上分离的典型的HIV分离体的相对AZT敏感度，并把这些结果与包括从疾病得到相对好的控制的病人身上分离到的肝炎病毒在内的病毒分离体进行比较。很明显，出现AZT 病毒会缩短生命期。典型的人体可逆病毒HTLV-1，HTLV-2，HTLV-3以及通过相同机制繁殖的病毒包括一些肝炎病毒。
在此本发明人描述改进这一目前未解决的问题的发明。该发明可以通过多种途径实施，这些途径包括(a)在病毒暴露于AZT或其它类似物前，使用特殊类型的dsRNA，降低AZT 的出现(b)通过往体系中反加dsRNA，克服AZT HIV(或其它病毒耐药类似物)的致死性质。dsRNA/核苷体系显示了对抗AZT HIV的出乎意料的协同作用而没有对应的协同毒性，这样这种体系确实是独特的出乎意料有用的联合药物，使用正确即可挽救生命。
本发明人的研究考察了如何联合使用Ampligen -AZT降低HIV-病毒所造成的问题，研究中病毒无细胞来自或者接受Ampliger 单独治疗或接受AZT单独治疗或接受Ampligen -AZT联合治疗的病人，该病毒用于感染新鲜的人外周血液细胞，该血液血胞事先被暴露在Ampligen 、AZT、或Ampligen 和AZT之中。来自于仅接受AZT单一治疗一年以上的病人的病毒对AZT不敏感(0.5uMAZT＝4%抑制率;ED50＜5uM)，但象原始HIV病毒一样对单一Ampligen敏感(5ug/ml，Ampligen -AZT联用比单一Ampligen 可以产生更大的HIV抑制率(93%)。来自于接受单一Ampligen 治疗或Ampligen -AZT联合治疗的病人的病毒显示了对AZT相对耐药，对Ampligen敏感 ，而对Ampligen -AZT联合用药甚至有更大的敏感性。根据病人的不同治疗计划，比较用许多不同病毒分离体所得的结果，可以明显看到，来自暴露于AZT之前就接受了Ampligen 治疗病人的病毒对于AZT(以及其它核苷类似物)的敏感性要大于来自于首先接受了AZT的病人的病毒。
a＝AZT-Ampligen 相互作用通过等数分析测定(参考文献4)。联合指数(CI)定义为CI+(Ac/As)+(Be/Bs)，其中Ac和Bc是联合治疗中使用的药物浓度，As和Bs是单独使用时产生联合治疗相同效应的药物浓度。当CI＜1时，药物是协同的;当CI＝1时，药物是加和的;当CI＞1时，药物相互拮抗。ED50为抑制50%病毒繁殖的体外剂量。
在图2中发明人表明本发明的典型的实施方案，在实施方案中早期使用Ampligen 或与AZT同时使用，事实上会产生实质上的好处，比如降低象可逆病毒这样的有害病毒的体内浓度。用开环表示的病毒RNA(核糖核酸)的迅速升高的产生曲线是未控制病毒生长的指征，而两条平线表示通过联合治疗病毒产生得到良好控制。图2中的开环说明AZT 病毒迅速发展，这样就成为图1中病人的典型症状，这些病人当单独给AZT时，往疾病的更晚期发展。
无论什么耐药表现型(表1)，一些dsRNA，尤其是错误配对的dsRNA若与AZT(或其它核苷类似物)联用，则显示对可逆病毒的协同抑制作用。H112-2和6910-6是分别显示典型敏感度和耐药的非常特征化的HIV显型克隆。而例＃1到例＃6是从暴露于各种体系(例如例＃1，2，3病人与图2中的病人相同，例如4，5，6病人象图1中建议的，开初用AZT单独治疗)的特殊病人中分离出的病毒。
当在临床上联合用药时，结果再次出乎意料，而且根据单独使用两种药物(单一治疗)的临床观察根本不可预测。例如，单独使用AZT(和其它类似物)使一些免疫细胞短时增加(参考文献5)，这些免疫细胞叫作CD4细胞，它们最易为一些可逆病毒和一些肝炎病毒(特别是HHV6)进攻。短时增加之后(见于12至16周左右)，由于HIV增殖和出现AZT HIV，免疫细胞恶化(图3)。括号中的数目叫作研究的主体数。相比之外，单独合作Ampligen 始终引起CD4细胞数处于水平线(图3，例如免疫细胞数既不增加也不减少，换句话说，细胞数稳定化)，Ampligen 的剂量大约400至500mg，每周两次，静脉给药。
病人接受AZT单独治疗，每天每四小时口服200mg(1200mg/日)。Ampligen 单独治疗组的病人每周静脉最低给药量两次(平均剂量范围为每周463-555mg)。〔图4中显示的接受联合治疗的病人也每周两次输以400mg典型的Ampligen 剂量，而且平均伴用每日剂量范围300至540mg的AZT〕。
安慰剂和AZT单一治疗组(16周之后)T4淋巴细胞中值变化的趋势与疾病进程无情地衰退的证据相符。没有有效的治疗干预，安慰剂病人的淋巴细胞的中值变化计数下降。开初增加之后，即使接受AZT单一治疗的病人也经历他们的T4细胞中值计数的下降并出现AZT HIV。这种下降从第12周起开始出现与安慰剂处理的病人中出现的下降相平行。
根据AZT单独治疗和安慰剂组12周开始T4细胞中值变化构成的线性回归线统计方法比较斜率，表明它们与中值T4细胞水平无变化的0斜率具有统计学差别(分别有p＜0.01和p＜0.01)。“无变化”典型地表示免疫学疾病的稳定，“负斜率”表示疾病恶化，而最理想的后果是正科率，表示疾病(免疫)恢复，但这不可能通过研究的单一治疗体系而达到。
安慰剂的AZT单一治疗12周之后，Ampligen 单独消除了预料的CD4下降。Ampligen 治疗中的连续中值CD4水平的回归线斜率与反映无CD4细胞损失的水平线在整个时间都没有统计学差异。
斜率与水平线(无变化)相比较P值Ampligen 无统计学意义 P>0.2AZT 显著差异 P<0.01安慰剂 显著性差异 P<0.01虽然Ampligen 的单一治疗(图3)可以消除在安慰剂和AZT治疗的两组病人中都看到的中值T4淋巴细胞(在短时的12周升高之后)的严重下降，但平均T4水平不升高。而且在Ampligen 组中，在一年中观察到的小的(无统计学差异)中值T4淋巴细胞减少(图3)可以通过把剂量增至每周两次200mg以上而生产更持久的T4稳定化而容易逆转。在Ampligen 单一治疗组中从12周开始观察到的中值T4细胞的变化构成的回归线的斜率与表明疾病稳定的0之间没有显著差异。图3给出的Ampligen 单一治疗组，AZT单一治疗组或安慰剂治疗组具有大致相等的中值和平均的绝对T4(亦称CD4)淋巴细胞水平。然后我把它们与接受Ampligen 和AZT联合治疗的新组进行比较。该新组实际上具有较低的(约33%)中值和这种加重的HIV感染的预后指征的绝对水平，从而表明他们具有更大的死亡危险或别的“致命事件”。
下表给出了Ampligen 和AZT长期维持HIV疾病中每mm3CD4细胞的相对效应。
正如在图3中看到的，完成一年治疗使用安慰剂的病人中值绝对T4淋巴细胞计数减少59个细胞(大约每月减少4.9个细胞);接受AZT单一治疗的病人减少28个细胞(大约每月减少2.3个细胞);接受Ampligen 单一治疗的病人，只减少15个细胞(平均每月约减少1.25个细胞)。不过，接受Ampli-gen 和AZT联合治疗组，该组具有最低的预治疗中值和平均绝对T4淋巴细胞水平(所以处于最大的冒险之中)，实际上经历了中值绝对T4细胞水平增加了13个细胞，即使联合治疗一年之后，仍然如此。这些结果总结在表2中，且图4中列得更为详细。
图4阐明了在联合治疗的一年中中值T4淋巴细胞水平的连续变化，该联合治疗应与图3中的Ampligen 单一治疗，AZT单一治疗及安慰剂效应相比较。用于比较的基线根据开始联合治疗前的三个月立即测定的病人的连续绝对T4淋巴细胞计数的平均值算得。
头九十天周期中观察到的增加与原先报道的图3中观察到的AZT单一治疗的初步效果相符。不过，所看到的从180天至540天联合治疗中持续增加显示统计学差异，这在接受AZT单一治疗的病人中，未观察到。(非参数分析证实了一年中T4计数增加，具有统计学意义(p＞0.05)。之所以进行这种分析，是由于相对小的样本数使得有可能T水平分布不正常)。这样一来，T4淋巴细胞增加持续的时间要比AZT一单治疗预计的3至6个月的短时增加要长，而且这种结果必须来自于dsRNA的存在。另外，使用相对低剂量的AZT和dsRNA时，也看到这种效应。该观察与早先在低至200mg剂量的情况下看到的相符合。每周静脉注射两次，持续1至4个月，Ampligen 的单一治疗可以稳定未经治疗的HIV感染病人(T4＝60-300细胞/mm3)的预计的T4细胞减少，如果病人继续这种治疗5至8个月，可以维持这种效应(图3)。
根据dsRNA和AZT联合治疗的135天至630天中T4淋巴细胞计数的平均百分变化，得到的回归线见于图5。联合治疗的91至180天中每个病人的连续T淋巴细胞计数的平均数，用作确定百分变化的基线。该基线被选作为分界点，在该点的后面，估计的AZT对T4水平的影响一般已经消失。
使用统计方法，回归线的正斜率和95%可信限度的斜率指出，Ampligen 和AZT联合治疗成功地阻止了预计到的未经治疗的病人(4-6个细胞/月)和长期AZT单一治疗病人(多于6个细胞/月)的长期T4细胞减少。这样一来，联合治疗事实上无限期地维持了T4水平，而且持续时间比原先AZT单一治疗观察到的长得多，这一点正好说明了本发明在核酸耐药病毒，特别是可逆病毒治疗中的基本用途。
最后，图6通过表述当病人接受安慰剂、AZT单一治疗，Ampligen 单一治疗，或者Ampligen 和AZT联合治疗时，发展成AIDA感染/淋巴瘤(“致命事件”)的比例，证实了本发明的效用。
如同图6指出的，接受安慰剂的病人中有大约10%在12个月的观察周期中经历致命事件。开始的病人数目，研究的第6个月和第12个月，在括号中标明。在该时期内，接受AZT的病人中有大约4%经历致命事件。特别应当指出的是，单独使用AZT可以预期形成的肿瘤(参考文献6)，通过联合治疗而得到避免。使用Ampligen 和AZT联合治疗时，在绝对T4淋巴细胞计数大于115个细胞/mm3的病人中，无人发生致命事件，甚至那些由于联合治疗前基线上的中值CD4水平只有201，免疫系统明显恶化的，这样做处于极大危险中的病人，也是如此。
与实践本发明相一致，在控制病毒复制的基础打好之后，可以明智地加入诸如白细胞介素和干扰素一类的淋巴细胞活素。
参考文献1. Larder，B.A.et al pp.436-441 AntimicrobialAgents and Chemotherapy.Vol.34，March 1990.
2. Larder，B.A.et al.pp.1731-1734，Science，Vol.243，1989.
3. Jackson，J.B.et al.pp.1416-1418.JournalClin.Microbiology，Vol.216，1990;Thompson，J.D.et al.pp.371-378，Analytical Biochem.
Vol.182，1989.
4. Berenbaum，M.C.pp.269-333.Advances in CancerResearch Vol.35，1981.
5. Fischl，M.et al.p.727-733，Annals ofInternal Medicine Vol.112，1990.
6.Pluda，J.M.et al pp.276-282Annals of Internal Medicine，Vol.113(number4，1990
权利要求
1.一种联合用药治疗体系，通过这种联合治疗可以防止出现对核苷类似物耐药病毒和/或改善病情，尤其是事先存在对核苷耐药病毒的与免疫细胞有关的病情。
2.延缓，减少，或既延缓又减少在HIV感染病人中出现对核苷类似物耐药病毒的方法，该方法包括在使用核苷类似物抗病毒药治疗前，给所说的病人服用有效量的错误配对的dsRNA。
3.改善被核苷类似物耐药的HIA感染病人的外周血液单核细胞病情的方法，该方法包括给所说的病人服用有效量的错误配对的dsRNA。
4.权利要求2的方法，其中病人在使用所说的错误配对的dsRNA治疗之后，服用核苷类似物抗病毒剂。
5.权利要求3的方法，其中所说的细胞为CD4淋巴细胞。
6.权利要求2或3的方法，其中所说的错误配对的dsRNA为与聚尿苷酸复合的聚腺苷酸。
7.权利要求6的方法，其中错误配对的dsRNA为聚肌苷如聚胞苷的复合物，聚胞苷中含有1/4至1/29的尿嘧啶或鸟嘌呤碱基。
8.权利要求7的方法，其中错误配对的dsRNA为rIn·r(C11-14′U)n或为含有键断裂区域并显示有利的治疗比例性质的rIn·r(C11-14′U)n。
9.权利要求6的方法，其中服用的错误配对的dsRNA量可以使得病人全身血液循环中该错误配对的dsRNA水平达到2至1000μg/ml。
10.权利要求2或3的方法，其中dsRNA为短链的寡核苷酸，定义该寡核苷酸的通式为5′-封锁-(I)n-封锁3′3′-封锁-(C)m-封锁5′其中m和n各自都大于5，小于100，I为单磷酸化肌苷，C为单磷酸化胞苷，或5′-封锁-〔(I)xA〕j-封锁3′3′-封锁-〔(C)yU〕k-封锁3′其中x和y各自都大于5，小于25，j和k各自至少为1并小于10，I和C的定义同上，A为不是I和核苷酸，U为碱基与A配对的核苷酸，或5′(I)-铰链-(C)m3′其中n，m，I和C的定义同上，提供一根链上的封锁基与相对链上的封锁基互补。
11.按照权利要求10的方法，其中寡核苷酸被互补的非均匀高聚物的内部配对所稳定，并且封锁基或铰链基或二者都含有互补的非均匀高聚物的区域。
12.权利要求2，3或4的方法，其中所说的核苷类似物抗病毒剂为Zidovudine，二脱氧肌苷，二脱氧胞苷，或者它们的并用药物。
13.权利要求2或3的方法，其中所说的错误配对的dsRNA为rIn·(C11-14′U)n。
全文摘要
在感染治疗的早期或晚期即当病毒的基因突变已经发生以恢复对否则是无效的抗病毒剂的敏感性时，服用错误配对的dsRNA，降低用核苷类似物抗病毒剂治疗过程中，病毒的耐药性发展速度。使用错误配对的dsRNA，在外周血液单核细胞，尤其是CD4淋巴细胞中明显达到推迟和/或减小对核苷类似物耐药的可逆病毒的出现，尤其是HIV的出现。
文档编号A61K31/7084GK1068035SQ9210222
公开日1993年1月20日 申请日期1992年4月6日 优先权日1991年4月16日
发明者W·A·卡特 申请人:Hem制药公司