专利名称：制备缓释制剂的方法
技术领域：
本发明涉及包含渗透在生物可降解的基质中的水溶性多肽的缓释制剂。
蛋白质，亦称多肽，已知在体内具有各种药理作用。由于基因工程和细胞工程技术的发展，已经用生物如大肠杆菌、酵母、动物细胞和仓鼠大量地生产一些供药用的蛋白质。这样的蛋白质药物包括干扰素(α，β，γ)、白介素2、红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。然而，由于这些蛋白质通常具有短的生物半寿期，所以它们必须被频繁地服用，这样对病人造成了很大的身体注射负担。为了解决该问题，人们已进行过各种尝试来发展缓释制剂。由于由细胞素所代表的蛋白质必须特别小心地服用，同时监测其治疗效果，所以需要发展一种具有大约1-2周的释放持续期的可注射的缓释制剂，特别是微囊缓释制剂。然而，通常人们都知道，当暴露于热、有机溶剂、强剪切力等条件下时，蛋白质便变性，丧失其生物活性。例如，当在60℃加热20分钟时，蛋白质的水溶液便迅速失去其生物活性，即使在50℃的较低温度下加热约1小时，也可以降低蛋白质的生物活性。同样，人们也知道，在有机溶剂如乙醇或二氯甲烷存在下，蛋白质的生物活性也会降低。
WO93/06872公开了一种制备包含可使成骨蛋白质在延长的时间内释放的生物可降解的聚合物的多孔颗粒的药物制剂的技术;该多孔颗粒是成骨蛋白质和自体固有血液的聚集体。在该技术中，活性成分成骨蛋白质恰在给药前吸附到所述颗粒上，再加入自体固有血液形成聚集体，以控制释放。缓释持续大约数周。由于该方法涉及使用自体固有血液，所以该方法不可普遍采用。
在JournalofControlledRelease，Vol.23，p157(1993)中，A.Supersaxo等人描述了一种技术，其中用生物可降解的聚合物制备多孔微球，之后，用大分子渗透，允许大分子渗透其中以将大分子掺入微球中，而不使大分子与有机溶剂接触。具体讲，由于使用的聚乳酸是疏水性的，所以先用50%乙醇(有机溶剂)润湿微球。然后用水置换乙醇，再用大分子溶液置换。
日本专利未审查公报No.32559/1993(EP-A473268)公开了一种制备药物组合物的方法，该方法是将药物组合物组分和生物活性物质溶解在有机溶剂中或将其均匀地分散在有机溶剂或水性介质中，然后干燥所述溶液或分散液。
虽然人们已进行过各种尝试来制备上述可维持蛋白质等的生物活性的缓释制剂，但就药物渗透入基质的效率、最初药物爆裂的抑制、恒定的长期药物释放等性质而言尚未获得令人满意的缓释制剂。
因此，本发明涉及(1)一种制备缓制剂的方法，该方法包括在水性溶液中使水溶性多肽渗透到生物可降解的基质中。
(2)上述(1)的方法，其中生物可降解的基质是通过将生物可降解的聚合物和脂族羧酸的水溶性金属盐混合制备的，(3)上述(2)的方法，其中脂族羧酸是脂族单羧酸，(4)上述(2)的方法，其中水溶液金属盐是多价金属盐，(5)上述(1)的方法，包括在水溶性多肽已水性渗透到生物可降解的基质中后干燥所述生物可降解的基质的步骤，(6)上述(5)的方法，其中干燥步骤是冷冻干燥，(7)上述(1)的方法，其中水溶性多肽是细胞素，
(8)上述(7)的方法，其中细胞素是干扰素，(9)上述(1)的方法，其中生物可降解的基质呈细颗粒形式，(10)上述(1)的方法，其中生物可降解的基质是由生物可降解的聚合制备的，(11)上述(10)的方法，其中生物可降解的聚合物是脂族聚酯，(12)上述(11)的方法，其中脂族聚酯是由α-羟基羧酸衍生的共聚物，(13)上述(12)的方法，其中共聚物是乳酸-乙醇酸共聚物，(14)一种缓释制剂，它是通过使水溶性多肽渗透到生物可降解的基质中产生的，(15)一种缓释制剂，它是通过将生物可降解的聚合物和脂族羧酸的水溶性金属盐混合，然后使水溶性多肽渗透到所得生物可降解的基质中产生的，以及(16)上述(14)的缓释制剂，其中制剂是供注射用的。
本发明中所用的水溶性多肽的分子量优选为大约200-50，000，更优选的是大约5，000-40，000。
任何水溶性的多肽都可以使用，只要该多肽起激素作用并被内分泌到血流中。这样的水溶性多肽包括细胞素、造血因子、生长因子和酶。
细胞素的实例包括淋巴激活素和单激活素。淋巴激活素的实例包括干扰素(α，β，γ)和白介素(IL-2～IL-12)。单激活素的实例包括白介素(IL-1)和肿瘤坏死因子。
造血因子包括红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、血小板生成素、血小板生长刺激因子和巨核细胞增强剂。
生长因子的实例包括碱性或酸性成纤维细胞生长因子(FGF)或其家庭成员(如FGF-9)(MolecularandCellularBiology，Vol.13，NO.7，p.4251(1993))、神经细胞生长因子(NGF)或其家族成员、胰岛素样生长因子(如IGF-1，IGF-2)以及骨生长因子(BMF)或其家族成员。
酶的实例包括过氧化物歧化酶(SOD)和组织纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)。
除了上述物质外，可用作本发明的水溶性多肽的还有生长激素、胰岛素、促尿钠排泄肽、促胃液素、催乳激素、促肾上腺皮质激素(ACTH)、甲状腺刺激激素(TSH)、促黄体激素(LH)、卵泡刺激激素(FSH)、人绒膜促性腺激素(HCG)、胃动素、血管舒张素、与胰腺再生有关的Reg蛋白质(日本专利审查公报No.132388/1989，FEBSLetters，Vol.272，p.85(1990))等。
所述的水溶性多肽可以是天然衍生的或通过基因重组产生的。
本发明的水溶性多肽不局限于上述水溶性多肽。具体讲，水溶性多肽可以有糖链，也可以没有糖链，可以具有多个不同结构的糖链。水溶性多肽也可以是上述水溶性多肽的突变体、衍生物(激动性的或拮抗性的)或片段。
水溶性多肽优选是细胞素。细胞素的例子有淋巴激活素和单激活素。淋巴激活素的实例包括干扰素(α，β，γ)和白介素(IL-2～IL12)。单激活素的实例包括白介素(IL-1)和肿瘤坏死因子。
水溶性多肽更优选地是淋巴激活素。淋巴激活素的实例包括干扰素(α，β，γ)和白介素(IL-2～IL-12)。
水溶性多肽最优选的是干扰素(α，β，γ)。
在本发明中，生物可降解的基质优选为细颗粒形式。生物可降解的基质可以具有任何粒度，只要它能通过供正常皮下或肌内注射用的普通注射针头就行，具体讲，它为大约0.1-300μm，优选约1-150μm，最优选约2-100μm。
生物可降解的基质通过本身已知的方法从例如生物可降解的聚合物产生。生物可降解的基质最好通过将生物可降解的聚合物和脂族羧酸的水溶性金属盐相混合而制备。可用于此目的方法包括下述的水中干燥法、相分离方法和喷雾干燥法及其改进方法。
(ⅰ)水中干燥法(w/o/w法)将水或含水溶性组分的水溶液用作内水相。水溶性组分的例子有无机盐(如氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠)、糖类(如甘露糖醇、葡萄糖、菊粉)、有机盐(如碳酸钠、碳酸镁、乙酸铵)和氨基酸(如甘氨酸、精氨酸、组氨酸)。水溶性组分在水溶液中的浓度为，例如大约0.1-10%(w/v)、优选大约0.5-5%(w/v)。具体讲，例如，当水溶性组分是氯化钠时，优选使用0.9%(w/v)的生理盐水。代替上述水溶性组分，可以将碳酸钙等分散在内水相中。优选地，将含有脂族羧酸的水溶性金属盐的水溶液用作内水相。金属盐在水溶液中的浓度通常为大约10-90%(w/v)，优选大约20-80%(w/v)，这取决于所述金属盐的溶解性。
将上述的水或含有水溶性组分的水溶液乳化或分散在由α-羟基羧酸合成的生物可降解的聚合物或共聚物的有机溶剂溶液中，制得w/o乳液，虽然生物可降解的聚合物在有机溶剂溶液中的浓度随着生物可降解的聚合物的分子量和有机溶剂的种类而改变，但它选自大约0.01-90%(w/w)范围，优选大约0.1-80%(w/w)，更优选是大约1-70%(w/w)。
水或含水溶性组分的水溶液与生物可降解的聚合物的有机溶剂溶液的比例通常为1∶1000-1∶1(v/v)，优选1∶100-1∶5(v/v)，更优选是1∶50-1∶5(v/v)，该乳化通过用叶轮机型机械搅拌器、均化器等的已知分散方法来完成。
将如此制得的w/o乳液加到另一个水相(外水相)中形成w/o/w乳液，接着蒸发油相中的溶剂，得到生物可降解的基质。油相溶剂通过用例如叶轮机型机械搅拌器搅拌来蒸发。水相体积通常为油相体积的大约1-10，000倍，优选大约2-5，000倍，更优选大约5-2，000倍。
可以向外水相中加入乳化剂，乳化剂可以是任何乳化剂，只要它能形成稳定的o/w乳液就行。这样的乳化剂的实例包括阴离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羧甲基纤维素、卵磷脂、明胶和透明质酸。它们可被单独使用或结合使用。所用的乳化剂的浓度通常适当地选自大约0.001-20%(w/w)，优选大约0.01-10%(w/w)，更优选地大约0.05-5%(w/w)。代替水溶性组分，当将碳酸钙分散在内水相中时，通过向外水相中加入稀盐酸溶解所述碳酸钙。
可以向外水相中补以脂族羧酸的水溶性金属盐。所用金属盐可以与内水相中所用的脂族羧酸的金属盐相同或不同。在该种情况下，优选加入脂族羧酸金属盐使其在外水相中的浓度为大约0.01-20%(w/w)，更优选是大约0.1-10%(w/w)。通过改变脂族羧酸金属盐在外水相中的浓度，也可以控制脂族羧酸的金属盐从生物可降解的基质中被洗出。
通过离心或过滤，收集如此得到的生物可降解的基质，然后用蒸馏水分数个循环反复洗涤，以除去粘附在所述基质表面的乳化剂等，再将基质分散在蒸馏水等中，然后冷冻干燥。
所得生物可降解的基质的表面不是光滑的，具有各种大小的孔，一些孔到达了生物可降解的基质的内部。通过例如压缩汞注射法或BET法可以测定生物可降解的基质中这些孔的体积比率(孔隙度)。孔隙度随着内水相组分、内水相浓度、内水相溶液和生物可降解的聚合物的有机溶剂溶液的比率、外水相体积和油相体积的比率、外水相温度以及其它因素而变化;在生物可降解的基质内看到了不同的孔结构。
脂族羧酸的水溶性金属盐在生物可降解的基质中的含量按金属计优选为大约0.01-10%(w/w)，更优选大约为0.05-7%(w/w)，最优选大约为0.1-5%(w/w)。通过原子吸收法和其它方法测定脂族羧酸的水溶性金属盐在生物可降解的基质中按金属计的含量。
(ⅱ)水中干燥法(o/w方法)在本发明中，也可以不使用内水相来制备生物可降解的基质。在该方法中，先制备生物可降解的聚合物在有机溶剂中的溶液。在该操作中，生物可降解的聚合物在有机溶剂溶液中的浓度随生物可降解的聚合物的分子量、有机溶剂的种类和其它因素而改变，通常选自大约0.01-90%(w/w)范围，优选约0.1-80%(w/w)，更优选约1-70%(w/w)。
可以将碳酸钙加到并分散在生物可降解的聚合物的有机溶剂溶液中。在该操作中，设定加入的碳酸钙的量使得碳酸钙和生物可降解的聚合物的重量比为大约5∶1-1∶100，优选大约2∶1-1∶10。
优选地，将脂族羧酸的水溶性金属盐加到并分散到生物可降解的聚合物的有机溶剂溶液中。加入脂族羧酸金属盐的量应使得脂族羧酸金属盐与生物可降解的聚合物的重量比为大约5∶1-1∶100，优选大约2∶1-1∶50，更优选地大约1∶1-1∶10。
接着，用叶轮机型机械搅拌器或类似装置搅拌，将如此制得的有机溶剂溶液加到水相中形成o/w乳液，接着蒸发油相中的溶剂，得到生物可降解的基质。水相的体积通常选自油相体积的大约1-10，000倍，优选大约2-5，000倍，更优选大约5-2，000倍。
可以向外水相中加入乳化剂，乳化剂可以是任何乳化剂，只要它能形成稳定的o/w乳液就行。这样的乳化剂的实例包括阴离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羧甲基纤维素、卵磷脂、明胶和透明质酸。它们可被单独使用或结合使用。所用的乳化剂的浓度通常适当地选自大约0.001-20%(w/w)，优选大约0.01-10%(w/w)，更优选地大约0.05-5%(w/w)。当将碳酸钙加入并分散在生物可降解的聚合物的有机溶剂溶液中时，向外水相中加入稀盐酸。
可以向外水相中补以脂族羧酸的水溶性金属盐。所用金属盐可以与加到并分散在生物可降解的聚合物的有机溶剂溶液中的脂族羧酸的金属盐相同或不同。在该种情况下，优选加入脂族羧酸金属盐使其在外水相中的浓度为大约0.01-20%(w/w)，更优选是大约0.1-10%(w/w)。通过改变脂族羧酸金属盐在外水相中的浓度，可以控制脂族羧酸的金属盐从生物可降解的基质中被洗出。
另外，也可以按上述方式通过将生物可降解的聚合物的有机溶剂溶液加到含脂族羧酸的水溶性金属盐的外水相中形成o/w乳液来产生生物可降解的基质。
通过离心或过滤，收集如此得到的生物可降解的基质，然后用蒸馏水分数个循环反复洗涤，以除去粘附在所述基质表面的乳化剂等，再将基质分散在蒸馏水等中，然后冷冻干燥。
脂族羧酸的水溶性金属盐在生物可降解的基质中的含量按金属计优选为大约0.01-10%(w/w)，更优选大约为0.05-7%(w/w)，最优选大约为0.1-5%(w/w)。
(ⅲ)相分离法(凝聚法)在通过相分离法产生生物可降解的基质时，在搅拌期间将凝聚剂一点一点地加到上述的生物可降解的聚合物的w/o乳液或有机溶剂溶液中，以使生物可降解的聚合物分离并固化，加入凝聚剂的量按体积计为生物可降解的聚合物的w/o乳液或有机溶剂溶液的大约0.01-1，000倍，优选大约0.05-500倍，更优选大约0.1-200倍。
任何凝聚剂都是可接受的，它可以是一种聚合物、矿物油或植物油化合物，只要它在生物可降解的聚合物所用的溶剂中混溶并且不溶解所述聚合物就行。凝聚剂的实例包括硅油、芝麻油、豆油、玉米油、棉籽油、椰子油、亚麻子油、矿物油、正已烷和正庚烷。这些物质可单独使用，也可结合使用。
过滤收集这样得到的生物可降解的基质，然后，用庚烷等反复洗涤以除去凝聚剂。然后以在水性干燥法中的同样方式洗涤该生物可降解的基质，最后冷冻干燥。
通过已知方法可以除去溶剂，所述方法包括在用叶片式搅拌器、磁力搅拌器或类似装置搅拌下于常压或逐渐减压下蒸发溶剂的方法和用旋转蒸发器或类似装置调节真空度的同时蒸发溶剂的方法。
脂族羧酸的水溶性金属盐在生物可降解的基质中的含量按金属计优选大约为0.01-10%(w/w)，更优选为大约0.05-7%(w/w)，最优选为大约0.1-5%。
在通过水中干燥法或凝聚法的生产中，可以加入防絮凝剂以防颗粒发生絮凝作用。防絮凝剂的例子有水溶性多糖类如甘露糖醇、乳糖、葡萄糖、淀粉(如玉米淀粉)、透明质酸或其碱金属盐、蛋白质类如甘氨酸、血纤维蛋白和胶原以及无机盐如氯化钠和磷酸氢钠。
(ⅳ)喷雾干燥法通过喷雾干燥法生产生物可降解的基质时，将(a)包含水或包含含有水溶性组分和生物可降解的聚合物的水溶液的w/o乳液或者(b)生物可降解的聚合物的有机溶剂溶液，通过喷嘴喷到喷雾干燥器的干燥室中使有机溶剂以细小的滴状形式在很短的时间内挥发，得到细小的生物可降解的胶囊。所述的喷嘴的例子有双液喷嘴(double-fluidnozzle)、压力喷嘴和旋转盘喷嘴。需要时，为了防止生物可降解的基质发生絮凝作用，在对(a)包含水或包含含有水溶性组分和生物可降解的聚合物的水溶液的w/o乳液或(b)生物可降解的有机溶剂溶液喷雾的同时，可以通过另一个喷嘴有效地对上述防絮凝剂的水溶液进行喷雾。生物可降解的基质优选用包含含有脂族羧酸的水溶性金属盐和生物可降解的聚合物的水溶液的w/o乳液或者含有脂族羧酸水溶性金属盐的生物可降解的聚合物悬浮液的有机溶液产生。需要时，可以在升高的温度和减压下除去所得生物可降解的基质中的水和有机溶剂。
保留在用于本发明的生物可降解的基质中的有机溶剂的量通常少于大约1，000ppm，优选少于大约500ppm，更优选少于大约250ppm，最好少于100ppm。
用作本发明的生物可降解的基质的原料优选是生物可降解的聚合物。生物可降解的聚合物的实例包括不溶或微溶于水的高分子聚合物如脂族聚酯(如由一种或多种α-羟基羧酸如乙醇酸、乳酸、羟基丁酸、缬氨酸和亮氨酸、羟基二羧酸如苹果酸、羟基三羧酸如柠檬酸以及其它酸产生的聚合物、共聚物或其混合物)、聚-α-氰基丙烯酸酯和聚氨基酸(如聚-γ-苄基-L-谷氨酸)，以及它们的混合物。在这里，聚合类型可以是无规聚合、嵌段聚合或接枝聚合。
生物可降解的聚合物优选是脂族聚酯(如由一种或多种α-羟基羧酸如乙醇酸、乳酸和羟基丁酸、羟基二羧酸如苹果酸、羟基三羧酸如柠檬酸以及其它酸产生的聚合物、共聚物或其混合物)。
上述脂族聚酯中，从可靠的生物降解能力和生物相容性观点来看，优选的是由一种或多种α-羟基羧酸(如乙醇酸、乳酸和羟基丁酸)合成的聚合物或共聚物。更优选地，脂族聚酯是由一种或多种α-羟基羧酸(如乙醇酸、乳酸、羟基丁酸)合成的共聚物。最好，脂族聚酯是由两种或多种α-羟基羧酸(如乙醇酸、乳酸、羟基丁酸)产生的共聚物(如乙醇酸-乳酸共聚物)。
本发明的生物可降解的聚合物优选是这样一类聚合物，当通过已知方法制备并形成可用普通注射针头注射的生物可降解的基质时，它允许水渗透并在没有乙醇和其它有机溶剂存在下通过溶胀使生物可降解的基质增大。
虽然上述α-羟基羧酸可以具有D-、L-或D，L-构型，但优选D-/L-构型的比率(mol%)落在大约75/25-25/75的范围内。更优选地，羟基羧酸中D-/L-构型比率(mol%)落在大约60/40-30/70范围内。
上述α-羟基羧酸共聚物的实例包括乙醇酸与另一种α-羟基酸的共聚物，所述的另一种α-羟基酸优选是乳酸、2-羟基丁酸、缬氨酸或亮氨酸。
α-羟基羧酸共聚物优选是乳酸-乙醇酸共聚物或2-羟基丁酸-乙醇酸共聚物。
更优选地，α-羟基羧酸共聚物是乳酸-乙醇酸共聚物。
关于乳酸-乙醇酸共聚物，优选的含量比率(乳酸/乙醇酸)是大约100/0-40/60，更优选地是大约90/10-45/55，最好是大约60/40-45/55。上述乙醇酸-乳酸的重均分子量优选为大约3，000-12，000，更优选是大约4，000-10，000。水溶性多肽渗透到用所述共聚物产生的生物可降解的基质中的渗透率以及给药后生物可降解的基质的体内排除率受含量比率和重均分子量共同影响。当给药(如皮下给药)后的体内排除期是大约2周时，并且如果水渗透到生物可降解的胶囊中没有问题的话，那么，举例来说，含量比率(乳酸/乙醇酸)可以是大约50/50，而重均分子量应为大约4，000-9，000，优选大约5，000-9，000。
在本发明中，可以将具有不同组成和重均分子量的两种乳酸-乙醇酸共聚物以任意比例的混合物形式使用。
这样的混合物包括具有大约75/25的含量比率(乳酸/乙醇酸，mol%)和大约6，000的重均分子量的乳酸-乙醇酸共聚物与具有大约50/50的含量比率(乳酸/乙醇酸，mol%)和大约4，000的重均分子量的另一种乳酸-乙醇酸共聚物的混合物。重量混合比优选为大约25/75-75/25。
乳酸-乙醇酸共聚物的分散度(重均分子量/数均分子量)优选为大约1.2-4.0。更优选地，所述共聚物的分散度是大约1.5-3.5。本发明的乳酸-乙醇酸共聚物可以通过已知方法如日本专利未审查公报No.28521/1986中所述的方法产生。优选地，所述共聚物通过无催化剂的脱水聚合缩合产生。
关于2-羟基丁酸-乙醇酸共聚物，优选地，乙醇酸占大约10-75mol%，而余量为2-羟基丁酸。更优选地，乙醇酸占大约20-75mol%，最好占大约30-70mol%。2-羟基丁酸-乙醇酸共聚物的重均分子量为大约2，000-20，000，优选大约3，000-10，000，更优选为大约4，000-8，000。所述乙醇酸共聚物的分散度(重均分子量/数均分子量)优选为大约1.2-4.0，更优选为大约1.5-3.5。该乙醇酸共聚物可以通过已知方法如日本专利未审查公报No.28521/1986中所述的方法(基于在没有催化剂存在下或在有机固体酸催化剂存在下的脱水聚合缩合的方法)产生。优选地，所述共聚物通过无催化剂的脱水聚合缩合方法产生。
上述乙醇酸共聚物可以以与聚乳酸的混合物形式使用。虽然聚乳酸可以具有D-构型、L-构型或其混合物，但优选的是，D-/L-构型的比率(mol%)落在大约75/25-20/80的范围内。更优选的是一种D-/L-构型的比率(mol%)落在大约60/40-25/75范围内的聚乳酸。最好是一种D-/L-构型的比率(mol%)落在大约55/45-25/75范围内的聚乳酸。所述的聚乳酸优选具有大约1，500-10，000的重均分子量，更优选地，所述分子量落在大约2，000-8，000范围内，最好在大约3，000-6，000范围内。所述聚乳酸的分散度优选为大约1.2-4.0，更优选为大约1.5-3.5。
已知有两种产生聚乳酸的方法丙交酯(一种乳酸二聚体)的开环聚合和乳酸的脱水聚合缩合。为了得到用于本发明的分子量较低的聚乳酸，优选方法是乳酸的直接脱水聚合缩合。该方法例如描述在日本专利未审查公报No.28521/1986中。
当将乙醇酸共聚物与聚乳酸混合使用时，它们的混合比为大约10/90-90/10(重量%)，优选为大约20/80-80/20，更优选为大约30/70-70/30。
在本发明中，由无催化剂的脱水聚合缩合产生的生物可降解的聚合物通常具有末端羧基。
具有末端羧基的生物可降解的聚合物是这样一种聚合物，其中用GPC测定法测定的数均分子量与用端基测定法测定的数均分子量几乎一致。
为了对末端羧基进行定量，将大约1-3g的生物可降解的聚合物溶解在丙酮(25ml)和甲醇(5ml)的混合溶剂中，在室温搅拌下用酚酞作为指示剂用0.05N氢氧化钾的醇溶液快速滴定，测定末端羧基含量;由下述公式计算数均分子量端基测定法测定的数均分子量＝20，000A/B其中，A为生物可降解的聚合物的重量(g)，B为达到滴定终点时所加的0.05N氢氧化钾醇溶液的量(ml)。
下文中，该值被称为由端基测定法测定的数均分子量。
例如，在聚合物具有末端羧基并且是通过无催化剂的脱水聚合缩合法由一种或多种α-羟基酸产生的情况下，由GPC测定法测定的数均分子量与由端基测定法测定的数均分子量几乎彼此一致。另一方面，在聚合物没有末端羧基并且是用催化剂通过开环聚合法由环状二聚体合成的情况下，由端基测定法测定的数均分子量明显高于由GPC测定法测定的数均分子量。这种差别使得可以清楚地区分具有末端羧基的聚合物和没有末端羧基的聚合物。
由端基测定法测定的数均分子量是一个绝对值，而由GPC测定法测定的数均分子量是一个相对值，它随着各种分析条件(如流动相的种类、柱的类型、参比物质、选择板的宽度、选择的基线等)而变化，所以难以用一个绝对数字表示由GPC测定法测定的数均分子量。然而，由GPC测定法测定的数均分子量与由端基测定的数均分子量几乎彼此一致的事实意味着由端基测定法测定的数均分子量落在由GPC测定法测定的数均分子量的大约0.5-2倍、优选大约0.8-1.5倍的范围内。同样，由端基测定法测定的数均分子量显著高于由GPC测定法测定的数均分子量的事实意味着由端基测定法测定的数均分子量超过由GPC测定法测定的数均分子量的大约2倍。
在本发明中，优选由GPC测定法测定的数均分子量与由端基测定法测定的数均分子量几乎彼此一致的聚合物。
在本说明书中，重均分子量和数均分子量是用重均分子量分别为120，000、52，000、22，000、9，200、5，050、2，950、1，050、580和162的9种聚苯乙烯作为参比物通过凝胶渗透色谱(GPC)得到的基于聚苯乙烯的那些值。测量使用的是GPC柱KF804L×2(由ShowaDenko生产)和RI检测器L-3300(由Hitachi，Ltd.生产)，用氯仿作为流动相。
分散度通过下式计算重均分子量/数均分子量。
脂族羧酸的水溶性金属盐可以是任何一种，没有限制，只要它在水中可溶并且不对活体产生不利影响就行。
脂族羧酸的水溶性金属盐优选是这样一种脂族羧酸的金属盐，它在常温(大约20℃)下的水溶解度超过大约200mg/ml。
关于脂族羧酸的水溶性金属盐，其中的脂族羧酸优选具有2-9个碳原子。脂族羧酸包括脂族单羧酸、脂族二羧酸和脂族三羧酸。这些羧酸可以是饱和或不饱和的。
脂族单羧酸的实例包括具有2-9个碳原子的饱和脂族单羧酸(如乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、已酸、庚酸、辛酸、壬酸、caprynicacid)和具有2-9个碳原子的不饱和脂族单羧酸(如丙烯酸、丙炔酸、甲基丙烯酸、巴豆酸、异巴豆酸)。
脂族二羧酸的实例包括具有2-9个碳原子的饱和脂族二羧酸(如丙二酸、丁二酸、戊二酸、已二酸、庚二酸)和具有2-9个碳原子的不饱和脂族二羧酸(如马来酸、富马酸、柠康酸、中康酸)。
脂族三羧酸的实例包括具有2-9个碳原子的饱和脂族三羧酸(如丙三羧酸、1，2，3-丁三羧酸)。
这些脂族羧酸可以具有1或2个羟基。这样的脂族羧酸包括乙醇酸、乳酸、甘油酸、丙醇二酸、苹果酸、酒石酸和柠檬酸)。
脂族羧酸优选是脂族单羧酸，更优选的是具有2-9个碳原子的饱和脂族单羧酸，进一步优选的是具有2至3个碳原子的饱和脂族单羧酸。特别优选的脂族羧酸的实例包括乙酸。
在脂族羧酸的水溶性金属盐中，所述金属盐的实例有一价金属盐如碱金属(如钠、钾)盐和铜(Ⅰ)以及多价金属盐如碱土金属(如钙、镁)的盐、锌(Ⅱ)盐、铁(Ⅱ、Ⅲ)盐、铜(Ⅱ)盐、锡(Ⅱ、Ⅳ)盐和铝(Ⅱ、Ⅲ)盐。
金属盐优选是多价金属盐，更优选的是钙盐或锌盐。
脂族羧酸的水溶性金属盐的实例包括乙酸钠、乙酸钾、乙酸钙、乙酸锌、丙酸钠、丙酸钙、乙醇酸钠、乙醇酸锌、乳酸钠、乳酸钙、乳酸锌、酒石酸钠、酒石酸锌和柠檬酸钠。更优选的脂族羧酸的水溶性金属盐包括乙酸钙和乙酸锌。
芳族羧酸的水溶性金属盐可以以与脂族羧酸的水溶性金属盐的同样方式使用。芳族羧酸的水溶性金属盐的实例包括苯甲酸钠、苯甲酸锌、水杨酸钠和水杨酸锌。
用于上述方法的油相中所用的溶剂优选为可溶解所述生物可降解基质的、沸点不高于120℃的有机溶剂。这样的溶剂包括囟代烃类(如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳)、醇类(如乙醇、甲醇)和乙腈。它们可被单独使用或结合使用。有机溶剂优选为二氯甲烷或乙腈。
本发明的缓释剂制剂可以通过在水溶液中使水溶性多肽渗透到生物可降解的基质中来制备。本发明的缓释制剂(如微胶囊)可以通过例如下述步骤制备。这样制得的缓释制剂下文也称之为微胶囊。
1)制备水溶性多肽的水溶液。
2)使生物可降解的基质与上述1)的水溶液接触，使后者渗透到生物可降解的基质中。
3)必要时，将未渗透到生物可降解的基质中的水溶性多肽与生物可降解的基质分离(洗涤)。
4)对缓释制剂(如微胶囊)进行干燥，其中所述缓释制剂是通过使水溶性多肽渗透到生物可降解的基质中产生的。
可以向上述水溶性多肽的水溶液中加入可体内注射的盐如无机盐(如氯化钠、磷酸-氢钠)、有机盐(如乙酸铵)和氨基酸(如甘氨酸、精氨酸、组氨酸)以增大水溶性多肽的溶解度或维持水溶性多肽的生物活性。
可以将这些盐结合使用以获得接近药物最佳pH的pH值。虽然通常是将所述水溶液调到中性或弱酸性pH值，但它也可以被调成碱性pH值。调节这些盐的浓度以使水溶性多肽的水溶液的渗透压力为生理盐水的大约1/50-5倍，优选为大约1/25-3倍。可以加入表面活性剂如Tween80。表面活性剂以大约0.0001-0.2%(w/v)浓度使用，优选浓度为大约0.001-0.1%(w/v)。
可以向水溶性多肽的水溶液中加入血清白蛋白。加入血清白蛋白可以增加水溶性多肽的溶解度并能使水溶性多肽保持有生物活性。可将血清白蛋白预先与水溶性多肽混合。加入的血清白蛋白优选是人的血清白蛋白，它可以从人体血液中分离和纯化得到，也可以通过基因工程技术产生。水溶性多肽和血清白蛋白的混合比(按重量计)为例如大约1∶1，000-100∶1，优选大约1∶100-10∶1。
虽然水溶性多肽在水溶液中的浓度不受限制，但优选地，所述浓度在低于水溶性多肽的溶解度时应尽可能地高，以使每单位重量的生物可降解的基质渗透有最大可能量的水溶性多肽。所述溶解度随盐浓度、温度和添加剂存在与否而变化。一般人们都知道，缓释制剂的水溶性多肽的释放模式随水溶性多肽渗透到生物可降解的基质中的浓度而变化;水溶性多肽的浓度也是从这一观点出发选择的。水溶性多肽的浓度通常为大约100μg/ml-500mg/ml，优选为大约1-300mg/ml，更优选的是大约1-100mg/ml。
在生物可降解的基质是通过将生物可降解的聚合物和脂族羧酸的水溶性金属盐混合来产生的情况下，当使水溶性多肽的水溶性渗透到生物可降解的基质中时，虽然水溶性多肽的水溶液的pH值随生物可降解的基质中所含的脂族羧酸的水溶性金属盐的种类、水溶性多肽的等电点和其它因素而改变，但它优选为大约3-9，更优选的是大约3-8。可以用酸如无机酸(如盐酸)或有机酸(如乙酸)或碱如碱金属氢氧化物(如氢氧化钠)适当地调节pH值。按照酸或碱的电离程度和强度以及所希望的pH值，适当地选择用于此目的的酸或碱的量。优选的脂族羧酸的水溶性金属盐包括乙酸钠、乙酸锌和乙酸钙，这是因为它们能在接近于中性pH值时使水溶性多肽的水溶液渗透生物可降解的基质。
水溶性多肽在水溶液中向生物可降解的基质的渗透通过例如将水溶性多肽的水溶液与生物可降解的基质混合来完成。
混合水溶性多肽的水溶液和生物可降解的基质的次序是任选的，只要能保持水溶性多肽的生物活性就行。例如，可以将生物可降解的基质浸没在水溶性多肽的水溶液中，也可以将水溶性多肽的水溶液加到生物可降解的基质中。
设定水溶性多肽的水溶液和生物可降解的基质的混合比，使得水溶性多肽的水溶液的用量过量，以便用水溶性多肽的水溶液彻底渗透生物可降解的基质。换句话说，制备混合物以使全部生物可降解的基质浸没在水溶性多肽的水溶液中。
尽管水溶性多肽水溶液和生物可降解基质的重量比例因生物可降解基质的孔隙率变化大而不能明确确定，但该比例优选为约1∶10至20∶1，更优选为约1∶5至10∶1。不过，通常在必需范围内采用尽可能少量的水溶性多肽水溶液，以最大限度地减少贵重的水溶性多肽的损失，并且避免重复使用未渗入生物可降解基质的水溶性多肽。水溶性多肽的水溶液和生物可降解基质一般用容器进行混合，优选用对水溶性多肽的吸附性极低的容器，如用硅化玻璃。同样可优选经过表面处理后对水溶性多肽的生物活性没有影响的合金(不锈钢和钛合金)。
作为举例，将生物可降解的基质加入水溶性多肽的水溶液中并放置即可实现混合操作，放置期间可不进行搅拌或进行轻微搅拌，但搅拌强度以不丧失水溶性多肽的生物活性为限。这种混合操作可在一定真空下进行，其中真空度以水溶性多肽的水溶液不过分鼓泡为宜。该混合操作在不会影响水溶性多肽的生物活性或不会使构成生物可降解基质的生物可降解聚合物分解的温度下进行，一般温度为室温，优选在低温处进行。具体地讲，混合温度为约1-30℃，优选约4-25℃。混合时间可从几分钟至数十小时，优选几小时至数十小时，这取决于生物可降解基质的含量、生物可降解聚合物的组成、分子量、温度和其它因素。具体地讲，可在约4℃下混合约10-100小时或在约25℃下混合约5-50小时。在水溶性多肽不丧失生物活性并且生物可降解聚合物不过分水解的条件下，混合时间可任意选定。在应用生物可降解聚合物与脂族羧酸的水溶性金属盐混合所得生物可降解基质的情况下，该混合时间可缩短。具体地讲，可于约4℃下混合约0.5-24小时，或于约25℃下混合约0.5-5小时。
混合操作后必要时可进行洗涤。这种洗涤操作去除未渗入生物可降解基质的水溶性多肽。可采用各种洗涤方法，包括不会破坏生物可降解基质的方法和渗入生物可降解基质的水溶性多肽不会从生物可降解基质中渗漏出来并且可保持其生物活性的方法。例如，在混合操作结束后就加洗涤液，然后进行离心或过滤操作以使微胶囊与洗涤液分开，再重复这一过程。该操作所用洗涤液可为蒸馏水或含盐(如磷酸氢钠、氯化钠)或糖(如甘露糖醇)的水溶液。该洗涤液优选含甘露糖醇的水溶液。
然后将所得微胶囊干燥。干燥方法包括冻干法和真空干燥法，优选冻干法。可加入防絮凝剂以防在干燥操作期间出现颗粒絮凝。防絮凝剂的例子可举出水溶性多糖如甘露糖醇、乳糖、葡萄糖和淀粉(如玉米淀粉)、粘多糖如透明质酸、蛋白质如甘氨酸、血纤维蛋白和胶原蛋白、无机酸盐如氯化钠和磷酸氢钠以及磷脂如卵磷脂。
在干燥操作过程中，在水溶性多肽的生物活性不受影响和微胶囊不被破坏的条件下，干燥温度就可任意选定。优选的是，加热温度超过所用可生物降解聚合物的玻璃转化温度，但不会使微胶囊粒相互粘结。玻璃转化温度定义为用差示扫描量热仪(DSC)以约10或20℃/分钟的速度加热而达到的中间玻璃转化温度(Tmg)。优选的是，加热温度比玻璃转化温度高约2-10℃，尤其是约25-50℃，优选约30-45℃。加热时间为数小时，优选为微胶囊达到给定温度后的约24小时内。这取决于加热温度、被处理微胶囊量和其它因素。只要能保证微胶囊均匀受热，就可不加限制地采用任何加热方法。这类加热方法包括在恒温室中加热和微波炉加热。这种干燥操作可抑制微胶囊施用于温血动物后出现过早释放。
在本发明中，水溶性多肽的生物活性在微胶囊制备过程中几乎不受影响，因为在水溶性多肽渗入可生物降解基质时没有采用有机溶剂，也没有进行过度加热。这里提到的有机溶剂的例子可举出囟代烃、醇、乙腈和冰醋酸。
应用脂族羧酸的水溶性金属盐可使水溶性多肽有效地渗入可生物降解的基质。在用于注射时，本发明缓释制剂可在长时间如约1星期至1个月内达到几乎恒定的缓释效果。
在本发明缓释制剂为微胶囊时，其中的水溶性多肽含量的确定方法例子是采用色谱法如HPLC或免疫测定法如用酶免疫测定法分离出微胶囊中所含的水溶性多肽并将其定量，或测定分离出来的水溶性多肽的生物活性。微胶囊中水溶性多肽与生物可降解的聚合物之含量比例一般为约0.1-30%(w/w)，优选为约1-20%(w/w)。
本发明缓释制剂可以如此之微胶囊形式给药，也可以各种非口服剂型(如肌内、皮下或内脏注射液或导服制剂、鼻内、直肠或子宫内经粘膜给药制剂)或口服剂型(如胶囊(如硬胶囊和软胶囊)或固体制剂如粒剂和粉剂或液体制剂如悬浊液)给药。
在本发明中，缓释制剂优选用于注射。在该缓释制剂为微胶囊时，可将其制成注射制剂，其制备方法例如将该微胶囊与分散剂(如表面活性剂如Tween80和HCO-60、多糖如羧甲基纤维素、藻酸钠和透明质酸钠，以及硫酸鱼精蛋白)，防腐剂(如羟苯甲酸甲酯、羟苯甲酸丙酯)、等渗剂(如氯化钠、甘露糖醇、山梨糖醇、葡萄糖)、局部麻醉剂(如木卡因盐酸盐、氯丁醇)等一起悬浮在水中而得到水悬浊液，或将其分散在植物油如芝麻油或玉米油或中等链长脂肪酸甘油三酯(如Miglyol812，HülsAktiengesellschaft)中并加入或不加磷脂如卵磷脂而得到油悬浊液。
在缓释制剂为微胶囊时，如果将其用作可注射悬浊液，则只要能满足分散度和穿过针头的要求，就可将其粒径选为例如约0.1-300μm。优选的是，粒径范围为约1-150μm，更优选约2-100μm。
上述微胶囊可制成无菌制剂，其中可采用使整个生产过程无菌的方法，用伽马射线作为灭菌射线的方法和加抗菌剂的方法，但并不仅限于这些方法。
本发明缓释制剂毒性低，可安全地用于哺乳动物(如人、牛、猪、狗、猫、小鼠、大鼠、兔)。
本发明缓释制剂的适应征根据所用水溶性多肽而变化。例如，本发明缓释制剂中水溶性多肽为α-干扰素时可有效地用于治疗或预防病毒性肝炎(如丙型肝炎、HBe抗原呈阳性的慢性活动性乙型肝炎)、癌症(如肾癌和多发性骨髓瘤)，水溶性多肽为红细胞生成素时可有效地用于治疗贫血(如肾透析过程中的贫血)，水溶性多肽为G-CSF时可有效地用于治疗中性白细胞减少(如在抗癌剂治疗期间)和传染性疾病，水溶性多肽为IL-2时可有效地用于治疗癌症(如血管内皮瘤)，水溶性多肽为FGF时可有效地用于治疗消化道溃疡，水溶性多肽为FGF-9时可有效地用于治疗血小板减少，水溶性多肽为NGF时可有效地用于治疗老年性痴呆和神经病，水溶性多肽为TPA时可有效地用于治疗血栓形成等，水溶性多肽为胰岛素时可有效地用于治疗糖尿病，水溶性多肽为肿瘤坏死因子时可有效地用于治疗癌症。
根据水溶性多肽的类型和含量、水溶性多肽释放时间、待治疗疾病、接受治疗的动物和其它因素，可选取不同的缓释制剂剂量，使水溶性多肽显示出其药理作用。在制剂预定释放时间为1星期时，每个成人每次服用的水溶性多肽剂量可适当选为约0.0001-10mg/kg体重，更优选为约0.0005-1mg/kg体重。
每个成人每次服用的缓释制剂量可适当地选为约0.0005-50mg/kg体重，更优选为约0.0025-10mg/kg体重。给药次数可根据水溶性多肽种类、含量和剂型、水溶性多肽释放时间、待治疗疾病、接受治疗的动物和其它因素而适当地选定，例如每星期一次或每两星期一次。
尽管本发明制剂可在常温或低温处贮存，但优选将其贮存在低温处。这里所说的常温和低温处由PharmacopoeiaofJapan定义，具体地讲常温为15-25℃，而低温处为15℃以下。
以下实施例和比较例详述本发明，但不应理解为是对本发明的限制。除另有说明外，以%单位计的数值为重量/体积(w/v)比例。
实施例1将2.0g乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，以mol%计，GPC重均分子量5，400，GPC数均分子量2，900，端基测定法测定的数均分子量2，200，由WakoPureChemical生产)溶于5.3g(4ml)二氯甲烷中。加入1ml注射用生理盐水作为内水相后，用均化器(Polytron)将混合物搅拌约30秒。将该溶液倒入500ml已预先调为18℃的0.1%(w/w)聚乙烯醇(EG-40，由TheNipponSyntheticChemicalIndustry，Co.，Ltd.生产)的水溶液中，然后在高速涡轮搅拌器中以4，000rpm速度搅拌而得到w/o/w乳液，之后再于室温下将该乳液搅拌5小时而使二氯甲烷挥发并使油相固化，最后用离心机(05PR-22，Hitachi，Ltd.)以2，000rpm转速离心收集固体。所得沉淀再分散于蒸馏水中并进行离心分离。在将收集得到的乳酸-乙醇酸共聚物基质再分散于少量蒸馏水中后，将分散液冻干而得到粉末。
在聚乙烯试管中称量的1.08×109IU(国际单位)α-干扰素(含约25mg人血清白蛋白)溶于200μl蒸馏水中。向该溶液中加入200mg上述生物可降解的基质。在进行密封后，该混合物在冰箱中于4-8℃放置约4天。这一操作之后，加入5ml蒸馏水，然后轻微搅拌约1分钟并后续以约2，000rpm的速度离心分离5分钟，此后废弃上层清液。这一系列操作重复3次以进行洗涤。向所得微胶囊中加入44mg D-甘露糖醇和2ml蒸馏水，然后轻微搅拌而得到分散体，最后在40℃下真空干燥6小时。
实施例2按同于实施例1的方法得到粉状乳酸-乙醇酸共聚物基质。
将在聚乙烯试管中称量的1.08×109IUα-干扰素(含约25mg人血清白蛋白)溶于200μl蒸馏水中。向该溶液中加入200mg上述生物可降解的基质。在进行密封后，混合物在冰箱中于4-8℃放置约30小时。该操作之后加入5ml蒸馏水，然后轻微搅拌约1分钟并后续以约1，000rpm的速度离心分离5分钟，此后废弃上层清液。这一系列操作重复3次以进行洗涤。向所得微胶囊中加入1ml透明质酸钠(分子量1，800，000)的0.1%水溶液，然后轻微搅拌而得到分散体，最后再将其冻干16小时。
实施例3将4.0g乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，以mol%计，GPC重均分子量5，900，GPC数均分子量2，600，由WakoPureChemical生产)溶于5.3g(4ml)二氯甲烷。加入4g碳酸钙后，用旋涡混合器将溶液搅拌约30秒钟而得到s/o乳液。将该乳液倒入800ml已预先调为18℃的0.1%(w/w)聚乙烯醇(EG-40，由TheNipponSyntheticChemicalIndustry，Co.，Ltd.生产)水溶液中，然后在高速涡轮搅拌器中以6，000rpm搅拌而得到s/o/w乳液，此后于室温下搅拌5小时而使二氯甲烷挥发并使油相固化。再加入10ml1N盐酸以中和过量的碳酸钙。于约2，000rpm速度下离心分离(05PR-22Hitachi，Ltd.)后，将上层清液废弃。剩余物分散在蒸馏水中并进行离心分离。收集到的可生物降解基质再分散于少量蒸馏水中后，将分散液冻干而得到粉末(约2.0g)。
在玻璃试管中称量4mg(8×108IU)冻干α-干扰素并将其溶于2ml 10mM盐酸溶液中。向该溶液中加入50mg上述生物可降解的基质，然后于4℃下用Low-Profile Roller(由Life Science生产)旋转混合约1天。这样操作后，加入4ml蒸馏水，之后轻微搅拌约1分钟并后续在约1，000rpm转速下离心分离5分钟，此后将上层清液废弃。这一系列操作重复2次以进行洗涤。所得分散体冻干而得微胶囊(约48mg)。
为了测定所得微胶囊中的α-干扰素含量，用含10%乙腈的25%BlockAce溶液(SnowBrandMikeProductsCo.，Ltd.)(免疫试验封闭剂)对微胶囊进行萃取，然后进行EIA(酶免疫分析)。微胶囊中α-干扰素含量为5，700，000IU/mg微胶囊。
实施例4将4.0g乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，以mol%计，GPC重均分子量5，100，GPC数均分子量2，570，由WakoPureChemical生产)溶于5.3g(4ml)二氯甲烷。加入0.4g乙酸锌(二水合物)后，将溶液摇荡2小时并后续用均化器(Polytron)搅拌约30秒钟而得到s/o乳液。将该乳液倒入800mg已预先调为18℃的0.1%(w/w)聚乙烯醇(EG-40，由TheNipponSyntheticChemicalIndustry，Co.，Ltd.生产)水溶液中，然后在高速涡轮搅拌器中以6，000rpm搅拌而得到s/o/w乳液，此后于室温下搅拌5小时而使二氯甲烷挥发并使油相固化。于约2，000rpm速度下离心分离(05PR-22Hitachi，Ltd.)后，将上层清液废弃。剩余物分散在蒸馏水中并进行离心分离。收集到的可生物降解基质再分散于少量蒸馏水中后，将分散液冻干而得到粉末(约2.0g)。
在玻璃试管中称量6mg(约1.2×109IU)冻干α-干扰素并将其溶于3ml 0.5mM盐酸溶液中。向该溶液中加入300mg上述生物可降解的基质，然后于4℃下用Low-Profile Roller(由Life Science生产)旋转混合约1天。这样操作后，加入10ml 5%甘露糖醇水溶液，之后轻微搅拌约1分钟并后续在约2，000rpm转速下离心分离5分钟，此后仍将上层清液废弃。这一系列操作重复3次以进行洗涤。向所得微胶囊中加入30mg D-甘露糖醇和0.5ml蒸馏水，然后轻微搅拌而得到悬浮液，再冻干而得到微胶囊(约310mg)。
为了测定所得微胶囊中的α-干扰素含量，用含10%乙腈的25%BlockAce溶液(SnowBrandMikeProductsCo.，Ltd.)(免疫试验封闭剂)对微胶囊进行萃取，然后进行酶免疫分析(用干扰素抗体进行的夹层技术，以下简称EIA)。微胶囊中α-干扰素含量为2，300，000IU/mg微胶囊。
实施例5将4.0g乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，以mol%计，GPC重均分子量5，900，GPC数均分子量2，600，由WakoPureChemical生产)溶于5.3g(4ml)二氯甲烷。加入1ml含800mg乙酸锌(二水合物)的水溶液后，用均化器(Polytron)将溶液搅拌约30秒钟而得到w/o乳液。将该乳液倒入800ml已预先调为18℃的0.1%(w/w)聚乙烯醇(EG-40，由TheNipponSyntheticChemicalIndustry，Co.，Ltd.生产)水溶液中，然后在高速涡轮搅拌器中以6，000rpm搅拌而得到w/o/w乳液，此后于室温下搅拌5小时而使二氯甲烷挥发并使油相固化。于约2，000rpm速度下离心分离(05PR-22Hitachi，Ltd.)后，将上层清液废弃。剩余物分散在蒸馏水中并进行离心分离。收集到的可生物降解基质再分散于少量蒸馏水中后，将分散液冻干而得到粉末(约2.0g)。
在玻璃试管中称量6mg(约1.2×109IU)冻干α-干扰素并将其溶于3ml 0.5mM盐酸溶液中。向该溶液中加入300mg上述生物可降解的基质，然后于10℃下用Low-Profile Roller(由Life Science生产)旋转混合约1天。这样操作后，加入10ml 5%甘露糖醇水溶液，之后轻微搅拌约1小时并后续在约1，000rpm转速下离心分离5分钟，此后将上层清液废弃。这一系列操作重复2次以进行洗涤。将所得微胶囊冻干。
为了测定所得微胶囊中的α-干扰素含量，可用含10%乙腈的25%BlockAce溶液(SnowBrandMikeProductsCo.，Ltd.)(免疫试验封闭剂)对微胶囊进行萃取，然后进行EIA。微胶囊中α-干扰素含量为780，000IU/mg微胶囊。
实施例6将4.0g乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，以mol%计，GPC重均分子量5，900，GPC数均分子量2，600，由WakoPureChemical生产)溶于5.3g(4ml)二氯甲烷。加入0.4g乙酸钙(一水合物)后，用均化器(Polytron)将溶液搅拌约30秒钟而得到s/o乳液。将该乳液倒入800ml已预先调为18℃的0.1%(w/w)聚乙烯醇(EG-40，由TheNipponSyntheticChemicalIndustry，Co.，Ltd.生产)水溶液中，然后在高速涡轮搅拌器中以6，000rpm搅拌而得到s/o/w乳液，此后于室温下搅拌5小时而使二氯甲烷挥发并使油相固化。于约2，000rpm速度下离心分离(05PR-22Hitachi，Ltd.)后，将上层清液废弃。剩余物分散在蒸馏水中并进行离心分离。收集到的可生物降解基质再分散于少量蒸馏水中后，将分散液冻干而得到粉末(约2.0g)。
在玻璃试管中称量4mg(8×108IU)冻干α-干扰素并将其溶于2ml 1mM盐酸溶液中。向该溶液中加入50mg上述生物可降解的基质，然后于4℃下用Low-Profile Roller(由Life Science生产)旋转混合约1天。这样操作后，加入4ml蒸馏水，之后轻微搅拌约1分钟并后续在约1，000rpm转速下离心分离5分钟，此后将上层清液废弃。这一系列操作重复2次以进行洗涤。所得分散体冻干而得微胶囊(约48mg)。
为了测定所得微胶囊中的α-干扰素含量，可用含10%乙腈的25%BlockAce溶液(SnowBrandMikeProductsCo.，Ltd.)(免疫试验封闭剂)对微胶囊进行萃取，然后进行EIA。微胶囊中α-干扰素含量为9，400，000IU/mg微胶囊。
实施例7将4.0g乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，以mol%计，GPC重均分子量5，100，GPC数均分子量2，570，由WakoPureChemical生产)溶于5.3g(4ml)二氯甲烷。加入0.4g乙醇锌(二水合物)后，将溶液摇荡2小时并后续用均化器(Polytron)搅拌约30秒钟而得到s/o乳液。将该乳液倒入800ml已预先调为18℃的0.1%(w/w)聚乙烯醇(EG-40，由TheNipponSyntheticChemicalIndustry，Co.，Ltd.生产)水溶液中，然后在高速涡轮搅拌器中以6，000rpm搅拌而得到s/o/w乳液，此后于室温下搅拌5小时而使二氯甲烷挥发并使油相固化。于约2，000rpm速度下离心分离(05PR-22Hitachi，Ltd.)后，将上层清液废弃。剩余物分散在蒸馏水中并进行离心分离。收集到的可生物降解基质再分散于少量蒸馏水中后，将分散液冻干而得到粉末(约2.0g)。
在玻璃试管中称量50mg生物可降解基质。在加入已预先用盐酸或氢氧化钠调为适当pH(约为2，4，5和8这样4个pH值)的2mg/mlα-干扰素溶液(约4.0×108IU)后，混合物于4℃旋转混合24小时，以使α-干扰素渗入生物可降解基质。在约1，000rpm下进行离心分离并去除上层清液后，剩余物用4ml蒸馏水洗涤2次，然后加0.5ml蒸馏水并冻干。
实施例8将4.0g乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，以mol%计，GPC重均分子量5，900，GPC数均分子量2，600，由WakoPureChemical生产)溶于5.3g(4ml)二氯甲烷。加入0.4g乙酸钙(一水合物)后，用均化器(Polytron)将溶液搅拌约30秒钟而得到s/o乳液。将该乳液倒入800ml已预先调为18℃的0.1%(w/w)聚乙烯醇(EG-40，由TheNipponSyntheticChemicalIndustry，Co.，Ltd.生产)水溶液中，然后在高速涡轮搅拌器中以6，000rpm搅拌而得到s/o/w乳液，此后于室温下搅拌5小时而使二氯甲烷挥发并使油相固化。于约2，000rpm速度下离心分离(05PR-22Hitachi，Ltd.)后，将上层清液废弃。剩余物分散在蒸馏水中并进行离心分离。收集到的可生物降解基质再分散于少量蒸馏水中后，将分散液冻干而得到粉末(约4.0g)。
然后，按同于实施例7的方法，在不同pH值下让α-干扰素渗入可生物降解基质中并随后冻干。
实施例9将4.0g乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，以mol%计，GPC重均分子量5，100，GPC数均分子量2，570，由WakoPureChemical生产)溶于5.3g(4ml)二氯甲烷。加入0.2g乙酸钠(三水合物)后，将溶液摇荡2小时并后续用均化器(Polytron)搅拌约30秒钟而得到s/o乳液。将该乳液倒入800ml已预先调为18℃的0.1%(w/w)聚乙烯醇(EG-40，由TheNipponSyntheticChemicalIndustry，Co.，Ltd.生产)水溶液中，然后在高速涡轮搅拌器中以6，000rpm搅拌而得到s/o/w乳液，此后于室温下搅拌5小时而使二氯甲烷挥发并使油相固化。于约2，000rpm速度下离心分离(05PR-22Hitachi，Ltd.)后，将上层清液废弃。剩余物分散在蒸馏水中并进行离心分离。收集到的可生物降解基质再分散于少量蒸馏水中后，将分散液冻干而得到粉末(约2.0g)。
然后，按同于实施例7的方法，在不同pH值下让α-干扰素渗入生物可降解基质中并随后冻干。
实施例10将4.0g乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，以mol%计，GPC重均分子量5，100，GPC数均分子量2，570，由WakoPureChemical生产)溶于5.3g(4ml)二氯甲烷。加入0.4g乙酸锌(二水合物)后，将溶液摇荡2小时并后续用均化器(Polytron)搅拌约30秒钟而得到s/o乳液。将该乳液倒入800ml已预先调为18℃的0.1%(w/w)聚乙烯醇(EG-40，由TheNipponSyntheticChemicalIndustry，Co.，Ltd.生产)水溶液中，然后在高速涡轮搅拌器中以6，000rpm搅拌而得到s/o/w乳液，此后于室温下搅拌5小时而使二氯甲烷挥发并使油相固化。于约2，000rpm速度下离心分离(05PR-22Hitachi，Ltd.)后，将上层清液废弃。剩余物分散在蒸馏水中并进行离心分离。收集到的可生物降解基质再分散于少量蒸馏水中后，将分散液冻干而得到粉末(约2.0g)。
用玻璃试管取出2ml含白介素2(20μg)的水溶液。加入300mg上述生物可降解的基质后，混合物于4℃下用Low-ProfileRoller(由LifeScience生产)旋转混合约5小时。白介素2按日本未审查专利申请公开No.78799/1986所述方法得到并按日本未审查专利申请公开No.115528/1985所述方法提纯。这种白介素2为N端连有甲硫氨酸的白介素和N端未连甲硫氨酸的白介素的混合物。这样操作后，加入10ml5%甘露糖醇的水溶液，之后轻微搅拌约1分钟并后续在约2，000rpm转速下离心分离5分钟，此后将上层清液废弃。这一系列操作重复3次以进行洗涤。向所得微胶囊中加入30mgD-甘露糖醇，再将混合物溶于0.5ml蒸馏水中，然后轻微搅拌。所得悬浮液冻干。
实施例11将5.0g乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，以mol%计，GPC重均分子量5，800，GPC数均分子量2，805，由WakoPureChemical生产)和782mg苯甲酸锌加入6.625g(5ml)二氯甲烷中，混合物于室温下摇荡3小时而得到s/o乳液。将该乳液倒入1000ml已预先调为18℃的0.1%(w/w)聚乙烯醇(EG-40，由TheNipponSyntheticChemicalIndustry，Co.，Ltd.生产)水溶液中，在此之后在高速涡轮搅拌器中以6，000rpm搅拌而得到s/o/w乳液，此后于室温下搅拌5小时而使二氯甲烷挥发并使油相固化。于约2，000rpm速度下离心分离(05PR-22Hitachi，Ltd.)后，将上层清液废弃。剩余物分散在蒸馏水中并进行离心分离。收集到的可生物降解基质再分散于少量蒸馏水中后，将分散液冻干而得到粉末(约2.0g)。
在玻璃试管中称量2mg(约1.7×108IU)冻干α-干扰素并将其溶于3ml 0.5mM盐酸溶液中。向该溶液中加入302mg上述生物可降解的基质，然后于15℃下用Low-Profile Roller(由Life Science生产)旋转混合约5小时。这样操作后，加入10ml 5%甘露糖醇水溶液，之后轻微搅拌约1分钟并后续在约2，000rpm转速下离心分离5分钟，此后将上层清液废弃。这一系列操作重复3次以进行洗涤。所得微胶囊中加入30mg D-甘露糖醇和0.5ml蒸馏水，然后轻微搅拌而得到悬浮液，再冻干而得到微胶囊(约310mg)。
为了测定所得微胶囊中的α-干扰素含量，用含10%乙腈的25%BlockAce溶液(SnowBrandMikeProductsCo.，Ltd.)(免疫试验封闭剂)对微胶囊进行萃取，然后进行EIA。微胶囊中α-干扰素含量为3，610，000IU/mg微胶囊。
实施例12按基本上同于实施例11的方法得到粉状乳酸-乙醇酸共聚物基质，只是用995mg水杨酸锌代替苯甲酸锌。微胶囊也按同于实施例11的方法得到，只是应用304mg基质。
微胶囊中α-干扰素含量为1，930，000IU/mg微胶囊。
比较例1将2mg冻干粉状α-干扰素溶于2ml含0.5%牛白蛋白的磷酸盐缓冲盐水中(EIA测定其浓度为175，000，000IU/ml)。
比较例2将4.0g乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，以mol%计，GPC重均分子量5，900，GPC数均分子量2，600，由WakoPureChemical生产)溶于5.3g(4ml)二氯甲烷。加入0.5ml浓度已预先调为2g/ml的氯化锌水溶液后，用均化器(Polytron)将溶液搅拌约30秒钟而得到w/o乳液。将该乳液倒入800ml已预先调为18℃的0.1%(w/w)聚乙烯醇(EG-40，由TheNipponSyntheticChemicalIndustry，Co.，Ltd.生产)水溶液中，然后在高速涡轮搅拌器中以6，000rpm搅拌而得到w/o/w乳液，此后于室温下搅拌5小时而使二氯甲烷挥发并使油相固化。于约2，000rpm速度下离心分离(05PR-22Hitachi，Ltd.)后，将上层清液废弃。剩余物分散在蒸馏水中并进行离心分离。收集到的可生物降解基质再分散于少量蒸馏水中后，将分散液冻干而得到粉末(约2.0g)。
然后，按同于实施例7的方法，在不同pH值下让α-干扰素渗入生物可降解基质中并随后冻干。
比较例3将4.0g乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，以mol%计，GPC重均分子量5，900，GPC数均分子量2，600，由WakoPureChemical生产)溶于5.3g(4ml)二氯甲烷。加入0.2g碳酸锌后，用旋涡混合器将溶液搅拌约30秒钟而得到s/o乳液。将该乳液倒入800ml已预先调为18℃的0.1%(w/w)聚乙烯醇(EG-40，由TheNipponSyntheticChemicalIndustry，Co.，Ltd.生产)水溶液中，然后在高速涡轮搅拌器中以6，000rpm搅拌而得到s/o/w乳液，此后于室温下搅拌5小时而使二氯甲烷挥发并使油相固化。于约2，000rpm速度下离心分离(05PR-22Hitachi，Ltd.)后，将上层清液废弃。剩余物分散在蒸馏水中并进行离心分离。收集到的可生物降解基质再分散于少量蒸馏水中后，将分散液冻干而得到粉末(约2.0g)。
然后，按同于实施例7的方法，在不同pH值下让α-干扰素渗入生物可降解基质中并随后冻干。
试验例1将约40mg实施例1得到的微胶囊分散在0.5ml分散剂(含2.5mg羧甲基纤维素、0.5mg多乙氧基醚和25mg甘露糖醇的蒸馏水，其中三种物质均溶解)中而得到注射制剂，然后在8周龄雄性SD大鼠的背上用22号针头皮下注射(微胶囊剂量133mg/kg)。注射后，以恒定间隔从尾部采血并按酶免疫分析法(EIA)测定血清中的α-干扰素浓度。结果表明，1星期内，血中浓度几乎保持不变。
试验例2按同于试验例1的方法给大鼠注射实施例2得到的约30mg微胶囊，并按酶免疫分析法(EIA)测定血清中α-干扰素浓度。结果表明，1星期内，血中浓度几乎保持不变。
试验例3将约22mg实施例4得到的微胶囊和约64mg实施例5得到的微胶囊分别分散在0.5ml分散剂(5g羧甲基纤维素、2g多乙氧基醚(表面活性剂)和25g甘露糖醇，全部溶于1l蒸馏水)中而得到注射制剂，然后在8周龄雄性SD大鼠的背上用18号针头进行皮下注射(α-干扰素用量为约50，000，000IU/大鼠)。注射后，以恒定间隔从尾部取血并按EIA测定血清中α-干扰素浓度。作为对比，给大鼠皮下注射比较例1得到的α-干扰素水溶液(α-干扰素用量约为50，000，000IU/大鼠)。在注射比较例1的微胶囊的试验组中，血清中干扰素浓度到注射后第3天就已下降到检测极限。在注射实施例4或5的微胶囊的试验组中，血中最初的高浓度之后，浓度在1星期内几乎保持不变。
试验例4α-干扰素溶液pH和各种锌盐对α-干扰素向生物可降解基质中的渗透效率(微胶囊中干扰素含量)的影响按以下所述检验。
实施例7(乙酸锌)、比较例2(氯化锌)和比较例3(碳酸锌)所得微胶囊分别用含10%乙腈的25%BlockAce溶液萃取后进行EIA以确定α-干扰素含量。如
图1所示，在用乙酸锌时，在α-干扰素处于相对物理稳定状态的pH条件下α-干扰素渗透效率高。
试验例5
α-干扰素溶液pH和乙酸钙盐对α-干扰素向生物可降解基质中的渗透效率(微胶囊中干扰素含量)的影响按同于试验例3的方法检验。如图2所示，在α-干扰素处于相对物理稳定状态的pH条件下α-干扰素渗透效率高。
根据本发明生产方法，可使水溶性多肽渗入生物可降解基质中，同时又不会让水溶性多肽与有机溶剂接触，并且可在不影响水溶性多肽的生物活性的情况下将水溶性多肽制成药物制剂。此外，应用脂族羧酸的金属盐可有效地使水溶性多肽渗入生物可降解基质中。本发明缓释制剂用于注射时可在几天至1个月(如约1-2星期)内显示出优异的缓释效果。
图1示出了干扰素溶液pH和各种锌盐与微胶囊中干扰素含量之间的关系，其中●代表乙酸锌(实施例7)，○代表氯化锌(比较例2)，而△代表碳酸锌(比较例3)。
图2示出了干扰素溶液pH和乙酸钙(实施例5)与微胶囊中干扰素含量之间的关系。
权利要求
1.一种制备缓释制剂的方法，该方法包括在水性溶液中使水溶性多肽渗透到生物可降解的基质中。
2.根据权利要求1的方法，其中生物可降解的基质是通过将生物可降解的聚合物和脂族羧酸的水溶性金属盐混合制备的。
3.根据权利要求2的方法，其中脂族羧酸是脂族单羧酸。
4.根据权利要求2的方法，其中水溶液金属盐是多价金属盐。
5.根据权利要求1的方法，包括在水溶性多肽已水性渗透到生物可降解的基质中后干燥所述生物可降解的基质的步骤。
6.根据权利要求5的方法，其中干燥步骤是冷冻干燥。
7.根据权利要求1的方法，其中水溶性多肽是细胞素。
8.根据权利要求7的方法，其中细胞素是干扰素。
9.根据权利要求1的方法，其中生物可降解的基质呈细颗粒形式。
10.根据权利要求1的方法，其中生物可降解的基质是由生物可降解的聚合物制备的。
11.根据权利要求10的方法，其中生物可降解的聚合物是脂族聚酯。
12.根据权利要求11的方法，其中脂族聚酯是由α-羟基羧酸衍生的共聚物。
13.根据权利要求12的方法，其中共聚物是乳酸-乙醇酸共聚物。
14.一种缓释制剂，它是通过使水溶性多肽渗透到生物可降解的基质中产生的。
15.一种缓释制剂，它是通过将生物可降解的聚合物和脂族羧酸的水溶性金属盐混合，然后使水溶性多肽渗透到所得生物可降解的基质中产生的。
16.根据权利要求14的缓释制剂，其中制剂是供注射用的。
全文摘要
一种缓释制剂的制备方法，包括在水溶液中使水溶性多肽渗透到生物可降解的基质中。按本发明制备方法使水溶性多肽渗透到生物可降解的基质中时无需使水溶性多肽与有机溶剂接触。因此，制备水溶性多肽时不会影响该水溶性多肽的生物活性，这就使该水溶性多肽可有效地用作药物。
文档编号A61K9/16GK1106653SQ9410832
公开日1995年8月16日 申请日期1994年7月5日 优先权日1993年7月5日
发明者猪狩康孝, 山本一路, 冈本加世子, 山县丰 申请人:武田药品工业株式会社