专利名称：用作抗肿瘤药剂的酰基富烯类似物的制作方法
本课题得到国家卫生研究院科研补助金CA-37641的部分支持。美国政府拥有发明权。
发明的
背景技术：
多种药物的化学治疗法对某些血液癌和早期的迅速增生的固体肿瘤有治疗作用。有疗效的化学治疗法得益于发现了新的，相对非交叉抗药的药物和更有效地使用现有的药物。增加常规药物的效能的手段包括更有效的多种药物的给药方式、最少的药物毒性和增加使用辅药、外科手术或放射治疗。
尽管近年有了改善，但许多类型癌症的患者仍存在着很大的复发和死亡的危险。在复发后，某些患者可通过原先的治疗方法而获得缓解。然而，通常需要高于原先化学治疗药物的剂量或使用附加的药物，这表明至少部分地产生了抗药性。近年来证据表明抗药性可同时扩展至若干药物，包括患者并未使用过的药物。多种药物抗药性(mdr)肿瘤的形成也许是肿瘤物质的机能，并成为治疗失败的主要原因。为克服这种抗药性，采用高剂量的化学治疗，同时采用或不用放射治疗和同种异基因的或自体固有的骨髓移植。高剂量的化学治疗可使用原来的药物或包括附加的药物。这种方法的可行性已被证明用于造血的或固体的肿瘤。需要开发有mdr表型非交叉抗药性的新药物以促进现有方法的治疗作用及促进先有治疗过的患者的治疗手段。
近年来，Kelner M.等人在Cancer Res.473186(1987)(列为本文参考文献)中研究了称之为隐杯伞素的新一类天然产物的体外抗肿瘤活性。隐杯伞素S和M是已知存在的两种隐杯伞素。隐杯伞素具有完全不同于其他化学治疗药物的化学结构。首先提纯隐杯伞素化合物，将其提交National Cancer Ins titute Division of CancerTreatment(NCT DCT)进行体内药物筛选评价，根据NCI的研究，其对其他试验的肿瘤系统有低的治疗指数。隐杯伞素的过高毒性妨碍了它在人体肿瘤治疗中的任何应用。
因此，需要化学治疗药物，其对肿瘤，尤其是mdr肿瘤是毒性的，并对体内治疗有足够有效的治疗指数。本发明满足了这种需要并具有相关的优点。
发明概述本发明提供了一种抑制受治疗者肿瘤细胞生长的方法，其包括使用治疗量的有如下结构的隐杯伞素S或隐杯伞素M类似物与肿瘤接触 或 其中类似物能够抑制肿瘤细胞生长，而对受治疗者没有过高毒性，并且其中R1是烷基或氢；R2是烷基；和R3是醇或酯。
附图的简要说明附
图1表示与其他肿瘤相比乳腺癌和骨髓白血病细胞对隐杯伞素S的敏感性。
附图2表示隐杯伞素S的活性部位。
附图3表示NMR谱，其说明在酸中存在短时作用的中间体。信号A来自五元环(隐杯伞素M)中双健上的氢，信号B来自由环丙烷环打开(但在双键反应之前)产生的短时存在的中间体上的氢，C标记的几个信号来自双键反应后产生的产物。此时，来自隐杯伞素M的信号峰消失，和位置C的峰是主要的信号。信号B与信号A同时消失表明它是由隐杯伞素M产生的短时间存在的中间体。
附图4表示隐杯伞素S对无胸腺小鼠(Balb/C)的Molt-4肿瘤生长的作用。
附图5表示脱氢隐杯伞素M对肿瘤生长的作用。
附图6表示HL60/MRI异种移植对脱氢隐杯伞素M的应答。
附图7表示使用相对敏感的HL60细胞和抗药性B细胞的隐杯伞素S的摄入。
附图8表示被HL60细胞在细胞内快速累积的隐杯伞素S在高浓度下饱和。
附图9表示在各种浓度下对被HL60细胞最初摄入的隐杯伞素S的分析符合Michaelis-Menton饱和常数。
附图10表示6-羟基甲基酰基富烯和其他常规抗癌药剂对人体肺腺癌MV522的作用。
附图11表示不同剂量的6-羟基甲基酰基富烯对人体肺腺癌MV522的作用。
发明的详细说明本发明提供了一种抑制受治疗者的肿瘤细胞生长的方法，其包括使用治疗量的具有如下结构的隐杯伞素S或隐杯伞素M类似物与肿瘤接触 其中类似物能够抑制肿瘤细胞生长，而对受治疗者没有过高的毒性，并且其中R1是烷基或氢；R2是烷基；和R3是醇或酯。
该类似物可以是有所述结构的任何化合物。有效类似物的实例为 本发明还提供了一种抑制受治疗者的肿瘤细胞生长的方法，其包括使治疗量的具有如下结构的隐杯伞素S或隐杯伞素M类似物与肿瘤接触 其中类似物能够抑制肿瘤细胞生长，而对受治疗者没有过高的毒性，并且其中R1是烷基、烷氧基或氢；R2是烷基；和R3是醇或酯。
类似物可以是具有所述结构的任何化合物。有效类似的两个实例为 类似物也可以是具有如下结构的酰基富烯类似物 其中R是 (其中R1＝烷基，芳基，NH2，NHR，或NR2)
“抑制”指的是或者与未进行治疗的速率相比降低了肿瘤细胞生长速率，或者导致肿瘤细胞块减少了尺寸。抑制还包括肿瘤的完全消退。因此，类似物对肿瘤细胞可以是细胞生长繁殖抑制的或有细胞毒素作用的。
受治疗者可以是有肿瘤的任何动物。类似物对体内人体肿瘤以及体外人体肿瘤细胞系是有效的。
肿瘤可与类似物以任何有效的方式接触，其中许多是现有技术中已知的。向受治疗者给药的有效途径可以包括静脉内的、口腔、腹膜内的和口腔和鼻内吸入。优选的给药途径取决于受治疗者和所治疗的肿瘤的类型。
申请人惊奇地发现隐杯伞素S和M的类似物与隐杯伞素S和M相比有较小的毒性，但是更有效的体内化学治疗剂。如上所述，隐杯伞素S和M由于其过高的毒性具有低的治疗指数，因而不能用于人体治疗。申请人发现隐杯伞素S和M的各种改性产物抑制亲核试剂与化合物反应。这导致环丙烷环不易打开，降低了化合物的体内毒性，而产生高的治疗指数。申请人进一步发现，酰基富烯类似物，6-羟基甲基酰基富烯，比上述已知的S和M隐杯伞素类似物明显地更有效和无毒性。
不影响隐杯伞素或其类似物的活性官能基团的上述定义范围的各种R基团可以是各种各样的取代基。申请人想要将上述各种R基团广泛地认作，例如，烷基包括任何连接于烷基的官能团(即，烷基富烯或官能团本身)。R基团包括硝基、卤素、烷基卤化物、醇、过氧化物、内过氧化物、伯、仲或叔胺、醚、酯、巯基、硫代烷基、硫酯、二硫代酯、二硫化物、羧酸、烯胺、亚胺或肟基。
类似物的治疗有效量随受治疗者变化。然而，我们发现，与隐杯伞素S和M相比由于降低了毒性，类似物可以相对高的剂量给药。对于静脉内给药，发现每公斤体重30～112,000μg的治疗量是尤其有效的，而对于腹膜内给药，每公斤体重300～112000μg是有效的。作为本领域熟练技术人员应理解，治疗量可根据给药方法变化。此外，如果类似物连接于毒素，治疗量将变化。
类似物可连接于试剂以形成配合物，其结合于联结肿瘤的抗原。该方法是现有技术中已知的，其可包括一个用于连接试剂至类似物的衔接物。这种连接可包括任何化学键，例如共价健。试剂可以是特定地结合肿瘤细胞表面或肿瘤细胞区域内的联结肿瘤的抗原的任何试剂。通常该试剂是一种抗体，多克隆抗体或单克隆抗体。这些配合物随后能用于治疗中。本发明的方法可用于任何肿瘤细胞，但对骨髓、表皮样瘤、T细胞白血病和肺、卵巢和乳腺癌的肿瘤细胞尤其有效。
本发明还公开了有如下结构的化合物 其中R＝甲基；和R1、R2和R3＝甲基或烷基。
还公开了有如下结构的化合物 其中R＝H或甲基；和R1、R2和R3＝甲基或烷基。
实施例I脱氢隐杯伞素M的合成将隐杯伞素M(200mg)和重铬酸吡啶鎓盐(1g)在无水二氯甲烷(60ml)中的混合物在室温下在烧瓶中搅拌，烧瓶配有橡胶隔膜，以便可维持氩气气氛。在20小时后，反应混合物用乙醚(20ml)稀释，通过硅胶短柱过滤。柱进一步用更多的乙醚洗脱，将合并的滤液浓缩，得到的残余物用硅胶色谱法分离，用己烷-乙酸乙酯(10∶1)作洗脱液。从色谱的最初馏份中得到所需化合物。产率为140mg白色结晶体，熔点64-65℃。记录该化合物的NMR谱数据。
实施例II富烯的合成将隐杯伞素S(50mg)溶解于水(2mL)中，向溶液中加入3N盐酸(2mL)。所生成的溶液不久变成混浊(30分钟内)，形成黄色的沉淀。将混合物在电冰箱中放置过夜；随后用氯仿(10mL)萃取。将黄色的氯仿溶液干燥(MgSO4)，减压除去溶剂，得到桔黄色胶状体。该物质用硅胶色谱分离，用己烷∶乙酸乙酯(6∶1)作洗脱液，得到富烯(20mg)和二富烯(10mg)。记录该化合物的NMR谱数据。
此外，富烯的全合成方法也可以用如下方法得到 所示的已知的1，1-二乙酰基环丙烷与环戊二烯衍生物的二阴离子反应得到二醇，其在弱酸性下处理得到二醇酮。选择性地除去叔羟基得到所需的富烯。
实施例III体外研究为测试细胞毒性效果，将各种浓度的隐杯伞素加入细胞培养物中，48小时后，通过维虫兰排除法测定细胞生长/生存性。作为48小时连续暴露研究的可替代方法，将细胞放置在96孔平板中的液体培养物中，暴露于各种浓度的隐杯伞素2小时，用[3H]-胸苷脉冲1～2小时，在玻璃过滤器上采集。将滤纸加入含有闪烁液体的小瓶中，在β(闪烁)计数器中测定残留放射性。
在筛选其他固体肿瘤细胞系对隐杯伞素S的敏感性时，乳腺细胞MCF-7被注意到是明显敏感的(图1)。发现在我们实验室保存的另一乳腺细胞系MDA-231对隐杯伞素S也明显敏感(附图1)。
用脱氢隐杯伞素M研究表明该类似物对骨髓白血病细胞和乳腺癌系MCF-7和MDA-231显示出选择性毒性(表1)表1在暴露于毒素2小时后(N-3)通过抑制胸苷验证的隐杯伞素S和脱氢隐杯伞素M的组织特异细胞毒性IC50(nM/L)化合物隐杯伞素S脱氢隐杯伞素MHL60，骨髓 7±1 246±198392，B-细胞236±31 ＞38,0008402，T-细胞669±196 ＞38,000242，黑瘤 607±70 ＞38,000547，卵巢 607±110 ＞38,000SL-2，鼠(胸腺) 142±15 5,235±277MCF-7，乳腺 58±5 653±65MDA-231，乳腺 2.0±0.2 112±17由于预先的研究表明，CEM mdr变异体对隐杯伞素S无抗药性，因此，研究了若干其他mdr细胞类型对隐杯伞素S和脱氢隐杯伞素M的敏感性。这些mdr子细胞系显示出对多种常规药物化学治疗药物的抗药性增加了200至800倍，但对隐杯伞素S或脱氢隐杯伞素M显示出很小的或没有抗药性(表2)。因此，联结或未联结gp170蛋白质的mdr细胞对隐杯伞素毒性仍是敏感的。这些研究表明，隐杯伞素的新的结构具有在多种药物抗药性的造血细胞系中相对非交叉的抗药性。隐杯伞素、脱氢隐杯伞素M的衍生物比原来的隐杯伞素化合物毒性略低，但结果(表2)表明，在各种mdr细胞系中对该化合物没有交叉抗药性。
研究隐杯伞素S和脱氢隐杯伞素M对L1210、鼠骨髓CFU-gm和C1498(AML细胞系)的效果。隐杯伞素S是试验中试验过的化合物中最有效的药物，在L1210和AML白血病系之间和CFU-gm区域位点之间显示最大的差别效果(表3)。衍生物，脱氢隐杯伞素M，虽然毒性较低，但对AML系明显地更有选择性。其在对CFU-gm细胞没有作用的浓度下抑制了AML菌落形成(表4)。
表2不同Mdr系对隐杯伞素S的敏感性可得到的MDR 细胞系隐杯伞素S脱氢隐杯伞素MCEM变异体 母体 8.3±2.6ntVM-1 16.2±6.4 ntAraC 14 ntVLB100(gp170+) 3.7±0.7ntDox(gp170+) 14MDA-231(乳腺) 母体 0.85±0.23 54±73-1(gp170+) 0.89±0.38 58±11MCF7-wt(乳腺) 母体 0.88±0.11 92±15ADR(GSH- 3.7±0.468±15转移酶)HL-60 母体 3.1±1.1163±11ADR(gp150+) 1.9±0.8191±44KB变异体 母体 0.58±0.12 125±14C-1(gp170+) 0.69±0.15 80±18VBL(gp170+) 0.69±0.11 78±19L1210 母体 0.42±0.08 62±8DDPt(顺氯氨铂) 0.46±0.12 119±39BCNU 0.58±0.08 100±31PAM(苯丙氨酸氮芥)0.62±0.15 73±31CPA(环磷酰胺)0.46±0.12 38±15
表3隐杯伞素S对生长的抑制隐杯伞素S浓度抑制区域(ug/盘)L1210Go结肠382.50500240301.2540070 00.6332030 0表4隐杯伞素对菌落形成的作用区域大小化合物稀释度L1210CFU-GMC1498(AML)隐杯伞素S 1/1,000850400 ＞10001/4,000600200 8001/16,000 55005501/64,000 3000250脱氢隐杯伞素M 1/25 400200 ＞10001/125 200100 7501/125(重复)30050 7001/625 1000400
实施例IV结构功能研究用合成的隐杯伞素衍生物进行结构功能研究，检查其对于HL60白血病细胞的体外毒性(表5)。该研究确定了对于隐杯伞素毒性来说三个关键的位置。这些包括环丙烷环(位置A)、α/β不饱和键位置(位置B)和酮基(位置C)(附图2)。这些位置中任一的替换会导致毒性多达4log的下降。与之相反，非环伯羟基(附图2，位置D)对毒性不起作用。各种大的化学基因可接连于该位置而不会改变毒性。许多明显降低毒性(与隐杯伞素S或M相比较)的衍生物比起常规的化学治疗药物如BCNU或顺氯氨铂更有效(表5)。
表5与在HL-60细胞中其他药物相比各种隐杯伞素衍生物的IC50化合物 nM隐杯伞素S或M 10二氢隐杯伞素S或M 100,000酰基富烯 500脱氢隐杯伞素M(二酮) 246异隐杯伞素M 3,800Ptaquiloside 7,000蕨素C12,5002，5，6，7-四甲基茚酮475隐杯伞素甲苯磺酸酯 38DNA聚合酶抑制剂Aphidocolin 2,100烷基化剂BCNU 23,300交联剂顺氯氨铂 550±14烷基化剂MNNG 15,000蛋白质合成抑制剂蓖麻蛋白 0.2
实施例V结构功能研究化学隐杯伞素M易转化为稳定的芳族化合物(用稀HCl处理)，其在细胞培养研究中是超过1000倍的低的毒性。氯-碳键的形成、环丙烷环打开和叔羟基的除去(例如水)是同步的。形成的中间体可通过反应混合物NMR谱检测到(附图3)。然而，该中间体是十分活泼的，通过与第二个亲核试剂即水，反应迅速转化为苯酚。于是，在酸性条件下，隐杯伞素M显然是双官能的。
上述研究表明，隐杯伞素类的毒性与其叔羟基易于被除去和环丙烷环易于打开有关。我们发现，隐杯伞素的毒性取决于环丙烷基(位置A，附图2)、两个双键(共轭二烯)(位置B)和酮(位置C)的结合的效果。假设在五元环中仲羟基氧化成酮通过分子内的进一步的电子离域作用会改变分子的效力或选择性。新的酮基起到“电子槽”的作用，以致环丙烷C-C键的电子向酮离域，而不是向着带有叔羟基的碳原子离域。这意味着，由于碳-氧(叔羟基的氧)键断裂形成的最初的碳阳离子不如隐杯伞素M的情况下稳定。因此，碳-氧键断裂是不够有利的，反应活性被降低。称之为脱氢隐杯伞素M的酮衍生物被合成，其比隐杯伞素S或M对体外HL-60细胞是较低毒性的(表4)。如上文讨论的，脱氢隐杯伞素M的毒性呈现出对体外骨髓和乳腺癌细胞的相对选择性(附图1和表1)。
隐杯伞素M和脱氢隐杯伞素M与稀HCl的反应动力学结果是与上述假设相一致的。在稀HCl中，隐杯伞素M进行假设的一级反应(k＝4.7×10-3分-1，t1/2＝148分钟)。脱氢隐杯伞素M也证实了一级反应动力学，但该反应相当缓慢(k＝2×10-4分-1，t1/2＝2765分钟)。在与脱氢隐杯伞素M的反应中，通过NMR谱未检测到中间体。大概它形成太慢，并且存在时间太短难以检测到。由脱氢隐杯伞素M显示出的较低反应性，我们认为它在与亲核试剂反应中是更有选择性的，因此，与隐杯伞素M相比具有较低的毒性。
我们还研究了隐杯伞素与天然存在的亲核试剂，谷胱甘肽的反应。在pH3至pH9的宽pH范围中，谷胱甘肽自发地与隐杯伞素M、隐杯伞素S或脱氢隐杯伞素M反应，产生的产物类似于隐杯伞素M和HCl的反应产物。反应速率在pH 6.1～7.0最佳，表明反应可在细胞内进行。
随后研究隐杯伞素对乳腺细胞癌系MCF7-wt和它的MDR抗药性子系MCF-Adr的毒性。gp170负子细胞系在谷酰甘肽转移酶增加50倍的基础上是抗药性的，其导致对常规化学治疗药物的敏感性降低200～800倍，该系还显示谷胱甘肽含量降低了4.1倍。与用其他药物可见到的200～800倍相比，该子系显示对隐杯伞素S的敏感性降低4.2倍(母体IC500.88nmol/l；子系3.70nmol/l)。对隐杯伞素抑制谷胱甘肽转移酶的能力的动力学研究表明，不存在酶活性的直接抑制。这些研究结果表明，尽管隐杯伞素毒性与分子内谷酰甘肽含量成反比，但它与谷胱甘肽转移酶活性无关。
实施例VI动物研究使用Leonard，J.E.等人在Cancer Res.472899-02(1987)和Dillman，R.O.等人在Cancer Res.455632-36(1985)(均列为本文的参考文献)中所述的方法，在四周龄的无胸腺Balb/C的nu/nu小鼠中建立Molt-4(人T细胞白血病)异种移植。经3周总体剂量辐射(600 cGy)后，在小鼠腹边皮皮下注射Molt-4细胞和放射的(6000 cGy)HT-1080喂养细胞。两只动物仅接受放射的HT-1080喂养细胞以确保这些细胞不会诱导肿瘤。监测动物的Molt-4肿瘤发育，在肿瘤摸得出时(在5-7天约4×4mm)，如上所述小鼠随机分成5只一组。对照的小鼠在腹膜内接受盐水，治疗的小鼠则腹膜内接受300μg/kg隐杯伞素S、或30或300μg/kg脱氢隐杯伞素M，每周两次。在得到隐杯伞素S的小鼠中，肿瘤生长延缓(图4)。
与之相反，在以30μg/kg的低剂量接受脱氢隐杯伞素M(该化合物后来被发现以60000μg/kg每周腹膜内给药两次时对小鼠是无毒性的)的裸鼠中，5只中的3只肿瘤完全消退，但另2只肿瘤没有起反应(附图5)。采集两个明显抗药性的肿瘤，进行对隐杯伞素S和脱氢隐杯伞素M的抗药性的体外试验。没有对两种化合物有抗药性的迹象。两个完全应答者在随后12周的时间内没有肿瘤消退的迹象。
使用不同来源的无胸腺裸鼠，重复这些实验。在这些研究中，隐杯伞素对肿瘤生长几乎没有作用。其原因是，对Molt-4异种移植应答的变异性的原因可能与脱氢隐杯伞素M的低剂量、动物之间对谷胱甘肽代谢的变异或药物分布有关。
脱氢隐杯伞素M的效率随后在使用鼠SL-2细胞的同基因模型中筛选。将SL-2白血病/淋巴瘤细胞皮下注射，使之转移到淋巴结、脾脏和肺，在该模型中药物效率用增加寿命(ILS)测定。SL-2细胞以每动物2.5百万细胞给药，处理持续7天直到肿瘤可摸得出。这是一种对已建立的肿瘤的相对严格试验，并与在SL-2模型中的常规药物筛选作对比，在常规药物筛选中，通常使用0.5百万的细胞，从3天起开始药物处理，脱氢隐杯伞素M在以30mg/kg每周腹膜内给药两次，几乎没有效果，ILS为5％，在以60mg/kg每周腹膜内给药两次，ILS为18％。如以0.03mg/kg每周静脉内给药两次，ILS增加至38％。这说明，该药物由肝脏代谢，在静脉给药时更有效。
在体内实验进行过程中，体外实验结果已经得出隐杯伞素的组织特异性取决于活性能量依赖泵的存在，研究SL-2和Molt-4细胞，确定其不存在摄入机制。因而，研究转向用于骨髓谱系细胞的异种移植模型。
由Theodore Brightman博士的实验室(NCT)得到在裸鼠中无需动物照射能够作为异种移植生长的人HL-60细胞。这些细胞称之为HL-60MRI细胞，被证实具有能量依赖摄入泵，由于其母体细具有这种泵该发现并非出人意料。在脱氢隐杯伞素M以一周两次腹膜内给药时，诱发与剂量有关的肿瘤抑制(附图6)。在这些研究中，脱氢隐杯伞素M的MTD腹膜内剂量达到每周腹膜内剂量表的2剂量。对静脉内给药脱氢隐杯伞素M已观察到类似的肿瘤消退。
在共同研究中，再次研究脱氢隐杯伞素M的体内作用。最初研究化合物对L 1210细胞的作用。每天腹膜内给药剂量2.5mg/kg持续5天，导致仅9％ ILS。随后脱氢隐杯伞素M以24小时静注(5.0mg/kg)给药，ILS为11％。在我们开始认识在人骨髓瘤细胞中存在依赖于能量的摄入后，就脱氢隐杯伞素M对于同基因小鼠AML模型的体内效率进行筛选，使用C 1498细胞和单次大剂量隐杯伞素S，腹膜内给药2.5mg/kg，得到ILS 35％。使用同样剂量的二次试验，每天腹膜内给药一次，持续5天，得到ILS 44％。当动物能忍受每周两次60mg/kg(腹膜内)或1mg/kg(静脉内)(尾静脉)给药，持续4周而没有明显的失重和食物/水摄入的下降，可以进一步优化剂量和治疗程序。
实施例VII用酰基富烯和脱氢隐杯伞素M的HL60/MRI小鼠实验在三十只小鼠在肩部皮下注射500,000HL 60/MRI细胞(人骨髓白血病肿瘤细胞)。在第11天开始治疗，而不是马上进行治疗。开始治疗的延迟是严格试验，以确定化合物是否有效。通过延迟治疗，肿瘤细胞被牢固地建立。
将小鼠分成6组，5只一组。一组是对照组，这些动物接受空白对照剂，该溶液用于稀释试剂。其他组接受如下化合物和剂量脱氢隐杯伞素M化合物，1.0mg/kg；脱氢隐杯伞素M，3.0mg/kg；酰基富烯，0.3mg/kg；酰基富烯，1.0mg/kg；酰基富烯，3.0mg/kg。所有动物用尾静脉静脉注射空白对照剂或药物。空白对照剂或药物一周给药两次。
结果概括于附表6。脱氢隐杯伞素M和酰基富烯化合物对抑制肿瘤生长都是有效的，并显示出依赖于剂量的抑制(给药的药物愈多，肿瘤生长愈少)。接受最高量的每一种药物的动物未显示任何有害效果的迹象，如食物或水摄入下降，或统计学上体重明显降低。这些结果表明，每一种药物可以较高的剂量给药，此外，还表明药物可以更有效的剂量程序例如每日给药。
表6概括HL60/MRI 实验， 静脉 -#1总肿瘤重量[Mg]第11天第18天第25天第32天第40天对照组无药物99±3 6845±2823299±108010162±4123 16747±5061脱氢隐杯伞素M1mg/kg114±55883±3112274±992 6025±1772 11507±3707IV3mg/kg101±40911±3092127±10922854±1260 4784±2303IV酰基富烯0.3mg/kg 73±38 540±1671352±520 3204±1147 9501±4605IV1mg/kg58±32 582±297964±685 2321±1434 6275±28653mg/kg38±30 369±250336±215 437±238 1201±501实施例VIII一般体外筛选方法和细胞摄入研究与上文中实施例的建议和我们的对隐杯伞素作用和组织特异性的机制的认识相一致，其它骨髓白血病细胞系用快速隐杯伞素摄入进行筛选(KG1、KG1a、HEL、K562、OCI-M1、AML-193)。
用于体外筛选隐杯伞素化合物的方法在上述的实施例中作了详细说明。新的类似物对细胞系的细胞毒性首先用生长或半固体菌落形成试验和胸苷掺入的抑制在5log范围内评价。使用胸苷掺入的抑制是因为早先的研究表明胸苷掺入优先被隐杯伞素抑制，并与细胞死亡密切相关。对正常骨髓先祖和各种细胞系包括各种白血病、B和T细胞和固体肿瘤(黑瘤、卵巢瘤)进行筛选类似物。
脱氢隐杯伞素M对各种细胞系包括MDR系的体外试验也可用DNA修复缺陷细胞系和正常骨髓先祖进行。可制备各种其他类似物。由于这些类似物将改变已知的活性位置，他们被预期产生相似的肿瘤抑制。用于这些类似物的筛选研究可包括各种mdr细胞(以确保不发生交叉抗药性)和DNA修复缺陷细胞系。
体外试验也可研究其他乳腺细胞系的敏感性，以确定是否它们也优先对隐杯伞素S、脱氢隐杯伞素M和富烯类似物敏感。
实施例IX在肿瘤细胞中隐杯伞素摄入的试验尽管人骨髓肿瘤细胞对隐杯伞素是敏感的，但它们的正常前体，粒细胞/巨噬细胞形成单元，对隐杯伞素的相对抗药性是1.5～2.0log表明在某些正常骨髓细胞中不存在传递系统，提供了一个安全的治疗范围。
特定的隐杯伞素S摄入用相对敏感的HL60细胞和抗药性的B细胞进行试验。在37℃，HL60骨髓白血病细胞显示隐杯伞素S的迅速摄入，而相对不敏感的8392B细胞显示较小的药物掺入(附图7)。隐杯伞素在B细胞系中的细胞内累积是缓慢和线性的，持续7小时(r-0.984)，在此时，细胞内浓度接近保温混合物的浓度。与之相比，HL60细胞迅速累积毒素，细胞内累积在一小时内达到平稳期。暴露于10nM隐杯伞素S的HL60细胞浓缩毒素19倍，而B细胞不主动地浓缩毒素。被HL60细胞在细胞内快速累积的隐杯伞素S在高浓度下饱和(附图8)。与之相比，隐杯伞素S在8392B细胞中的累积仍然依赖于浓度。在变化的浓度下隐杯伞素S被HL60细胞的最初摄入的分析显示隐杯伞素S的流入量符合Michaelis-Menton饱和动力学(附图9)。HL60细胞的Vmax是27Picomole/min/mg蛋白质，Km是4.2μM。这表明HL60细胞有很高的隐杯伞素的传递能力，因为隐杯伞素的Vmax是叶酸盐(一种细胞所需的维生素)的Vmax的5倍。
冷的(4℃)1％叠氮化物和代谢阻断剂α-脱氧葡萄糖和抗霉素A均阻断隐杯伞素S摄入HL60细胞中，但对不敏感的8392B细胞几乎没有作用(表7)。这些研究表明，隐杯伞素S通过依赖于能量的传递系统传递和浓缩于HL60细胞中，而仅仅通过扩散(被动的或不需要能量的传递)传递至不敏感的B细胞中。MCF 7乳腺瘤细胞也显示冷却抑制摄入。依赖于能量的传递机制的发现解释了为什么骨髓和乳腺肿瘤细胞在短的暴露时间内对隐杯伞素如此敏感，而B细胞则不敏感。
表7与8392B细胞比较[3H]隐杯伞素S被HL60骨髓的摄入每小时最大摄入(picomoles)a条件HL608392MCF737℃ 75±16b5.5±1.4 29±44℃ 4.3±0.9 3.4±1.0 4.0±2.11％叠氮化物 8.7±1.4 4.3±1.3 NTb2-脱氧葡萄糖δ 16.7±3.5 3.6±1.4 NT抗霉素A
如上述方法将细胞暴露于100ng/ml的[3H]-标记的隐杯伞素S1小时并采集。结果用平均±SE表示，并表示3次实验。a每千万细胞bNT＝未测试实施例X2，5，6，7-四甲基-1-二氢茚酮和蕨素化合物的合成和结构首先通过制备1，2，3-三甲基苯和甲基丙二酰氯在二硫化碳中的溶液，然后在两小时内滴加三氯化铝合成2，4，5，6-四甲基-2，3-二氢-1，3-茚二酮(indanione)。将混合物回流2小时，加入碎冰，用氯仿提取三次。合并的提取物用盐水洗涤、干燥和除去溶剂得到残余物，其用色谱法纯化，用1％乙酸乙酯的苯溶液洗脱。除去溶剂和用升华提纯得到所需的产物。
2，5，6，7-四甲基-1-二氢茚酮通过用锌粉在50℃还原2，4，5，6-四甲基-2，3-二氢-1，3-茚二酮制备。产物用色谱法纯化，用1％乙酸乙酯的苯溶液洗脱得到两个异构体。主要的异构体用10％氢氧化钾处理，随后用升华提纯，化合物有如下结构 脱氢蕨素O合成将3-乙酰氧基-6-(β-甲氧基)乙基-2，5，7-三甲基-2，3-二氢-1-茚酮溶解于四氢呋喃和10％氢氧化钾中，并回流2小时。溶液随后用乙醚提取三次，合并的提取液用色谱法纯化，用2％乙酸乙酯的苯溶液洗脱，得到脱氢蕨素O化合物。该有如下结构； R＝H，脱氢蕨素BR＝CH3，脱氢蕨素O两个化合物在体外对细胞是毒性的，具有抗真菌性质。
实施例XI酰基富烯类似物的合成许多具有抗肿瘤活性所需的关键结构特征的酰基富烯类似物可由隐杯伞素S制备或由简单的前体经全合成制备。隐杯伞素S通过Omphalotus illudens发酵制备。将该化合物溶解于水并加入稀H2SO4后，将其转化为酰基富烯(R1＝H，R2＝H，R3＝CH3)，产率55％。由酰基富烯通过R2取代基的改变得到大量的类似物，例如，R2＝羟甲基、溴、碘、氯、氟、硝基、对羟基苄基、对甲氧基苄基。R2也可以是多核或杂环芳基。
R1基团可以是酰基或烷基。带不同R3基团(和R2基团)的类似物也可按下图概述的方法的全合成法制备。 1，1-二乙酰基环丙烷与适当取代的环戊二烯衍生的二阴离子的醇醛缩合得到中间体，其迅速转化为酰基富烯。其可以是各种化合物，因为R2和R3可以是烷基，芳基或取代的烷基或芳基。
酰基富烯的合成。将2g(9.2mmol)隐杯伞素S溶解于700ml水中，随后加入4M H2SO4(236ml)。将溶液搅拌过夜，用乙酸乙酯提取。有机相用饱和NaHCO3、水和盐水洗涤，用MgSO4干燥并浓缩。用硅胶色谱分离，用己烷和乙酸乙酯洗脱，得到0.82g酰基富烯(50％)。1H NMR δ0.73至1.50(m，4H)，1.38(s，3H)，2.00(s，3H)，2.15(s，3H)，3.93(s，1H)，6.43(s，1H)，7.16(s，1H)；MSm/Z 216(M+)，202(M+-CH2)，188(M+-CH2CH2)，173(M+-2CH2-CH3)，170(M+-2CH2-H2O).UV 325nm(8.3×103)，235nm(16.6×103)。化合物有如下结构 6-羟甲基富烯的合成。将酰基富烯(550mg，2.5mmol)溶解于40ml THF中，加入30％甲醛-水溶液(40ml)。加入4NH2SO4溶液(26.4ml)使最终H2SO4的浓度为1N。将溶液搅拌过夜，并用乙酸乙酯提取。有机相用饱和NaHCO3溶液、水和盐水洗涤，用MgSO4干燥。用硅胶色谱分离，用己烷和乙酸乙酯洗脱，得到400mg羟甲基富烯(64％)。
1H NMR δ 0.72 to 1.48(m，4H)，1.38(s，3H)，2.15(s，3H)，2.19(s，3H)，3.90(s，1H)，4.66(d，J＝2.1Hz，2H)，7.10(s，1H)。MS m/Z 246(M+)，228(M+-H2O)，218(M+-CH2CH2)，186(M+-CH3-CH2-CH2-OH)，185(M+-H2O-C2-CH2-CH3)。UV 233nm(1.0×104)，325nm(7.7×103)。化合物有如下结构
碘富烯。向酰基富烯(60mg，0.28mmol)在15ml CH2Cl2中的溶液中加入三氟乙酸银(63mg，0.29mmol)。在0℃滴加碘(70.5mg，0.28mmol)在8ml CH2Cl2中的溶液。混合物在该温度下搅拌3小时，然后通过硅藻土过滤，用乙醚洗脱。浓缩滤液得到碘富烯，红色胶状物(73mg，77％)。
1H NMRδ0.76 to 1.54(m，4H)，1.38(s，3H)，2.14(s，3H)，2.36(s，3H)，3.87(s，1H)，7.16(s，1H).MS m/z 342(M+)，314(M+-CH2CH2)，299(M+-CH2CH2-CH3)，29 6(M+-CH2CH2-H2O)，215(M+-I)，187(M+-I-CH2CH2)，127(I+)。化合物有如下结构 溴富烯。将酰基富烯(60mg，0.28mmol)在0℃溶解于9ml乙腈中。加入N-溴琥珀酰亚胺(50mg，0.28mmol)，混合物在该温度下搅拌3.5小时。用水急冷反应物，用乙醚提取产物。乙醚层用水和盐水洗涤，用MgSO4干燥。经色谱法分离得到溴富烯，橙色晶体(77mg，94％，用乙酸乙酯-己烷重结晶，m.p.92-94℃)。
1H NMR δ 0.75 to 1.55(m，4H)，1.40(s，3H)，2.12(s，3H)，2.33(s，3H)，3.89(s，1H)，7.15(s，1H).MSm/Z 295(M+)，293(M+-2)，267，265，(M+-CH2CH2)，252，250(M+-CH2CH2-CH3)，249，247(M+-CH2CH2-H2O)，215(富烯-1)。化合物有如下结构 对羟基苄基富烯。将苯酚(40mg，0.4mmol)加入在无水CH2Cl2(25ml)中的羟甲基富烯(70mg，0.28mmol)溶液中。将混合物冷却至-78℃，滴加三氟化硼合乙醚(0.3ml，2.7mmol)。反应物在该温度下搅拌1小时，加水急冷反应物。有机层用H2O、NaHCO3和盐水洗涤，用MgSO4干燥。用硅胶色谱法分离，用己烷-乙酸乙酯洗脱，得到90mg(98％)红色结晶体(m.p.143-144℃)。
1H NMRδ0.59-1.43(m，4H)，1.36(s，3H)，1.76(s，3H)，2.07(s，3H)，3.95(s，1H)，3.97(d，J＝7.2Hz，2H)，4.83(s，1H)，6.74(d，J＝8.4Hz，2H)，6.91(d，J＝8.4Hz，2H)，7.22(s，1H)。MS m/Z 322(M+)，294(M+-2CH2)，279(M+-2CH2-CH3)，251(M+-2CH2-CH3-CO)，215，107。UV 228nm(1.2×104，在243和262nm转折)，325(7.1×103)，410nm(2.6×103)。化合物有如下结构 对甲氧基苄基富烯。将苯甲醚(0.04ml，0.37mmol)加入在无水CH2Cl2(5ml)中的羟甲基富烯(10mg，0.04mmol)溶液中。将混合物冷却至-78℃，滴加三氟化硼合乙醚(0.04ml，0.36mmol)。反应物在该温度下搅拌1小时，加水急冷反应物。有机层用H2O、饱和NaHCO3和盐水洗涤，用MgSO4干燥。浓缩溶液得到残余物，其经真空干燥以定量产率得到产物(14mg)。1H NMRδ0.59-1.40(m，4H)。1.36(s，3H)，1.76(s，3H)，2.07(s，3H)，3.7 8(s，3H)，3.95(s，1H)，3.99(d，J＝16.12Hz，2H)，6.81(d，J＝8.8Hz，2H)，6.96(d，J＝8.3Hz，2H)，7.22(s，1H)。MS m/Z 336(M+)，3 08(M+-CH2CH2)，215，121((CH2-ph-OCH3)+)。UV 410nm(2.7×103)，325nm(7.0×103)，267nm(1.0×104)，245nm(转折)，226nm(1.9×104)，203nm(1.4×104)。化合物有如下结构 实施例XII酰基富烯类似物的体外细胞培养研究用细胞培养试验进行的体外测试表明6-羟甲基酰基富烯、溴酰基富烯和碘酰基富烯类似物对目标肿瘤细胞HL60和MV522在2和48小时暴露时间明显地是毒性的(表8和表9)。相对毒性比(2和48小时毒性)显示这些类似物在体内比母体隐杯伞素S化合物或在原先的专利申请中描述过的类似物更有效。
表8与原先的类似物和隐杯伞素S比较新类似物的2小时细胞毒性(由胸苷掺入的抑制测定)2小时IC50值(nmol/L)HL60细胞8392细胞MV522隐杯伞素S 10±1 236±22 19±6脱氢隐杯伞素M 377±81 61,335±9,8101,826±378酰基富烯 998±24466,435±13,006 727±1806-羟基甲基酰基富烯 150±11 7,359±2,096 114±286-HMAF的乙酸酯类似物 3,333±192 47,455±2,9511,066±87溴酰基富烯 803±88 17,175±890 4,180±424碘酰基富烯 2,602±345 10,331±497 956±152对羟基苄基富烯 264±38 95,236±11,984 1,180±180对甲氧基苄基富烯 1,964±84 35,714±7,2922,045±208
表9与原先的类似物和母体隐杯伞素S化合物比较新类似物的48小时细胞毒性4848小时IC50值(nmol/L)HL60细胞8392细胞MV522隐杯伞素S 3±18±2 4±1脱氢隐杯伞素M 296±66 269±100 313±23酰基富烯364±74 833±152 349±236-羟基甲基酰基富烯 4±176±4 73±86-HMAF的乙酸酯类似物806±30 4,434±163 486±42溴酰基富烯 412±21 1,186±138 356±61碘酰基富烯 290±12 1,696±183 556±47对羟基苄基富烯 382±39 11,078±388615±56对甲氧基苄基富烯1,051±104 7,143±244 1,548±214
实施例XIII体内研究根据这些体外筛选结果，选择类似物之一，6-羟甲基酰基富烯进行体内研究以确定该类似物是否确实比酰基富烯更有效。异种移植物是人肺腺癌MV522，因为它是对常规抗癌药的非应答模型，通过转移杀死(不是局部肿瘤侵袭)。常规抗癌药物，顺氯氨铂、紫杉酚、丝裂霉素C、亚德里亚霉素以及隐杯伞素S被选作对照药物。对照组包括仅接受用于溶解药物的溶剂，40％二甲基亚砜/生理盐水混合物(40％DMSO/NS)。6-羟甲基酰基富烯类似物实际上诱导动物肿瘤的消退。以前在此模型中从未显示肿瘤被抗癌药物实际的消退。通过常规的抗癌药物或隐杯伞素S未抑制肿瘤生长(附图10)。动物仅接受9剂量的6-羟甲基酰基富烯类似物，在这些动物中没有毒副作用的迹象，如活力、体重、食物摄入或水摄入的降低。与对照(DMSO/NS)治疗的动物比较，顺氯氨铂、紫杉酚、丝裂霉素C和亚德里亚霉素治疗的动物没有明显地增加寿命。隐杯伞素S实际上引起早熟性死亡(药物毒性)(表10)。6-羟基甲基酰基富烯治疗的动物比对照(DMSO/NS处理的)、顺氯氨铂、紫杉酚、丝裂霉素C和亚德里亚霉素治疗的动物存活时间明显地长(对于所有组，P＜0.001)(表10)。
表10与其他药物比较，在人肺腺癌，MV522转移肺肿瘤模型中-羟甲基酰基富烯类似物的效率-第一次实验药物寿命对照 DMSO/NS IP 3X/WK 100±7％顺氯氨铂 3.2mg/kg IP 1X/WK102±8％紫杉酚4.0mg/kg IP 5X/WK100±10％丝裂霉素c 2.4mg/kg IP 1X/WK111±2％亚德里亚霉素 2.6mg/kg IP 1X/WK98±12％隐杯伞素S 2.5mg/kg IP 3X/WK＜26％[在仅3剂量时/5死亡]6-羟甲基酰基富烯 10mg/kg IP 3X/WK233±18％用不同剂量的6-羟甲基酰基富烯类似物重复实验以确定是否存在剂量应答模式。再次包括紫杉酚和低剂量隐杯伞素S作为对照药物(表11)。并再次包括仅接受药物溶剂(40％DMSO/NS)的对照组。在10mg/kg时同样显示肿瘤的消退，在1和5mg/kg治疗时显示出肿瘤生长的抑制。紫杉酚和低剂量S同样不能抑制肿瘤生长(附图11)。在第二次实验中，和对照组(40％DMSO/NS治疗的动物)比较，紫杉酚和隐杯伞素S治疗的动物的寿命没有明显增加。10mg/kg 6-羟甲基酰基富烯和5mg/kg 6-羟甲基酰基富烯治疗的动物比对照组(DMSO/NS治疗)、紫杉酚或隐杯伞素S治疗的动物存活时间明显地长。与对照组、紫杉酚治疗的和隐杯伞素S治疗的动物相比较，10mg/kg 6-羟甲基酰基富烯治疗的动物的概率(或显著性)值在每种情况下小于0.001(p＜0.001)。与对照组、紫杉酚治疗的和隐杯伞素S治疗的动物比较，5mg/kg 6-羟甲基酰基富烯治疗的动物的概率值在每种情况下也小于0.001(p＜0.001)。1mg/kg 6-羟甲基酰基富烯治疗的动物的存活时间也明显长于对照组(p＜0.01)。
表11与其他药物比较，在人肺腺癌MV522转移肺肿瘤模型中6-羟甲基酰基富烯类似物的效率-第二次实验药物寿命对照组 DMSO/NS IP 3X/WK 100±16％(根据定义为100％)紫杉酚 4.0 mg/kg IP 5X/WK 120±10％(不明显)隐杯伞素S0.25mg/kg IP 3X/WK 104％±20％6-羟甲基酰基富烯 10mg/kg IP 3X/WK232±20％6-羟甲基酰基富烯 5mg/kg IP 3X/WK154±13％6-羟甲基酰基富烯 1mg/kg IP 3X/WK135±10％第三次重复实验(表12)。腹膜内给药的紫杉酚的量增加至最高剂，并加入皮下给药的剂量，因为据报导，该途径会更有效。再次包括亚德里亚霉素和丝裂霉素C。在本实验中包括了两个新的酰基富烯衍生物(碘酰基富烯衍生物和对-羟基苄基富烯)。包括二酮类似物以说明6-羟甲基酰基富烯的明显改善。与对照组和所有其他药物治疗的动物比较，6-羟甲基酰基富烯明显地增加寿命。与所有对照组、丝裂霉素C治疗组、亚德里亚霉素治疗组和两个紫杉酚治疗组比较，6-羟甲基酰基富烯的概率值(或显著性值)小于0.0005(p＜0.0005)。这是极其明显的效果。重要的是已表明，根据2只特殊动物的寿命长，存在它们可被治愈的可能性。尽管与对照组(p＜0.002)和其他药物治疗动物比较，二酮也显著增加了寿命，但它不如6-羟甲基酰基富烯有效。注意高剂量紫杉酚治疗的动物(6mg/kg，IP)的寿命不仅低于在上述实验中4mg/kg紫杉酚治疗的动物的寿命，而且还低于未治疗的或对照组的动物的寿命。这表明紫杉酚的最大剂量已达到，在此时药物毒性杀死了动物。其他新的类似物，溴酰基富烯和对羟基苄基富烯在此模型中也同样有效。
表12与其他药物比较，在人肺腺癌MV522转移肺肿瘤模型中6-羟甲基酰基富烯类似物的效率一第三次实验药物寿命对照组 DMSO/NS IP 3X/WK 100±29％紫杉酚 6.0mg/kg IP 5X/WK 93±22％紫杉酚 20.0mg/kg IP 5X/WK 113±22％丝裂霉素c2.4mg/kg IP 1X/WK 149±12％亚德里亚霉素 2.6mg/kg IP 1X/WK 105±25％二酮 30mg/kg IP 3X/WK 163±6％(早先申请人所列)碘酰基富烯 20mg/kg IP 3X/WK 120±34％对羟基苄基富烯 15mg/kg IP 3X/WK 125±16％对羟基苄基富烯 20mg/kg IP 3X/WK 126±22％6-羟甲基酰基富烯 10mg/kg IP 3X/WK ＞204％(2只动物存活，？治愈)--虽然本发明已根据现有的优选方案进行了描述，当然，可以作出各种改进而不会违背本发明的精神。因此，本发明仅由如下权利要求书限定。
权利要求
1.一种抑制受治疗者肿瘤生长的方法，包括使治疗量的有如下结构的酰基富烯类似物与肿瘤接触 其中类似物能够抑制肿瘤生长，而对受治疗者没有高的毒性，其中R选自如下基团 (其中R1＝烷基，芳基，NH2，NHR，或NR2)
2.权利要求1的方法，其中在静脉内给药时治疗量为每kg体重30～112,000μg。
3.权利要求1的方法，其中腹膜下给药时治疗量为每kg体重300～112,000μg。
4.权利要求1的方法，其中类似物通过静脉内、口腔、腹膜下和吸入给药。
5.一种能够结合肿瘤抗原的组合物，包括连接具有如下结构的酰基富烯类似物的试剂 其中R选自如下基团 (其中R1＝烷基，芳基，NH2，NHR，或NR2)
6.权利要求5的配合物，其中试剂是抗体。
7.一种抑制受治疗者肿瘤细胞生长的方法，包括使肿瘤与权利要求6的组合物接触。
8.一种治疗组合物，包括30～100mg权利要求1的化合物和药学上可接受的载体。
9.权利要求1的方法，其中肿瘤细胞选自骨髓、表皮样瘤、T细胞白血病和肺、卵巢和乳腺癌。
全文摘要
提供了一种抑制受治疗者肿瘤细胞生长的方法，包括使治疗量的有结构式I的酰基富烯与肿瘤接触，其中类似物能够抑制肿瘤细胞生长，而对受治疗者没有过高的毒性，结构式I中R是(a)，其中R
文档编号A61P35/02GK1119854SQ94191560
公开日1996年4月3日 申请日期1994年2月2日 优先权日1993年2月9日
发明者M·J·凯尔纳, T·C·麦莫里斯, R·蒂特尔 申请人:加州大学评议会