一种抗肝纤维化基因药物rAAV8-KAL的制作方法
【技术领域】
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[0001]本发明涉及分子药物学，具体地说涉及重组腺相关病毒载体携带Kallistatin基因在抗肝纤维化中的的应用。
【背景技术】
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[0002]肝纤维化是各类慢性肝病进一步发展、恶化的重要环节，若能在肝纤维化阶段消除致病因素并给予适当治疗，对于我国这一肝病大国意义十分重大。肝脏在纤维化过程中，普遍存在缺氧、炎症、氧化应激、门脉高压和血管增生等症状，因此，有效的抗纤维化药物应将针对多靶点、多途径作为其主要研宄方向。目前此类药物大多为重组蛋白，需反复给药，麻烦不便。临床医学研宄表明，持续稳定剂量给药比间断性峰值给药更为有效、副作用更低，而新兴的基因药物治疗技术恰能实现持续稳定的给药途径。
[0003]Kallistatin是一种内源性血管生成抑制因子，具有抗炎症、抗氧化、舒张血管、抗血管生成、抗肿瘤等多种生物学功能，对肝纤维化进程涉及到的各种症状起到一对一的抑制作用；重组腺相关病毒载体(rAAV)以其高稳定性，低致病性、低免疫原性、宿主范围广、分裂或非分裂细胞都能感染，以及持久表达目的基因等多方面优势，被认为是最有希望的临床基因药物治疗载体，尤其是在纤维化的肝脏中，粒径仅为20nm的rAAV能更加有效穿越肝窦内皮层进而转导肝细胞或肝星状细胞，是一种比较理想的肝纤维化基因药物治疗载体，在AAV的众多血清型中，8型AAV载体是目前对肝靶向性最好的一种rAAV载体，可以将Kallistatin以持续稳定剂量运输到肝脏中。
[0004]本实验室将rAAV8_kal I i statin基因药物，经尾静脉注射到四氯化碳CC14诱导的肝纤维化模型小鼠体内，并观察32天，发现rAAV8-Kal不仅对肝纤维化有显著疗效，且能在整个观察期内维持稳定水平表达。本实验涉及的rAAV8-kallistatin基因药物能够有效治疗肝纤维化的研宄成果，迄今尚未见有国内外的相关报道。
【发明内容】
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[0005]本发明的目的在于提供一种用于治疗肝纤维化的基因药物，以解决现有治疗肝纤维化药物靶点单一、需长期反复给药等问题。
[0006]本发明的基因治疗药物，由8型rAAV介导Kallistatin基因的表达，其具体特征是:病毒载体为8型rAAV;抗纤维化治疗基因为Kallistatin;基因表达框依次含有 CMV/CAG 鸡 β-actin 启动子、Kallistatin 基因、WPRE(Woodchuck hepatitisPost-transcript1nal Regulatory Element)增强子、polyA 尾巴，基因表达框两端为AAV2ITR(inverted terminal repeat sequence)。
[0007]不同血清型的AAV序列虽具有较高同源性，但每个AAV型都具有不同的衣壳，而衣壳则是决定AAV趋性和转导特点的主要因素。本发明以rAAV2质粒为基因表达质粒，分别采用rAAV2、8辅助质粒进行包装，得到两种血清型的rAAV病毒。通过动物实验发现，rAAV2/8在肝纤维化治疗中效果更佳。
[0008]本发明所述基因药物采用三质粒转染法制备，即采用磷酸钙法将表达质粒与辅助质粒共同转染293细胞，并于60-72小时后收获重组病毒，经层析纯化后备用。
[0009]本发明提供了 rAAV8-KAL在制备抗肝纤维化药物中的应用。
[0010]本发明还提供了以rAAV8-KAL为有效成分与药学上可接受的一种或多种载体组成的药物组合物。
[0011]本发明还提供了所述组合物在制备抗肝纤维化药物中的应用。
[0012]本发明的基因药物优先选用静脉注射的给药方式。
[0013]本发明的有益效果在于:提供了一种针对多靶点通过多途径的肝纤维化基因治疗药物，所述基因药物不仅能够有效治疗肝纤维化，且无需重复给药，能在体内长时间维持稳定表达水平。
【附图说明】
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[0014]下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
[0015]图1-各组小鼠肝脏外观
[0016]其中:a为正常组；b为造模刚完成；c为模型组；d为rAAV2_Kal治疗组；e为rAAV8-Kal 治疗组。
[0017]图2-各组小鼠肝脏HE染色(X 100)
[0018]图3-各组小鼠肝脏苦味酸天狼猩红染色(X 100)
[0019]图4-各组小鼠肝功能指标(ALT、AST、TBIL)检测结果
[0020]其中:N为正常组；M为模型组；2K为rAAV2-Kal治疗组；8K为rAAV8_Kal治疗组(VSM 组:*ρ〈0.05，**ρ〈0.01)。
[0021]图5-各组小鼠血清中HA、LN、C-1I1、C-1V水平检测结果
[0022]图6-各组小鼠肝组织氧化指标(MDA、S0D)检测结果
[0023]图7-各组小鼠肝组织羟脯氨酸含量(Hyp)检测结果
[0024]图8-各组小鼠血清中kallistatin表达的经时关系
[0025]图9-各组小鼠肝组织中kallistatin含量
【具体实施方式】
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[0026]下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不以此限制本发明。
[0027]《实施例1》rAAV8_kallistatin基因药物的制备
[0028]Kallistatin 质粒表达框组成依次为:CMV/CAG 鸡 β-actin 启动子、KallistatincDNA、WPRE增强子、polyA尾巴，基因表达框两端为AAV2ITR。采用磷酸钙无辅助病毒质粒法制备重组病毒:将Kallistatin表达质粒，腺病毒辅助质粒与rAAV8辅助质粒共转染293细胞，60-72小时后收获细胞，用去氧胆酸钠(0.5% )和benzonase (30u/ml)裂解，离心(3000g 30min)去细胞碎片，氯化铯密度梯度离心，即得重组病毒rAAV8_KalIistatin，并用色谱层析法纯化。
[0029]《实施例2》小鼠肝纤维化模型的构建
[0030]小鼠以lmL/100g体重腹腔注射四氯化碳CC14，前三次为15%，中间十次为25%，后三次为30%，隔两天一次，共16次，46天造模完成，得到肝纤维化小鼠模型。
[0031]《实施例3》实验组别及处理
[0032]雄性KM小鼠12只，体重约25g，实验室饲养一周后，随即分为4组，每组3只，所有小白鼠均用足量的鼠粮和水饲养。正常组:小鼠正常饲养，不做任何处理；模型组:小鼠按肝纤维化模型构建方法建模，不给药；ssrAAV2-Kal治疗组；造模完成后通过尾静脉注射ssrAAV2-Kal，1*1012VG/只，一次性给药；ssrAAV8_Kal治疗组:造模完成后通过尾静脉注射ssrAAV8-Kal, 1*1012VG/ 只，一次性给药。
[0033]《实施例4》小鼠血清样品的制备及保存
[0034]在第零天，ssrAAV2、8_kallistatin给药后的第一、三、五、七、十四、二十八、二十一■、五十八天，小鼠断尾取血150 μ L左右，尚心得血清，于-80°C保存。
[0035]《实施例5》ssrAAV2、8_kallistatin抗纤维化作用研宄
[0036]治疗期结束后，分别通过肝脏外观、肝脏病理切片染色、肝功能指标(ALT、AST、TBIL)、纤维化血清指标(HA、LA、C II1、C IV )及肝组织指标(SOD、MDA、Hyp)几个方面，综合评价ssrAAV2、8-Kal两种基因药物对小鼠肝纤维化的疗效。
[0037]《实施例6》各实验组小鼠肝脏外观
[0038]正常组小鼠肝脏整体呈暗红色，表面光滑且有明显光泽，边缘锐利整齐，质地软而有弹性；造模刚完成的小鼠肝脏明显发黄，表面粗糙且布满颗粒，边缘钝化，质地较硬且没有弹性，个别小鼠肝脏于隔膜和周围器官粘连严重，整个肝脏趋向于肝硬化；一个月后的模型组小鼠肝脏仍发黄，表面有粗糙颗粒，边缘也比较钝，但不及刚造模完成时明显；ssrAAV2-Kal治疗组较模型组有所好转，肝脏恢复些许红润颜色且变得有光泽，表面稍有粗糙颗粒，边缘比较锐利，质地也比模型组软且有弹性；ssrAAV8-Kal治疗组小鼠肝脏已恢复正常暗红色，表面光滑有光泽，边缘锐利整齐，质地软且有弹性，已十分接近正常组(图1)。
[0039]《实施例7》各组小鼠肝脏HE染色
[0040]正常组小鼠肝组织肝小叶结构完整，细胞排列整齐，形态正常，分布规律；造模刚完成的小鼠肝组织几乎没有一个完整的肝小叶结构，细胞排列混乱，肝细胞肿胀，体积变大，细胞空泡和坏死，伴随有大片炎性细胞浸润，体现出严重损伤性病理改变；一个月后的模型组小鼠稍有恢复