[0040] 非那雄胺，美国默沙东制药有限公司；
[0041] Easy-Lowyer蛋白测定试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司，批号：2813B ;
[0042] 睾酮（纯度>98% )，BR(生物试剂）级，批号：#TCL201403 ;
[0043] 还原辅酶II 四钠盐/β-NADPH(纯度 98% )，Roche，批号：10041939103 ;
[0044] Tris-HCL，南京森贝伽生物科技有限公司，批号！SBJ0055 ;
[0045] PMSF(纯度>99% )，广州齐云生物技术公司，批号：#KY201211 ;
[0046] DTT(纯度>99% )，广州齐云生物技术公司，批号：#py200611 ;
[0047] PBS，上海立菲生物科技有限公司，批号：8113275 ;
[0048] 其他化学试剂都为国产分析纯。
[0049] (2)以下实施例所涉及的仪器如下：
[0050] 戴安高效液相色谱仪（UVD170U检测器，P680泵，ASI-100自动进样器，TCC-1005 柱温箱）；
[0051] 北京迪马 Diamonsil TMC18 柱（250mmX 4. 6mm，5 μ m);
[0052] TGL-5-A离心机，上海安亭化科学仪器厂；
[0053] XXW-80A型旋涡混合仪，海门市其林贝而仪器制造有限公司；
[0054] BSllOS万分之一分析天平，香港佳立（国际）有限公司；
[0055] DZF-6050真空干燥箱，上海一恒科技有限公司；
[0056] RT-2100C酶标仪，深圳雷杜公司。
[0057] (3)以下实施例所涉及的实验动物如下：
[0058] 雄性SD大鼠10只，SPF级，体重180-220g，广州中医药大学实验动物中心提供，合 格证号：20130020。
[0059] 实施例1 5 α -还原酶的制备及定量
[0060] II型5 α-还原酶的制备：取雄性SD大鼠10只，禁食不禁水过夜后脱日处死，迅速 取肝脏及附睾（剥离脂肪组织），称重，于冰盘上剪碎，得到样品。然后加入相当于样品质 量3倍质量的预冷匀浆液在玻璃匀浆器中进行匀浆。匀浆体系于4°C下，以3500rpm的转 速离心2次，每次lOmin，取上清液。然后以1000 Og的相对离心力离心50min，再次取上清 液，即5 α -还原酶提取液，该5 α -还原酶提取液中即包括Π型5 α -还原酶（5 α -还原酶 提取液中虽然还包含其他酶/蛋白质，但由于匀浆液的PH为5. 5,在此条件下，II型5α-还 原酶活性最高，其他酶活性被抑制）。向5 α -还原酶提取液中加一定量甘油，得到备用II 型5 α -还原酶样品（其中，备用II型5 α -还原酶样品中甘油的体积浓度为10% )，分装， 保存于-80 °C超低温冰箱中，备用。
[0061] 其中，该匀浆液由 IOOuL lOOmmol/L 的 PMSF、IOOuL lOOmmol/L 的 DTTUmL 甘油溶 解于lmol/L的PH为5. 5的Tris-HCL缓冲液中，并加Tris-HCL缓冲液定溶到IOmL配制得 到。
[0062] I型5α-还原酶的制备：取雄性SD大鼠20只，禁食不禁水过夜后脱日处死，迅速 取肝脏，称重，于冰盘上剪碎，得到样品。除了所用Tris-HCL缓冲液的PH为6. 8,后续步骤 均与制备II型5 α -还原酶的步骤相同，最后得到备用的I型5 α -还原酶样品。
[0063] 采用改良Lowry法定量测定5 α -还原酶的含量，以酶提液中总蛋白的含量表示 5 α -还原酶的浓度，操作按照Easy-Lowyer蛋白测定试剂盒说明书进行。BSA标准曲线为 Y = 0. 1329Χ+0. 0977，R2 = 0. 9932,经计算肝脏中I型5 α -还原酶的浓度为12. 17mg/ml， 附睾中II型5 α -还原酶的浓度为5. 77mg/ml。
[0064] 实施例2睾酮色谱条件的确定
[0065] (1)确定的色谱条件如下：
[0066] 色谱柱：Diamonsil ?C18 柱（250mmX 4. 6mm，5 μ m);
[0067] 流动相：甲醇-水（体积比为70:30);
[0068] 流速：1. OmT ,/mi η ；
[0069] 柱温：室温；
[0070]检测波长：242nm ;
[0071] 进样体积：20 μ 1。
[0072] (2)方法学考察：
[0073] 分别精密吸取20 μ 1的睾酮溶液、以及20 μ 1的5 α -还原酶提取液、NADPH以及 睾酮溶液的混合液，并将它们注入液相色谱仪，在（1)所述的色谱条件下进行谱图测定。如 图Ia和图Ib所示，在（1)所述的色谱条件下，睾酮峰均在约12min时出现，且峰型对称，与 其他组分的分离度较好。这表明了本实施例中（1)所述的色谱条件是切实可靠的。
[0074] 精密称取睾酮样品36mg，用甲醇配制成质量浓度为5mmol/L的睾酮母液。将 溶液逐级稀释，使其质量浓度依次为1. 44 μ g/ml，7. 2 μ g/ml，14. 4 μ g/ml，28. 8 μ g/ml， 115. 2 μ g/ml，230. 4 μ g/ml，460. 8 μ g/ml。然后按（I)所述的色谱条件进样，以睾酮峰面 积（A)对睾酮母液的质量浓度（X)作图，绘制睾酮标准曲线，得到睾酮标准曲线为A = 0.263X-0. 4106, R2= 0.9999。结果表明睾酮在其质量浓度为1.44-460. 8 μ g/ml范围内与 峰面积呈良好的线性关系。
[0075] 取睾酮母液，加甲醇稀释，得到浓度为100 y mol/L的供试品溶液。按照（1)所述 的色谱条件连续进样6次，测定睾酮峰面积A值并计算睾酮含量，6次进样所测试得到的睾 酮含量的相对标准偏差RSD为I. 01 %，表明仪器精密度高，重现性好。
[0076] 取睾酮供试品溶液，按照（1)所述的色谱条件，分别于011、211、61 1、1211、4811时进样， 测定睾酮峰面积A值并计算睾酮含量，上述各个时间点进样所测试得到的睾酮含量的相对 标准偏差RSD为1. 37%，这表明睾酮供试品溶液在48小时内稳定性良好。
[0077] 取睾酮供试品溶液6份，分别按照（1)所述的色谱条件分别进样，测定睾酮峰面积 A值并计算睾酮含量，利用上述6份睾酮供试品溶液所测试得到的睾酮含量的相对标准偏 差RSD为2. 11 %，这表明本实施例所采用的操作方法重复性良好。
[0078] 实施例3 5 α -还原酶抑制剂体外模型的建立
[0079] (1) 5 α -还原酶活性的测定方法
[0080] 设置受试样品管和对照管，将TriS-HCL缓冲液、5 α -还原酶提取液、睾酮、样品、 NADPH依次加入反应管内，混合均匀，得到5 α -还原酶反应体系。然后使该反应体系在37°C 下反应30min，并于Omin和30min时分别取样0. 5ml，最后加甲醇ImL中止反应，祸旋lmin， 并在5000rpm的转速下离心15min，取上清液，并采用平均孔径为0. 22 μπι的微孔滤膜对该 上清液进行过滤，并对该过滤后的上清液进行高效液相色谱检测。其中，样品包括：作为空 白对照的蒸馏水、作为阳性对照的非那雄胺、以及作为受试样品的何首乌醇提物。发明人经 研宄后，确定上述反应体系的总量为1000 μ 1，如表1所示。
[0081 ] 表1 5 α -还原酶反应体系的组成
【主权项】
1. 何首乌醇提物在制备5 α -还原酶抑制剂药物中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述5 α -还原酶抑制剂药物为预防或治 疗有效量的何首乌醇提物。
3. -种用于治疗与雄激素作用有关的疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合 物包括治疗有效量的何首乌醇提物。
4. 根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括与何首乌 醇提物配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。
5. 根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述与雄激素作用有关的疾病为 脂溢性皮炎。
6. 根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述与雄激素作用有关的疾病为 座疮。
7. 根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述与雄激素作用有关的疾病为 前列腺增生。
8. 根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述与雄激素作用有关的疾病为 多囊卵巢综合征。
9. 根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述与雄激素作用有关的疾病为 男性假两性体畸形。
10. 根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述与雄激素作用有关的疾病为 女性多毛症。
【专利摘要】本发明公开了一种何首乌醇提物在制备5α-还原酶抑制剂药物中的应用，属于医药领域。何首乌醇提物对5α-还原酶，特别是Ⅰ型5α-还原酶和Ⅱ型5α-还原酶具有显著抑制作用，其能有效抑制睾酮转化为双氢睾酮，进而抑制雄性激素双氢睾酮的合成，这对于预防或治疗与局部雄激素代谢异常或雄激素作用有关的疾病具有重要的意义。而且，何首乌醇提物作为中药成分，更加安全，无副作用，更利于患者的健康。
【IPC分类】A61P43-00, A61P17-08, A61P15-00, A61K36-704, A61P17-00, A61P17-10
【公开号】CN104825556
【申请号】CN201510212516
【发明人】万玉华, 李耿, 张榕文, 赖小平, 陈啟源
【申请人】霸王（广州）有限公司
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年4月29日