NA CGH分析。基于使用Agilent的eArray程序（可在earray. chem. agilent. com/earray上在线获得）以及覆盖所有miRNA区域的另外的探针（在来自 miRBase vl3的各miRNA之前、之中和之后的200bp，用一式三份的探针以增强可靠性）的 Agilent 2X105K人类全基因组基因组微阵列来设计定制阵列。使用用于DNA变化定量的 Nexus Copy Number(BioDiscovery)来进行阵列CGH数据分析。在确定了样品在特定miRNA 位点上具有或没有拷贝数变化后，将所有阵列CGH数据加载到MTLAB中以用于复合图形展 示。示出探针位置和归一化拷贝数的阵列CGH已经提交给GE0/NCBI数据库（GSE28397)。
[0114] 实施例5
[0115] (元分析）
[0116] 在354个卵巢癌（获自癌症基因组图谱（TCGA)项目（The Cancer Genome Atlas Project)，位于〈cancergenome. nih. gov>网上）和35个乳腺癌（GSE15130)上的公共领域 高密度CGH数据集上进行元分析。将所有肿瘤的阵列CGH数据输入Nexus Copy Number。 将拷贝数丢失的阈值设置为l〇g2_0. 5(比默认设置log2-0. 2更严格）。在来自GE0/NCBI 的公共领域基因表达数据集（GSE22820)上进行用于基因表达分析的元分析。通过首先进 行RMA/分位数归一化，然后与相同数据集内的正常相邻组织进行比较来测定乳腺癌样品 中TRPM3 (包含miR-204的基因座）的差别表达。
[0117] 实施例6
[0118](基因表达分析）
[0119] 使用Agilent人类全基因组4X44K阵列（Agilent Technologies)来产生人类基 因表达微阵列数据。根据制造商的方案，使用染料交换复制（dye-swap replicate)将分离 自用miR-204转染之HEK-293细胞的总RNA与来自用乱序寡核苷酸（对照）转染之HEK-293 细胞的RNA进行共杂交。使用Agi lent的Feature Extract ion软件（版本9. 5. 3. 1，Agi lent Technologies)来提取相对基因表达比。用 MATLAB Bioinformatics Toolbox(R2009a， Mathworks)进行分位数归一化。为了测定基因的差别表达，将学生t检验应用于归一化的 表达数据。基于FDR-调整的P < 0. 05 (Benjamini-Hochberg)和倍数改变> 2来选择特 征基因集（Signature gene set)。将差别基因表达数据集保存在GE0/NCBI数据库中（GSE 28400)。
[0120] 实施例7
[0121] (质粒构建）
[0122] 对于pMIR-BDNF 3'UTR构建体而言，将BDNF基因的3' -UTR区段扩增并亚克隆 到pMIR-REPORT载体（Ambion)中的荧光素酶基因下游的HindIII和SpeI位点处。对 于pSilencer-miR-204构建体而言，将约500bp pri-miR-204基因组序列扩增并克隆到 pSiIencer 4. I Puro 载体（Ambion)的 BamHI 和 HindIII 位点中。
[0123] 实施例8
[0124] (细胞生长和软琼脂测定）
[0125] 如之前所述使用pSilencer-miR-204和pSilencers乱序（对照）稳定细胞系进 行细胞生长和软琼脂集落形成测定（Imam等.，2010)。
[0126] 实施例9
[0127] (SCID小鼠中的致瘤性测定）
[0128] 将稳定过表达pSilencer-miR-204或pSilencer-乱序的两百万个HEK-293细胞 注射入9只RAG2+、yc+SCID雄性小鼠（Taconic)和9只对照小鼠的肾被膜中。在移植后 24天使用公式π/6X (LXDXW)来评估肿瘤体积，其中L是肿瘤长度，D是深度并且W是宽 度。将6微米石蜡包埋的肿瘤切片用苏木精和伊红进行染色。涉及动物的所有实验程序均 遵循研宄机构伦理规范进行。
[0129] 实施例10
[0130] (Transwell细胞迀移和基膜基质侵入测定）
[0131] 如之前所述进行Transwell细胞迀移测定（Imam等，2010)。使用用75nM miR-204 模拟物或阴性对照模拟物转染，然后用75nM miR-204-特异性抑制剂或25ng pBluescript KS+对照转染48小时的MDA-MB-231细胞来进行侵入测定，如下所述。转染后48小时，将细 胞接种到预包被有基质胶（lmg/mL) (BD Biosciences)的24孔transwell板的插入物上。 将含血清培养基和纤连蛋白（5 μ g/mL)添加至下室中作为化学引诱物。孵育24小时之后， 洗绦、固定transwell插入物上的细胞，并且用棉拭子轻轻移除未侵入细胞和EC基质。如 所述的，将位于室下面的侵入细胞用结晶紫（〇. 1% )进行染色、空气干燥和照相（Imam等， 2010)〇
[0132] 实施例11
[0133] (治疗实验）
[0134] 将100, 000个MDA-MB-231-GFP-luc细胞注射入尾静脉。从肿瘤细胞注射后第7 天开始，在30天中，每5天以每kg体重Img寡核苷酸的比率注射与RNALancerII体内递送 制剂（Bioo Scientific)复合的 hsa_miR-204(n = 6)或 hsa-miR-204 突变体（η = 6)寡 核苷酸。在第六次注射之后，将所有动物处死。将肺固定并分析转移灶。使用荧光显微镜 捕获肺图像（对于GFP+vIP Iuc ^灶）。收获肝以评估hsa-miR-204注射小鼠中的转移和 肝毒性。
[0135] 实施例12
[0136] (凋亡测定）
[0137] 如之前所述（32)使用FITC膜联蛋白V凋亡检测试剂盒（BD Pharmingen)在一式 三份的孔中（in triplicate wells)进行用75nM hsa-miR-204模拟物或阴性对照模拟物 转染之HE|293或HeLa细胞上的膜联蛋白V/PI染色。
[0138] 实施例13
[0139] (免疫荧光）
[0140] 将细胞用4%的多聚甲醛固定并且在室温（RT)下用(λ 2% Triton X-100渗透15 分钟，然后用磷酸缓冲盐水（PBS)洗涤并在RT下用PBS中的10 %山羊血清封闭45分钟。 在RT下，将细胞用在PBS中稀释的Racl小鼠单克隆抗体（ab33186, Abeam)孵育2小时。 在洗涤三次之后，在RT下，将细胞用1 : 200的Alexa Fluor 647与Alexa Fluor 488鬼 笔环肽缀合的二抗（A12379, Invitrogen，Molecular Probes)孵育1小时。在洗绦三次之 后，在将细胞封在载玻片上之含DAPI的Aqua-Poly/Mount培养基（Polysciences)中。在 Nikon Eclipse TE2000-U显微镜上于200X放大下进行显微照相。
[0141] 实施例14
[0142] (统计分析）
[0143] 在图中的所有值和误差条为平均土SEM ;以图例表示各η值；通过双尾学生t-检 验来确定P值。
[0144] 实施例15
[0145] (miR-296-5p抑制致敏三阴性乳腺癌中的紫杉醇响应）
[0146] 将三阴性乳腺癌细胞用乱序对照或miR-296-5p抑制剂转染3天，然后再用载体 或8nM紫杉醇处理两天。使用CellTiter_Glo(Promega Inc.)来比较载体与药物处理的 miR-296-5p转染的细胞之间的细胞生存力。在紫杉醇存在下，miR-296-5p抑制显著地降低 了细胞生存力。柱状图描绘了对照与用载剂对照（DMSO)或紫杉醇（8nM)处理的miR-296-5p 转染的细胞中之TNBC细胞生存力的百分数。图13。
[0147] 实施例16
[0148] (miR-296-5p抑制三阴性乳腺细胞迀移和侵入）
[0149] 将三阴性乳腺癌细胞用乱序对照或miR-296-5p抑制剂转染48小时。在转染后48 小时，胰蛋白酶消化细胞、使其在无血清培养基中重悬并且加载到3 μπι孔径Transwell室 (Corning，Corning，NY，USA)的顶部。将含血清培养基置于下室作为化学引诱物，将细胞在 37°C下孵育并使其经过趋化室迀移24小时。将在室底部的迀移的细胞用10%福尔马林固 定并用0. 4%结晶紫染色3小时。将实验一式三份地重复并将迀移的细胞用显微镜计数，当 与对照转染的细胞相比时，miR-296-5p抑制剂转染的细胞具有显著较低的迀移能力。代表 图像示出了侵入的细胞。使用Nikon显微镜获取图像。图14。
[0150] 实施例17
[0151] (治疗效力）
[0152] 为了进一步确定这些miRNA在治疗TNBC中的效力，我们使用了离体肿瘤外植体模 型。将新鲜切除的乳腺癌组织切成Imm3试样，在37°C下在CO 2培养箱中，将其置于补充有 氢化可的松和胰岛素的外植体培养基中的含水明胶海绵上。用紫杉醇处理来自TNBC患者 的肿瘤外植体并轻轻移出组织，将其固定在10%中性缓冲福尔马林中并加工成石蜡块。进 行IHC分析以测定Ki67水平。外科试样和外植体的IHC揭示外植体保留了原始外科试样 的组织结构和增殖特性。预期地，外植体的紫杉醇治疗揭示了在非复发TNBC中的Ki67染 色的抑制，而晚期TNBC对紫杉醇没有响应。图15。
[0153] 实施例18
[0154] (脂质体制剂）
[0155] 单独使用致敏物miRNA (75nM)或单独使用紫杉醇（1 μ M)或一起使用miRNA (75nM) 和紫杉醇（1 μ Μ)来处理在明胶海绵上生长的肿瘤外植体。紫杉醇（通过在外植体培养基 中添加）单独处理48小时导致响应于TNBC(早期癌症）Ki67水平（表示肿瘤细胞增殖） 的显著抑制。然而，紫杉醇处理并未导致复发的TNBC外植体中Ki67水平的显著改变，所述 复发的TNBC外植体对紫杉醇没有响应。使用脂质体制剂单独添加致敏物miRNA (75nM) 48 小时导致来自晚期TNBC的肿瘤外植体中Ki67水平（表示肿瘤细胞增殖）的适度抑制。然 而，当致敏物miRNA(75nM)与紫杉醇（IM)组合使用时，所述作用稳健得多。图16。
[0156] 参考文献：
[0157] 以下参考文献通过引用特定地并入本文，在某种程度上，其提供了补充本文所列 那些的示例性过程或其他细节。
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