hsa-miRNA-204的基因组丢失通过激活AKT/mTOR/ Racl信号传导和肌动蛋白再组织来促进癌细胞迀移和侵入。
[0059] 包含微RNA的染色体区在癌症中可能是功能上重要的。本发明人已证明，编码 hsa-miR-204的基因组基因座经常在多种癌症（包括卵巢癌、儿科肾肿瘤和乳腺癌）中丢 失。特别地，hsa-miR-204已经示出在多种癌症中具有大幅降低的表达并且其充当有效的 肿瘤抑制剂，当全身递送时，抑制体内肿瘤转移。
[0060] 本发明人已证明，hsa-miR-204通过靶向参与肿瘤发生的基因发挥其功能，包括 脑源性神经营养因子（BDNF)，其为已知促进肿瘤发生和侵入的神经营养蛋白家族成员。 原发性肿瘤的分析还揭示了 BDNF或其受体原肌球蛋白相关激酶B(TrkB)增加的表达与 hsa-miR-204的明显降低的表达相平行。hsa-miR-204的丢失导致BDNF过表达和经过AKT/ mTOR信号传导途径的小GTP酶Rac以及肌动蛋白再组织的后续激活，这导致癌细胞迀移和 侵入。
[0061] 包含hsa-miR-204的基因组基因座的微缺失（microdeletion)与为肿瘤生长 和转移提供重要刺激之关键致癌途径的失调直接相关。因此，本发明人在治疗上操作 hsa-miR-204水平从而抑制肿瘤转移。
[0062] 在表1中提供了本文鉴定的hsa-miR-204和另一些miRNA的序列。
[0063] 表1.选择的miRNA的miRBase登录号、SEQ ID NO和序列：在应用时，各miRNA的 第二行&第四行子序列分别为-5p&-3p子序列。
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[0067] A.微RNA和癌症
[0068] 具有癌基因和肿瘤抑制基因之染色体区的鉴定导致对肿瘤发病机制的更好理解 和更好的治疗结果（Bayani等，2007)。尽管在具有染色体异常的区域中已经鉴定了多个 癌症相关的基因（Albertson等，2003)，但是具有在癌症生长和进展中重要因子之具有随 机或复发性染色体异常的另外区域仍然有待鉴定。目前的研宄表明微RNA(miRNA)是这些 因子组中的一个（Varambally等，2008)。miRNA是通过与靶mRNA的3'非翻译（UTR)区 相结合来调控转录后基因表达的小、内源性、非编码RNA。已知miRNA在包括发育和分化 的多个生物学过程中具有重要功能（Bartel等，2004)。miRNA的失调表达已经涉及包括 癌症的多种人疾病（Bartels等，2009)。有证据表明miRNA可充当癌基因或肿瘤抑制基因 (Esquela-Kerscher 等，2006) 〇
[0069] 已鉴定Hsa-miR-204经常在多种癌症中丢失。本发明人的研宄结果证明 hsa-miR-204通过抑制与肿瘤发生相关的基因（包括脑源性神经营养因子（BDNF))的功 能来充当有效的肿瘤抑制剂。BDNF是生理上重要的神经生长因子，其通过结合以及后续 激活酪氨酸激酶受体，原肌球蛋白相关的激酶B(TrkB)在神经系统发育中起着关键作用 (Lewin，1996 ;Segal等，1996)。此外，据报道，BDNF/TrkB途径在肿瘤发生中具有关键作 用，因为其促进增殖、分化、血管发生和肿瘤侵入（Au等，2009)。BDNF/TrkB的过表达还已 经涉及多种实体瘤（包括神经母细胞瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和肺癌）的不良预后 (Brodeur，2003 ;Eds jo 等，2003 ;Nakagawara 等，1994)。hsa-miR-204 的丢失导致 BDNF/ TrkB过表达和伴随的AKT/mTOR/Racl信号传导途径的激活，这导致在癌细胞迀移和侵入期 间的肌动蛋白再组织。这些结果强调了包含特定miRNA的染色体区具有在肿瘤发生中特别 的功能重要性。
[0070] B.癌症中 hsa-miR-204 的体细胞丢失（Somatic Loss)
[0071] 为了鉴定与人癌症中畸变染色体区相关的miRNA，将高分辨率定制miRNA比较基 因组杂交（CGH)与高密度CGH公共领域数据集一起用于卵巢癌、乳腺癌和儿科肾肿瘤。该分 析揭示了在这些肿瘤的最小染色体缺失和扩增区域中的多个miRNA。为了开始理解在肿瘤 发生中与miRNA相关的染色体基因座的功能重要性，检查了表现出基因组丢失的miRNA(图 1和例如，图9A)。包含hsa-miR-204的9q21. 12染色体区在44. 63% (158/354)的卵巢癌、 28% (10/35)的乳腺癌和40% (15/38)的儿科肾肿瘤中经常丢失（关于儿科肾肿瘤和卵巢 癌，还可分别参见图IA和IB ;对于乳腺癌，参见图9B)，其进一步通过定量基因组实时PCR 分析所证实（图IC和1D)。此外，在所有三种肿瘤类型中，成熟miR-204水平的降低还与其 基因组DNA含量密切相关（图1E、IF和1G)。
[0072] C.充当有效的肿瘤生长和转移抑制剂的hsa-miR-204
[0073] 在多种癌症组织中的hsa-miR-204的大幅降低表达促进确认（addressing) hsa-miR-204在肿瘤发生中的作用。首先确认了 hsa-miR-204对无贴壁依赖性生长的作 用。据报道，经过52次传代的HEK-293细胞是高度致瘤的（Shen等，2008)，并且过表达 hsa-miR-204的胚胎肾HEK-293细胞表现出降低的集落形成能力。但是，用hsa-miR-204抑 制剂的过表达营救了集落形成能力（图2A)。乳腺癌MDA-MB-231细胞和卵巢癌SKOV3细胞 中的hsa-miR-204过表达也获得了类似结果（数据未示出）。为了进一步证实hsa-miR-204 的潜在肿瘤抑制剂样活性，将稳定地过表达hsa-miR-204或乱序序列的高传代HEK-293细 胞注射入裸鼠的肾被膜中并且在注射后24天评估肿瘤生长和转移。与对照肿瘤形成鲜明 对比，hsa-miR-204过表达肿瘤在尺寸上大幅减小。接着检查了 hsa-miR-204是否还抑制 肿瘤细胞侵入。异种移植物肿瘤切片的组织学分析表明，与对照相比，过表达miR-204的肿 瘤对肾组织的侵入大幅降低或者没有侵入（图2C)。与此一致，hsa-miR-204过表达大幅降 低了乳腺癌（MDA-MB-231)细胞和卵巢癌（SKOV3)细胞体外的迀移和侵入能力（图2D，并且 数据未示出）。
[0074] D. hsa-miR-204 的治疗靶向
[0075] 为了进一步证明hsa-miR-204的转移抑制活性，进行了乳腺癌-肺转移模型中的 治疗实验。首先，通过尾静脉注射表达荧光素酶GFP的MDA-MB-231乳腺癌细胞来建立肺转 移。然后，在30天中，每5天使用基于LANCErII脂质的体内递送载剂将hsa-miR-204或 hsa-miR-204突变体寡核苷酸（阴性对照）注射入这些裸鼠的尾静脉。令人感兴趣的是， hsa-miR-204的全身递送导致肺转移的显著降低或消除，然而，与之相反，hsa-miR-204突 变体寡核苷酸注射的小鼠具有转移，包括严重的肺转移（图3A)。特别地，用hsa-miR-204注 射的小鼠没有表现出明显的副作用，至少如肝毒性的不存在或体重的改变所揭示（图3B， 以及未示出的数据）。这些结果表明hsa-miR-204及其同源物可形成安全和可行的治疗方 案的基础以治疗肿瘤生长和转移。
[0076] 在类似的实验中，用三阴性乳腺癌细胞移植小鼠并且用miR-204寡核苷酸或具有 种子序列突变的寡核苷酸通过尾静脉注射两组小鼠。在30天中，每6天给予尾静脉注射。 令人感兴趣的是，miR-2x4的全身递送导致肺转移的显著降低或消除，而miR-2x4突变体寡 核苷酸注射的小鼠具有严重的肺转移。这些结果表明可在治疗上靶向miR-204以治疗肿瘤 生长和转移。
[0077] E.与肿瘤发生相关的hsa-miR-204靶向基因
[0078] 为了理解支持hsa-miR-204可在肿瘤发生中起作用的机制，鉴定了由miR-204调 控的基因。因为大多数miRNA起着降低靶mRNA水平的作用（Guo等，2010)，所以在过表达 hsa-miR-204的细胞上进行基因表达分析并确定hsa-miR-204的潜在革E标。在hsa-miR-204 过表达细胞中变化的基因之中，下调的基因可能由hsa-miR-204直接靶向。令人感兴趣的 是，多个下调基因与癌症相关的过程有关并且彼此在物理上或功能上相互作用，如通过基 于通路的分析所揭示的（图IOA和10B)。在这些基因中，在一个这样的基因上进行详细分 析：BDNF，其在微阵列分析中示出较高的变化水平并且其特征为在所有预测的生物学通路 中具有最高的功能富集显著性。已知BDNF与其受体TrkB在肿瘤血管发生和转移中起着 关键作用Gidsjo等，2003 ;Nakagawara等，1994)。此外，多种革El标预测算法也预测BDNF被 hsa-miR-204革El向，所述算法包括SvMicrO (Liu等，2010)、贝叶斯决策融合方法（Bayesian decision fusion approach) (Yue 等，2010)和本发明人产生的 miRmate (Du 等，2009)，以及 TargetScan (Lewis 等，2005)和 Pictar (Krek 等，2005)。此外，发现 hsa-miR-204 结合位点 在所有脊椎动物中是进化上保守的，表明其具有跨过多个物种的重要调控功能。重要地，在 多种肿瘤中，hsa-miR-204与BDNF/TrkB的表达示出强烈的负相关（图4A、4B和4C)。
[0079] 为了证实微阵列和靶标预测结果，首先研宄了 hsa-miR-204是否通过与其3， UTR中的预测位点结合来靶向BDNF(图4D)。事实上，当与没有3' -UTR的构建体相比 时，包含BDNF 3' -UTR的pMIR报道基因构建体的荧光素酶活性被显著抑制，其在过表达 hsa-miR-204的细胞中进一步降低。相反，在含BDNF 3' -UTR的构建体中之种子序列的突 变不仅将荧光素酶活性恢复至接近野生型构建体的活性，而且使来自突变体构建体的转录 物对hsa-miR-204过表达不敏感，证实了 hsa-miR-204与BDNF 3' -UTR中预测的结合位点 之间的特异性相互作用。
[0080] 为了进一步证明这些结果，测定在过表达hsa-miR-204细胞中的BDNF的水平。 miR-204过表达导致BDNF在RNA和蛋白质水平两者上的显著降低（图4E、4F和4G)。然后， 检查了 BDNF是否为miR-204功能上重要的靶标。为了确认该结果，进行了营救实验。BDNF 的再引入营救了 hsa-miR-204诱导的表型，包括无贴壁依赖性生长、细胞迀移和侵入（图 11A&1 IB ;以及未示出的数据）。这些结果表明hsa-miR-204介导的BDNF调控是癌细胞生 长、迀移和侵入中的重要事件。
[0081] F. Hsa-miR-204的丢失激活癌细胞中的AKT/mTOR信号传导和Racl易位
[0082] 为了确定通过其hsa-miR-204可表现出其肿瘤生长和转移抑制活性的机制，根据 在之前已经示出激活AKT途径的BDNF(Troca-Martin等，2010)，检查了 hsa-miR-204对 AKT/mTOR信号传导的作用；此外，已经示出通过mTOR对AKT的选择性激活调控癌细胞迀移 和侵入。令人感兴趣的是，hsa-miR-204过表达导致AKT和mTOR下游靶标4E-BP1和S6的 活性降低（图5A)。4E-BP1是在磷酸化之后从eIF4E解离以允许蛋白质翻译的翻译抑制 剂，并且S6是其磷酸化有利于核糖体的组装和后续mRNA翻译的核糖体蛋白质。AKT通过调 控参与肌动蛋白组织、细胞与细胞粘附和细胞运动的多个过程来控制细胞侵入性（Kim等， 2011 ;Grille 等，2003 ;Enomoto 等，2005)。
[0083] 为了检查miR-204是否可在该过程中发挥直接作用，评估了 hsa-miR-204过表达 对小G蛋白Racl的激活的作用。小G蛋白Racl与AKT/mTOR功能上相互作用，并且据报 道，在用BDNF(zadran等，2010)或表皮生长因子（EGF) (Kim等，2011)诱导后，其在细胞迀 移和肌动蛋白再组织中起着重要作用。用BDNF或EGF刺激MDA-MB-231细胞（以及SK0V3 细胞或HEK-293细胞）诱导膜边缘波动（ruffling)，并且该刺激引起Racl易位到边缘波