的三磷酸腺苷二钠-氯化镁。
[0028] 优选地，所述混合溶液包括以下组分：
[0029] 体积百分含量为34-50 %的电解质平衡液；
[0030] 体积百分含量为10%的二甲基亚砜；
[0031] 体积百分含量为20-40%的人血白蛋白；
[0032] 按g/mL计的质量体积百分比为6%的轻乙基淀粉；和
[0033] 按g/mL计的质量体积百分比为10%的三磷酸腺苷二钠-氯化镁。
[0034] 优选地，所述混合溶液包括以下组分：
[0035] 体积百分含量为44 %的电解质平衡液；
[0036] 体积百分含量为10%的二甲基亚砜；
[0037] 体积百分含量为30%的人血白蛋白；
[0038] 按g/mL计的质量体积百分比为6%的轻乙基淀粉；和
[0039] 按g/mL计的质量体积百分比为10%的三磷酸腺苷二钠-氯化镁。
[0040] 优选地，所述脐带间充质干细胞的制备方法包括以下步骤：
[0041] (1)取人新鲜脐带，清洗后剪切成块；
[0042] (2)去除杂质，再次切碎后清洗；
[0043] (3)浸泡在消化溶液中消化，所述消化溶液包括胶原蛋白酶、透明质酸酶、中性蛋 白酶和D-Hanks液；
[0044] (4)过滤、清洗并分装后加入UMSC-CM2培养基并置于CO2培养箱中进行培养；
[0045] (5)细胞贴壁融合后进行消化传代培养2-5代；例如可以是2代、3代、4代或5代；
[0046] (6)洗涤并重悬后备用。
[0047] 优选地，所述清洗为用D-Hanks液进行清洗。
[0048] 对于消化液的各组分含量本发明并未作出具体限制，本领域的技术人员可根据经 验进行选择，例如胶原蛋白酶的体积分数可以是5 %、10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、 70%、80%或90% ;透明质酸酶的体积分数可以是5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、 70%、80%或90% ;中性蛋白酶的体积分数可以是5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、 70 %、80 % 或 90 % ;D-Hanks 液的体积分数可以是 5 %、10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、 70 %、80 %或90 %。作为优选技术方案，所述消化溶液按体积分数包括5-20 %的胶原蛋白 酶、1-10%的透明质酸酶、1-10%的中性蛋白酶和60-90%的D-Hanks液；
[0049] 更优选地，所述消化溶液按体积分数包括10%的胶原蛋白酶、5%的透明质酸酶、 5 %的中性蛋白酶和80 %的D-Hanks液。
[0050] 优选地，步骤（4)所述培养为培养至细胞贴壁后更换培养基，每隔2-4天进行换 液。
[0051] 优选地，步骤（5)所述消化为用无血清胰蛋白酶进行。
[0052] 第二方面，本发明提供如第一方面所述的脐带间充质干细胞注射液的制备方法， 包括以下步骤：
[0053] (1)将电解质平衡液、羟乙基淀粉和人血白蛋白充分混勾，过滤除菌；
[0054] (2)加入脐带间充质干细胞；
[0055] (3)加入二甲基亚砜；
[0056] (4)分装冻存，制备完毕。
[0057] 对于脐带间充质干细胞的加入量，本发明并未作出具体限制，但要保持其终浓度 为5 X IO5-I X IO6个/mL ;典型但非限制性地，本发明中常用的加入量为IOmU20mL和50mL， 本领域的技术人员可根据实际情况进行选择。
[0058] 优选地，所述过滤除菌采用除菌级亲水性滤器进行，优选为孔径0. 1-1 μm的除 菌级亲水性滤器，所述孔径例如可以是〇. I ym、0. 22 μπι、0. 45 μπι、0. 66 μπι、0. 75 μL?或 0. 98 μ m，更优选为孔径0. 22 μ m的除菌级亲水性滤器。
[0059] 制得的脐带间充质干细胞注射液可根据临床需要立即使用，也可使用程序降温仪 进行程序降温，置于液氮中贮存及运输，需要使用时放入已预热的37°C水浴锅中进行解冻 复苏，直接输注。对于本发明的注射液，优选的注射法为冠脉-静脉联合输入法，具体是将 患者麻醉后，采取四肢动脉插管方法，将导管送至左冠开口，依照5 X IO5个/kg体重的剂量 缓慢输注脐带间充质干细胞注射液。观察一周后，分别通过静脉追加两次脐带间充质干细 胞注射液（间隔一周），通过静脉按照IX IOfVkg体重剂量输注脐带间充质干细胞注射液。
[0060] 第三方面，本发明提供如第一方面所述的脐带间充质干细胞注射液在制备治疗慢 性缺血性心脏病的药物方面的应用。
[0061] 与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
[0062] 本发明提供了一种制备治疗慢性缺血性心脏病药物的脐带间充质干细胞注射液 及其制备方法和应用。本发明充分利用了脐带间充质干细胞无免疫排斥、无致瘤性和扩增 快速的优点，避免伦理道德和法律问题；通过采取快速消化培养方法，迅速大量制备脐带间 充质干细胞，并通过采用冻存-注射一体化溶液与脐带间充质干细胞配制而成注射液，成 分不含动物血清，复苏后细胞活率符合治疗要求；
[0063] 在保证细胞活力、医疗安全性和有效性的同时，本发明的注射液还方便临床直接 输入使用，可利用液氮冻存，并经过解冻复苏后直接注射，解决了目前间充质干细胞在慢性 缺血性心脏病治疗中实施、运输和贮存不便的问题，同时可便于医护人员操作，免去了病患 的等待时间；
[0064] 采取冠脉-静脉联合输注的方式，避免了冠脉单一输注细胞留存时间短、静脉单 一输注在肺部和肝部的积累及无法有效达到病患处的问题；
[0065] 通过间充质干细胞的自我增殖、组织修复及旁分泌作用改善慢性缺血性心脏病症 状及预后，尤其对于部分常规药物和手术无效的患者带来一种新型的治疗方法，降低此类 疾病的死亡率。
【附图说明】
[0066] 图1为实施例1制备的脐带间充质干细胞形态图；
[0067] 图2为实施例1制备的脐带间充质干细胞的流式细胞仪检测结果图；
[0068] 图3为实施例1制备的脐带间充质干细胞的体外诱导分化结果图；
[0069]图4为实施例2制备的脐带间充质干细胞经24个月冻存复苏后的流式细胞仪检 测结果图；
[0070] 图5为实施例2制备的脐带间充质干细胞经24个月冻存复苏后的体外诱导分化 结果图；
[0071] 图6为脐带间充质干细胞对慢性缺血性心脏病动物模型的恢复作用实验结果一一 SDS差异结果图；
[0072] 图7为脐带间充质干细胞对慢性缺血性心脏病动物模型的恢复作用实验结果一一 心肌梗死面积和纤维化测定结果图；
[0073] 图8为为脐带间充质干细胞对慢性缺血性心脏病动物模型的恢复作用实验结 果 红色焚光标记图。
【具体实施方式】
[0074] 下面通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明 了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0075] 实施例1脐带间充质干细胞的制备
[0076] 本实施例采用如下步骤进行脐带间充质干细胞的制备：
[0077] (1)取剖腹产截取的离开母体时间不超过2小时的新鲜脐带，并且检查产妇是否 携带传染性疾病病原体（乙肝表面抗原、丙肝抗体、梅毒抗体和艾滋病抗体阴性），将新鲜 脐带放置含D-Hanks平衡液的专用保存瓶中，低温冰盒运输；
[0078] (2)生物安全柜紫外照射30min，水浴摇床37°C提前预热，将脐带样品瓶放置在生 物安全柜中操作。用长止血钳取出样品放置在150mm无菌玻璃皿中，以D-Hanks平衡液洗 去脐带表面血液。
[0079] (3)将清洗后的脐带组织进行机械剪切为约2-5cm小段，小心去除组织中的脐带 动脉及静脉，剥离脐带外膜。将脐带华通胶剪切成为约2-3_ 3的小块，放入50mL离心管中， 使用D-Hanks缓冲液洗涤离心，去除上清后测量体积，以计算所需消化酶的总量。
[0080] (4)新鲜配制含10%胶原蛋白酶（USA Sigma)、5%透明质酸酶（USA Sigma)、5% 中性蛋白酶（USA Sigma)和80% D-Hanks液的预混消化溶液。将离心后的脐带组织转移 至IOOmL无菌广口瓶中，加入等体积酶消化液，放到37°C水浴锅中，中速震荡消化2h，后用 70 μ m筛网将收集的上清过滤到新的50mL离心管中，洗涤并离心沉淀细胞。
[0081] (5)将适量种子脐带间充质干细胞转移到培养皿或培养瓶中，加入适量UMSC-CM2 培养基，观察细胞贴壁情况，后放入37°C的CO 2培养箱中培养，待细胞生长至融合态后使用 无血清胰酶消化，离心，分装至多个培养瓶中进行传代。
[0082] (6)传代2-5代后观察细胞状态，胰酶消化后使用PBS缓冲液洗涤，进行鉴定备用。
[0083] 对实施例1制备的2-5代脐带间充质干细胞进行鉴定，包括：
[0084] (1)镜下观察在标准培养条件下可贴附于塑料表面（如图1所示）：其中，A为细 胞分离接种培养2d后可见清晰的细胞形态；B为细胞分离接种培养5d后的细胞形态图，可 以看出此时细胞已形成较典型的脐带间充质样，并具有明显的贴壁特征。
[0085] (2)表达 CD105、CD73、CD90 和 HLA-ABC(表达量高于 90% )，不表达 CD45、CD34 和 HLA-DR(表达量低于1% )(如图2所示）；具体的流式细胞仪检测结果如表1所示：
[0086] 表1流式细胞仪检测结果
[0087]
[0088]
[0089] (3)在体外可经诱导分化为成软骨细胞、脂肪细胞和成骨细胞，经碱性磷酸酶染...