专利名称：抗轮状病毒免疫球蛋白组合物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫球蛋白组合物及其制备方法和用于预防、治疗轮状病毒腹泻的用途。
婴幼儿轮状病毒腹泻是一种世界范围内均可发生的疾病。据联合国卫生组织统计，在发展中国家(未包括中国)每年5岁以下儿童轮状病毒腹泻发病人数为一亿二千五百万，其中严重病例为一千八百万人次，死亡病例达八十七万。在美国每年婴幼儿轮状病毒腹泻发病人数为三百万，住院病例达八万二千人次。在我国每年婴幼儿腹泻病例约为3.5亿人次，其中约40～50％的病例由轮状病毒引起。更值得注意的是，除支持疗法以外，目前对轮状病毒感染的治疗尚无特效治疗药物。
近年来，人们研究发现口服免疫球蛋白可以有效地预防、治疗婴幼儿轮状病毒腹泻。美国、澳大利亚和孟加拉等国的现场保护性试验结果表明，口服特异性免疫球蛋白预防婴幼儿轮状病毒腹泻可获得完全的保护效果。欧洲山多士制药公司(SANDOZ)在意大利的Ⅱ期临床试验报告表明，在随机双盲对照试验中，A组98名轮状病毒腹泻儿童一次性口服免疫球蛋白300mg/Kg，患儿腹泻时间由平均131小时缩短为76小时，肠道排毒时间由平均180小时缩短为114小时，临床疗效显著，且未发现任何毒副作用(Guarino A,Canani RB,Russo S,et al.Oral immunoglobulins for treatment ofacute rotaviral gastroenteritis.Pediatrics,1994,93(1),12-6.)。在孟加拉国的临床研究结果表明，采用随机双盲法对照试验对35名轮状病毒腹泻儿童进行口服抗体治疗，结果发现无论在缩短病程或减轻腹泻方面，治疗组与安慰剂组间均存在显著差异(Mitra AK,Mahalanabis D,Ashraf H,et al.Hyperimmune cow colostrum reduces diarrhoea due to rotavirus:a doubie-blind,controlled clinieal trail.Acta Pcediatr 1995,84:996-1001.)。英国对骨髓移植后患严重轮状病毒腹泻的病人进行口服免疫球蛋白治疗，结果所有患儿均在72小时内痊愈(Kanfer EJ,Abrahamson G,Taylor J.et al.Severe rotavirus-associated diarrhoea followingmarrow transplantation:treatment with oral immunoglobulin.BoneMarrow Transplant,1994,14:(4)651-2.)。瑞典的研究报告表明，口服免疫球蛋白可显著地缩短轮状病毒病人的排毒期(Bogstedt AK,Johansen K,Hatta H,et al.Passive immunity against diarrhoea.1996,85:(2)125-8.)。此外，口服免疫球蛋白可显著地缩短严重Crohn’s肠炎的临床病程(Jjellstr B,Stenhammar L,Magnusson KE.et al.Oral immunoglobulintreatment in Crohn’s disease.Pcediatr,1997,86:(2)221-3.)。美国的临床试验还发现，对晚期爱滋病人并发严重隐孢子虫腹泻的病人，口服免疫球蛋白可显著地减轻腹泻程度而改善临床症状(Greenberg PD,Cello JP.Treatment of severe diarrhea caused by Cryptosporidium parvum withoral bovine immunoglobulin concentrate in patients with AIDS.J AcquirImmune Defic Syndr Hum Retrovirol,1996,13:4 348-54.)。但是，这些研究中使用的口服免疫球蛋白存在以下问题①血清免疫球蛋白及其单克隆抗体等制品的制备成本高，产量低，无法满足口服给药的大剂量要求。②使用未经强化免疫的免疫球蛋白，抗体用量大且治疗效果欠佳。③非保护剂型免疫球蛋白经口服后在胃肠道经胃酸、消化酶降解，导致免疫球蛋白用量大，抗体半衰期短。这些缺点使免疫球蛋白的生产和治疗成本增加，限制了它们在临床上的应用。
本发明的目的是提供一种制备成本低、不受胃酸和胃酶破坏的抗轮状病毒免疫球蛋白组合物。
本发明的另一个目的是提供一种制备本发明所称抗轮状病毒免疫球蛋白组合物的方法。
本发明的再一个目的是提供本发明所称免疫球蛋白组合物在预防、治疗轮状病毒腹泻方面的用途。
为实现上述目的，本发明的发明人经过实验摸索，得到下述技术方案
本发明的免疫球蛋白组合物包含有效量的抗轮状病毒特异性免疫球蛋白和药学上可接受的敷料。
为了使口服免疫球蛋白免受胃酸和胃酶的破坏，同时便于儿童服用，本发明组合物为肠溶型组合物，包括肠溶颗粒剂、肠溶微丸和肠溶微胶囊。
上述肠溶微丸或肠溶颗粒剂中敷料包含肠包衣材料、增塑剂、抗粘剂、蛋白稳定剂、粘合剂。其中抗轮状病毒特异性免疫球蛋白的含量为组合物重量的5-50％；优选为10-30％；最好为20％。
肠包衣材料包括羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羧甲基乙基纤维素、丙烯酸树脂Ⅱ号、丙烯酸树脂Ⅲ号、醋酸纤维素邻苯二甲酸酯、虫胶、聚醋酸乙烯苯二甲酸酯、琥珀酸醋酸羟丙基甲基纤维素等，优选丙烯酸树脂Ⅱ号或丙烯酸树脂Ⅲ号。
适宜的增塑剂包括枸橼酸三乙酯、三醋酸甘油酯、乙酰化枸橼酸三乙酯、聚乙二醇、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、苯二甲酸二丁酯、丙二醇等，优选苯二甲酸二丁酯或枸橼酸三乙酯。抗粘剂包括硬脂酸镁、滑石粉、二氧化硅、二氧化钛等，优选硬脂酸镁。
蛋白稳定剂包括甘露醇、乳糖、白蛋白、山梨醇、木糖醇、阿糖醇等，优选使用甘露醇或白蛋白作稳定剂。
粘合剂包括明胶、海藻酸钠、羟丙基甲基纤维素、阿拉伯胶等，优选海藻酸钠作粘合剂。
填充剂包括淀粉、乳糖、蔗糖、预凝胶淀粉等。
上述肠溶微胶囊敷料包括囊材。其中抗轮状病毒特异性免疫球蛋白的含量为组合物重量的10-30％。
本发明的组合物能用于预防和治疗轮状病毒腹泻。适应症为婴幼儿轮状病毒腹泻。
本发明组合物给药途径为口服。给药剂量为30~300毫克免疫球蛋白/千克体重。
本发明抗轮状病毒的特异性免疫球蛋白组合物可通过以下方法制备。采用Ⅱ级清洁级养殖条件，对无特定病原体(SPF)鸡进行轮状病毒强化免疫；采用脱脂、盐析、脱盐、浓缩和层析技术从强化免疫的鸡蛋中提取抗轮状病毒的特异性免疫球蛋白(IgY)；采用相应的肠溶材料和技术将特异性免疫球蛋白制备成肠溶型组合物。
其优点在于①本发明的提取技术，可以使免疫球蛋白纯度达到90％；②采用SPF鸡作为免疫媒体，可显著降低鸡蛋中的本底抗体，大大减少免疫球蛋白中的无关抗体。有助于获得大量均一的针对轮状病毒的特异性免疫球蛋白。③由于采用SPF养殖技术，可有效地降低免疫鸡和鸡蛋的病原体污染风险。从而使制备的免疫球蛋白生物安全性大大提高。
本发明组合物中免疫球蛋白由于经强化免疫而显著提高了免疫球蛋白的病毒中和效价；同时由于采用SPF技术大大减低了无关抗体本底并消除了抗体制备物中潜在的致病微生物；肠溶化学保护剂型使特异性免疫球蛋白的剂型稳定性大大提高，避免了胃酸和胃酶对免疫球蛋白的降解，使免疫球蛋白在肠道的半衰期延长，减低在肠道的无关降解。这些措施显著降低了免疫球蛋白实际使用剂量，从而减少免疫球蛋白生产成本，提高生产效益。
下面结合实施例对本发明作进一步详细的阐述，但这些实施例不限制本发明。
免疫球蛋白的制备实施例一．1．免疫原制备1.1采用ATCC标准人型轮状病毒Wa株、猴型SAll株、牛型WC3株为病毒生产株，培养宿主细胞为MA-104细胞系。
1.2将MA-104细胞连续传代培养至2500ml旋转培养瓶(DMEM培养基，含10％新生小牛血清，1％抗生素和1.5％碳酸氢钠)，37℃旋转培养24小时，以20μg/ml的胰蛋白酶处理细胞30分钟，而后加入病毒液5ml吸附1h，而后吸去病毒液，以维持液(无血清培养基，含2μg/ml胰蛋白酶)继续培养48-72小时，至细胞病变达75％时收获病毒。
1.3病毒培养液反复冻融三次，间断超声破碎2min,6000rpm离心15min,上清中加入8％PEG6000,4℃过夜，8500rpm4℃离心20min，沉淀用0.05MPBS重悬，上样至Sepharose CL-4B行凝胶过滤，收集主峰后超滤浓缩(PELLICONCASSETTE,100,000NMWL,MILLIPORE)，浓缩液进行免疫学、蛋白浓度和CPE测定。
2．动物免疫2.1采用六月龄无特定病原体(SPF)产蛋母鸡(标准Ⅱ级清洁级动物房，三级空气过滤)，每只鸡于胸、腹及大腿内侧多点肌内注射灭活双价病毒液+不完全福氏佐剂1.5-2.0ml(Wa+SA11或Wa+WC3,CPE2×10-5各0.5ml，与等量福氏不完全佐剂混合乳化)。间隔2-4周加强免疫注射一次。定期检测血清及卵黄免疫球蛋白效价。
3．免疫球蛋白制备3.1超免疫鸡蛋表面无菌处理，去蛋清后匀化处理，按1∶6加入pH4.0-5.0的酸化无菌去离子水，匀化后4℃静置过夜，上清加入20-50％的饱和硫酸铵梯度沉淀，4℃静置6h,8000rpm离心20min，沉淀用0.05M的PBS重悬，经Sapharose S-300柱层析凝胶过滤纯化，收集免疫球蛋白峰经超滤脱盐浓缩(PELLICON CASSETTE,100,000NMWL,MILLIPORE)。
3.2纯化免疫球蛋白加入保护剂后经真空冷冻干燥待用。
肠溶剂免疫球蛋白组合物的制备实施例二肠溶颗粒的制备配方及用量轮状病毒抗体冻干粉 275克乳糖 3000克阿拉伯胶粉 500克微晶纤维素 500克
2.5％羟丙基甲基纤维素 600克邻苯二甲酸二乙酯10克5％聚丙烯酸树脂Ⅱ号 800克硬脂酸镁100克制备步骤1、轮状病毒抗体颗粒的制备按配方用量称取各敷料，过100目筛，然后充分混匀，用适量粘合剂溶液将其制成软材，过14目筛，50℃烘烤4小时，用14目筛整粒，过30目筛，筛去细粉即可。
2、轮状病毒抗体肠溶颗粒的制备将肠溶性包衣材料聚丙烯酸树脂Ⅱ号溶于乙醇溶液中，加入邻苯二甲酸二乙酯和硬脂酸镁，然后采用空气悬浮包衣法包衣。即得轮状病毒抗体肠溶颗粒。
实施例三、肠溶颗粒的制备配方及用量轮状病毒抗体冻干粉 800克乳糖800克预凝胶淀粉 1000克甘露醇 400克淀粉500克1％海藻酸钠 440克苯二甲酸二丁酯 7克5％聚丙烯酸树脂Ⅲ号 630克滑石粉 63克制备步骤同实施例二实施例四肠溶颗粒的制备配方及用量；
轮状病毒抗体冻干粉 350克淀粉120克木糖醇 200克乳糖400克10％明胶560克羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯27克枸橼酸三乙酯6克二氧化钛20克制备步骤同实施例二。
实施例五肠溶颗粒的制备配方及用量轮状病毒抗体冻干粉 90克山梨醇 20克预凝胶淀粉 40克微晶纤维素 10克乳糖20克10％明胶32克醋酸纤维素邻苯二甲酸脂 3克苯二甲酸二丁脂 0.8克硬脂酸镁4.3克制备步骤同实施例二。
实施例六轮状病毒抗体肠溶微丸的制备配方及用量同实施例二至五；制备方法1、轮状病毒抗体微丸的制备按制备颗粒的配方用量将轮状病毒抗体和敷料(过100目筛)混匀后，用适量粘合剂溶液制备软材，过14目筛制得湿颗粒，然后置于包衣造粒机中，滚制成圆形的微丸。
2、轮状病毒抗体肠溶微丸的制备轮状病毒抗体微丸置于包衣造粒机中，采用包衣材料或复合包衣材料与增塑剂和抗粘剂包衣液包衣即得轮状病毒抗体肠溶微丸。
实施例七轮状病毒抗体肠溶微囊的制备配方及用量轮状病毒抗体冻干粉 0.3克羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯2克硬脂酸镁0.12克丙酮20毫升硫酸铵溶液 160毫升方法步骤将肠溶材料羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯溶于有机溶剂丙酮中配成囊材溶液，将轮状病毒抗体冻干粉悬浮其中，加入硫酸铵溶液，充分搅拌乳化，然后在搅拌下加热，使有机溶剂蒸发除去，得圆形含轮状病毒抗体的微囊。
实施例八轮状病毒抗体肠溶微囊的制备配方及用量轮状病毒抗体冻干粉 1.2克醋酸纤维素邻苯二甲酸酯 4克硬脂酸镁 0.3克丙酮 40毫升液体石蜡 180克方法步骤将肠溶材料溶于适量有机溶剂醋酸纤维素邻苯二甲酸酯中，将轮状病毒抗体冻干粉悬浮其中。称取液体石蜡，加入硬脂酸镁搅拌混匀备用。在搅拌下慢慢滴加丙酮液于液体石蜡中，室温下搅拌将丙酮挥发完全，过滤，用石油醚洗三次得微囊。
实施例九轮状病毒抗体肠溶微囊的制备配方及用量轮状病毒抗体冻干粉0.7克醋酸纤维素邻苯二甲酸酯4克硬脂酸镁 0.25克丙酮 40毫升硫酸铵溶液320毫升方法步骤同实施例七上面列示了数个实施例，其中数据只为清楚说明本发明。事实上，组合物中抗轮状病毒特异性免疫球蛋白和其它载体，可以在药学允许的范围内任意调整，有可能超出本发明实施例配比上、下比例而同样达到本发明的目的。因而，本领域技术人员，依据本发明，可以变化出许多实施方案。
本发明实施例一制备的免疫球蛋白分析结果本发明经纯化的免疫球蛋白进行免疫学、电泳和蛋白浓度的测定，结果如下表ELISA 免疫双扩 抗体纯度蛋白浓度纯化前6×1031:3260％ 10.5mg/ml纯化后1.2-1.5×1041:128 90％ 120mg/ml本发明肠溶剂免疫球蛋白组合物的保护效果1．肠溶剂免疫球蛋白组合物的溶解实验取不同pH值生理盐水，分别与上述制备的肠溶剂免疫球蛋白混合，37℃温育30min。结果如下免疫球蛋白肠溶微丸溶解性实验PH 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0溶解性 不溶 不溶 不溶 不溶 (+) (++)结果表明，制备的肠溶免疫球蛋白不溶于pH7.0以下溶液。可有效地保护免疫球蛋白抵御酸性溶液的降解。
2．肠溶剂免疫球蛋白组合物的稳定性实验将制备的肠溶剂免疫球蛋白分别在室温(18-22℃)和4℃保存，分别测定其ELISA免疫效价，结果如下免疫球蛋白肠溶微丸稳定性实验原始 60天120天 180天240天室温 1:12000 1:10240 1:10240 1:10240 1:96004℃ 1:12000 1:10240 1:10240 1:10240 1:102403．肠溶型免疫球蛋白组合物在肠道中代谢实验取18-20g昆明种小鼠，经口服给予肠溶型免疫球蛋白组合物(含5mg免疫球蛋白)，以未加保护剂的普通免疫球蛋白为对照。于不同时间取小鼠全部小肠，经组织匀浆、生理缓冲液漂洗离心回收上清，进行ELISA免疫测定。
肠溶型免疫球蛋白组合物在肠道中代谢实验ELISA检测效价时间(分) 6090 120150 180 240肠溶剂型组 1:1200 1:3200 1:2400 1:1200 1:1200 1:800正常对照级 1:3200 1:2400 1:1200 1:800 1:200 1:100特异性免疫球蛋白安全性试验小鼠急性毒性试验取Ⅱ级18-20克BALB/C小鼠，随机分不同剂量组，经灌胃给予不同剂量免疫球蛋白，观察2周。结果表明，每只小鼠给予6mg免疫球蛋白/g体重(相当于有效剂量的40倍)，受试小鼠全部存活，未见明显毒性反应。
特异性峰免疫球蛋白组合物的药效学实验1．特异性免疫球蛋白的体外病毒中和效价
1.1 MA-104细胞病变抑制实验MA-104细胞常规铺96孔细胞培养板，以待感染轮状病毒与倍比稀释的免疫球蛋白混合，37℃作用1小时，培养板每孔加入100μl病毒，37℃吸附1小时，加入含2％小牛血清的维持液100μl，胰酶浓度2μg/ml。72小时后镜下观察检测结果。结果表明，所制备的特异性免疫球蛋白对Wa株的中和效价为6.5×104(TCID50)，对SA11株的中和效价为8.5×104(TCID50)2．特异性抗轮状病毒免疫球蛋白对乳鼠轮状病毒腹泻模型的保护作用2.1乳鼠轮状病毒腹泻模型建立取5日龄Ⅱ级清洁级Bab/c乳鼠30只，随机分组，分别以不同病毒量经灌胃攻毒，确定最小百分之百致腹泻病毒剂量(DD100)。
2.2特异性抗轮状病毒免疫球蛋白对乳鼠感染模型的保护作用2.2.1将抗轮状病毒免疫球蛋白倍比稀释，分别与待感染病毒混合，37℃作用1小时，然后经灌胃对5日龄乳鼠肠道攻毒，96小时内以是否腹泻、腹泻持续时间、体重增加指数分析结果。结果表明，新生乳鼠给予0.15mg/g体重，即可使保护组乳鼠100％免于腹泻。与对照组之间存在显著差别。
2.2.2新生5日龄乳鼠经灌胃给予倍比稀释的抗轮状病毒免疫球蛋白，1小时后灌胃感染轮状病毒，96小时内判定保护效果。结果显示，乳鼠每克体重给药0.2mg免疫球蛋白，可保护感染乳鼠100％免于腹泻。与对照组存在显著差别。
2.2.3新生乳鼠经灌胃感染轮状病毒，12小时后经灌胃给药倍比稀释的免疫球蛋白，96小时后判定保护效果。结果显示，乳鼠每克体重给药0.2mg，可显著减少治疗组乳鼠的腹泻时间和腹泻量，在腹泻指数和体重增加方面和对照组存在显著差别。
权利要求
1．一种抗轮状病毒免疫球蛋白组合物，包含有效量的抗轮状病毒特异性免疫球蛋白和药学上可接受的敷料。
2．按照权利要求1所述的组合物，其特征在于该组合物为肠溶剂型。
3．按照权利要求2所述的组合物，其特征在于该组合物为肠溶微丸。
4．按照权利要求2所述的组合物，其特征在于该组合物为肠溶颗粒剂。
5．按照权利要求3或4所述的组合物，其特征在于所述敷料包括肠包衣材料、增塑剂、抗粘剂、蛋白稳定剂、粘合剂。
6．按照权利要求5所述的组合物，其特征在于其中抗轮状病毒特异性免疫球蛋白的含量为组合物重量的5-50％。
7．按照权利要求6所述的组合物，其特征在于其中抗轮状病毒特异性免疫球蛋白的含量为组合物重量的10-30％。
8．按照权利要求6所述的组合物，其特征在于其中抗轮状病毒特异性免疫球蛋白的含量为组合物重量的20％。
9．按照权利要求5所述的组合物，其特征在于其中肠包衣材料为丙烯酸树脂Ⅱ号或丙烯酸树脂Ⅲ号。
10．按照权利要求5所述的组合物，其特征在于其中增塑剂为苯二甲酸二丁酯或枸橼酸三乙酯。
11．按照权利要求5所述的组合物，其特征在于其中抗粘剂为硬脂酸镁。
12．按照权利要求5所述的组合物，其特征在于其中蛋白稳定剂为甘露醇或白蛋白。
13．按照权利要求5所述的组合物，其特征在于其中粘合剂为海藻酸钠。
14．按照权利要求2所述的组合物，其特征在于该组合物为肠溶微胶囊。
15．按照权利要求14所述的组合物，其特征在于该肠溶微胶囊敷料包括囊材。
16．按照权利要求14所述的组合物，其特征在于其中抗轮状病毒特异性免疫球蛋白的含量为组合物重量的10-30％。
17．一种制备权利要求1所述抗轮状病毒特异性免疫球蛋白组合物的方法，包括以下步骤1)用无特定病原体(SPF)鸡进行轮状病毒强化免疫；2)采用脱脂、盐析、脱盐、浓缩和层析技术从强化免疫的鸡蛋中提取抗轮状病毒的特异性免疫球蛋白(IgY)；3)采用相应的肠溶材料和技术将2)的特异性免疫球蛋白制备成肠溶型组合物。
18．一种权利要求1所述抗轮状病毒特异性免疫球蛋白组合物在预防或治疗轮状病毒腹泻中的应用。
19．按照权利要求18所述的用途，其特征在于适应症为婴幼儿轮状病毒腹泻。
20．按照权利要求18所述的用途，其特征在于给药途径为口服。
21．按照权利要求18所述的用途，其特征在于给药剂量为30至300毫克免疫球蛋白/千克体重。
全文摘要
本发明涉及抗轮状病毒免疫球蛋白组合物及其制备方法和治疗轮状病毒腹泻的用途。该组合物为肠溶剂,包含有效量的抗轮状病毒特异性免疫球蛋白和药学上可接受的载体,其中的免疫球蛋白采用无特定病原体鸡,经强化免疫后获得。该组合物可用于预防或治疗轮状病毒腹泻,具有高效、安全、和便于儿童服用等优点。
文档编号A61K39/42GK1224621SQ99100738
公开日1999年8月4日 申请日期1999年2月12日 优先权日1999年2月12日
发明者荫俊, 王效义, 张松乐, 侯晓军, 王忠泽, 宋伟 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所