色、茜素红染色和油红"0"染色均可在镜下观察到阳性（如图3所示）：可以看出本发明制 备的脐带间充质干细胞经过适宜条件可向成骨细胞、软骨细胞和成脂细胞分化，证明本发 明制备的脐带间充质干细胞具有干细胞的多向分化能力。
[0090] 以上鉴定结果参照"国际细胞治疗协会（ISCT) "所制定的标准，可证明所制备的细 胞具备间充质干细胞的特性。
[0091] 实施例2脐带间充质干细胞注射液的制备
[0092] 本实施例采用以下步骤进行脐带间充质干细胞注射液的制备：
[0093] (1)配制50mL混合溶液，其中，电解质平衡液的体积百分比为44%，羟乙基淀粉 130/0. 4的质量体积百分比为6%，三磷酸腺苷二钠-氯化镁冻干粉剂的质量体积百分比为 10 %和20 %的人血白蛋白的体积百分比为30 % ;
[0094] ⑵将混合溶液充分混勾，使用孔径0. 22 μπι的除菌级亲水性滤器过滤，然后将制 备的脐带间充质干细胞缓慢加入除菌后的混合溶液中，浓度控制在5 X IO5-I X IO6个/mL ;
[0095] (3)加入临床级二甲基亚砜，使其终体积分数为10% ;
[0096] (4)将制备的脐带间充质干细胞注射液分装于CryoMACS_?细胞冻存袋中，制 备完毕。
[0097] 将分装在冻存袋中的注射液留样进行批次检测，检测要求内毒素检测（凝胶法）、 细菌培养、病毒检测、支原体检测、乙肝表面抗原、丙肝抗体、梅毒抗体和艾滋病抗体均为阴 性。
[0098] 实施例3脐带间充质干细胞注射液的制备
[0099] 本实施例采用以下步骤进行脐带间充质干细胞注射液的制备：
[0100] (1)配制50mL混合溶液，其中，电解质平衡液的体积百分比为25%，羟乙基淀粉 130/0. 4的质量体积百分比为5%，三磷酸腺苷二钠-氯化镁冻干粉剂的质量体积百分比为 5%和20%的人血白蛋白的体积百分比为50% ;
[0101] (2)将混合溶液充分混匀，使用孔径0. 22 μπι的除菌级亲水性滤器过滤，然后将制 备的脐带间充质干细胞缓慢加入除菌后的混合溶液中，浓度控制在5 X IO5-I X IO6个/mL ;
[0102] (3)加入临床级二甲基亚砜，使其终体积分数为20% ;
[0103] (4)将制备的脐带间充质干细胞注射液分装于CryoMACS?细胞冻存袋中，制 备完毕。
[0104] 将分装在冻存袋中的注射液留样进行批次检测，检测要求内毒素检测（凝胶法）、 细菌培养、病毒检测、支原体检测、乙肝表面抗原、丙肝抗体、梅毒抗体和艾滋病抗体均为阴 性。
[0105] 实施例4脐带间充质干细胞注射液的制备
[0106] 本实施例采用以下步骤进行脐带间充质干细胞注射液的制备：
[0107] (1)配制50mL混合溶液，其中，电解质平衡液的体积百分比为70%，羟乙基淀粉 130/0. 4的质量体积百分比为10%，三磷酸腺苷二钠-氯化镁冻干粉剂的质量体积百分比 为20 %和20 %的人血白蛋白的体积百分比为1 % ;
[0108] (2)将混合溶液充分混匀，使用孔径0. 22 μπι的除菌级亲水性滤器过滤，然后将制 备的脐带间充质干细胞缓慢加入除菌后的混合溶液中，浓度控制在5 X IO5-I X IO6个/mL ;
[0109] (3)加入临床级二甲基亚砜，使其终体积分数为5% ;
[0110] (4)将制备的脐带间充质干细胞注射液分装于CryoMACS?细胞冻存袋中，制 备完毕。
[0111] 将分装在冻存袋中的注射液留样进行批次检测，检测要求内毒素检测（凝胶法）、 细菌培养、病毒检测、支原体检测、乙肝表面抗原、丙肝抗体、梅毒抗体和艾滋病抗体均为阴 性。
[0112] 实施例5脐带间充质干细胞注射液的制备
[0113] 本实施例采用以下步骤进行脐带间充质干细胞注射液的制备：
[0114] (1)配制50mL混合溶液，其中，电解质平衡液的体积百分比为47%，羟乙基淀粉 130/0. 4的质量体积百分比为1 %，三磷酸腺苷二钠-氯化镁冻干粉剂的质量体积百分比为 12. 5%和20%的人血白蛋白的体积百分比为25. 5% ;
[0115] (2)将混合溶液充分混匀，使用孔径0. 22 μπι的除菌级亲水性滤器过滤，然后将制 备的脐带间充质干细胞缓慢加入除菌后的混合溶液中，浓度控制在5 X IO5-I X IO6个/mL ;
[0116] (3)加入临床级二甲基亚砜，使其终体积分数为12. 5% ;
[0117] (4)将制备的脐带间充质干细胞注射液分装于CryoMACS?细胞冻存袋中，制 备完毕。
[0118] 将分装在冻存袋中的注射液留样进行批次检测，检测要求内毒素检测（凝胶法）、 细菌培养、病毒检测、支原体检测、乙肝表面抗原、丙肝抗体、梅毒抗体和艾滋病抗体均为阴 性。
[0119] 实施例6脐带间充质干细胞注射液的制备
[0120] 本实施例采用以下步骤进行脐带间充质干细胞注射液的制备：
[0121] (1)配制50mL混合溶液，其中，电解质平衡液的体积百分比为30%，羟乙基淀粉 130/0. 4的质量体积百分比为8%，三磷酸腺苷二钠-氯化镁冻干粉剂的质量体积百分比为 10%和20%的人血白蛋白的体积百分比为25% ;
[0122] (2)将混合溶液充分混勾，使用孔径0. 22 μπι的除菌级亲水性滤器过滤，然后将制 备的脐带间充质干细胞缓慢加入除菌后的混合溶液中，浓度控制在5 X IO5-I X IO6个/mL ;
[0123] (3)加入临床级二甲基亚砜，使其终体积分数为15% ;
[0124] (4)将制备的脐带间充质干细胞注射液分装于CryoMACS?细胞冻存袋中，制 备完毕。
[0125] 将分装在冻存袋中的注射液留样进行批次检测，检测要求内毒素检测（凝胶法）、 细菌培养、病毒检测、支原体检测、乙肝表面抗原、丙肝抗体、梅毒抗体和艾滋病抗体均为阴 性。
[0126] 对比例I
[0127] 采用CN 102908364 A提供的间充质干细胞注射液。
[0128] 对比例2
[0129] 采用CN 102792947 A提供的间充质干细胞冻存液。
[0130] 对比例3
[0131] 采用常规方法制备的间充质干细胞注射液：DMS010 %，胎牛血清FBSlO %和 UMSC-CM2培养基80 %和浓度为5 X IO5-I X IO6个/mL的脐带间充质干细胞。
[0132] 对比例4
[0133] 与实施例2相同，只是不添加二甲基亚砜。
[0134] 对比例5
[0135] 与实施例2相同，只是不添加三磷酸腺苷二钠-氯化镁。
[0136] 功能鉴定：
[0137] 将实施例2的脐带间充质干细胞注射液经过程序冷冻仪进行冷冻，后放入液氮中 保存；同时取等量的对比例1-5制备的间充质干细胞进行程序降温并放入液氮中冻存。
[0138] 从液氮中取出以上6种冻存配方的细胞冻存袋，每种取三袋，小心放入已预热至 37°C的水浴锅中，用镊子夹住冻存袋的边角轻微调整角度，使冻存袋受热均匀，在1-2分钟 内复苏，取适量复苏后的细胞悬液进行胎盘兰染色，分别测定冻存6个月、12个月、18个月 和24个月的细胞活率（即活细胞所占百分比），结果如表2所述。
[0139] 表2脐带间充质干细胞注射液与常规方法冻存后细胞活率的比较（η = 3)
[0140]
[0141] 从表2可见，本发明的脐带间充质干细胞注射液经过长时间保存复苏后的间充质 干细胞依旧保持较高的活力，并且达到国家要求的一般细胞治疗活率要求（多85% )，在经 过24个月保存后，活率较6个月时下降5%左右，但仍保持90%以上的高活率，保障了治疗 效果，并且提供了长期保存及运输的可能。冻存复苏后的细胞活率与常规DMSO-胎牛血清 冻存液相比，效果更优，并且不含动物源，成分清晰可控，说明其可以取代传统的细胞冻存 液方式，并且可在解冻复苏后直接输注。实施例2的细胞活率明显高于对比例1及对比例 3-5,说明本发明的配方可以明显提高细胞冻存后的复苏效果，提升细胞活率。
[0142] 选取保存24个月的冻存注射液，对复苏后的间充质干细胞使用无血清间充质干 细胞培养基进行培养，观察细胞形态，并进行流式细胞仪鉴定，向成脂、成软骨和成骨分化， 验证其干细胞能力变化，结果如图4和图5所示。从图4可以看出，保存24个月的样品经 流式细胞仪鉴定的结果与新鲜制备的间充质干细胞表型一致（图2)，即⑶105、⑶73、⑶90 和HLA-ABC表达量高于90%，⑶45、⑶34和HLA-DR的表达量低于1 %，证实长期保存对间 充质干细胞表面表型及干性无影响。具体结果如表3所示：
[0143] 表3流式细胞仪检测结果
[0144]
[0145] 从图5可以看出，冻存24个月的注射液进行解冻复苏，洗涤后依照一般培养方法 进行培养，然后在体外可经诱导分化为成软骨细胞、脂肪细胞和成骨细胞，经碱性磷酸酶染 色，茜素红染色、油红"0"染色和阿利新蓝均可在镜下观察到阳性，证明注射液中的间充质 干细胞依旧保持多向分化的能力。
[0146] 脐带间充质干细胞对慢性缺血性心脏病动物模型的恢复作用实验：
[0147] 选择雌性巴马小型猪，通过肌注25mg/kg盐酸氯胺酮和lmg/kg进行诱导麻醉。气 管插管后，异氟醚吸入麻醉维持，气管导管连接到呼吸机控制通气。左侧开胸，剪开心包，暴 露LCX。将一个直径为2. 5mm的Ameroid环置入LCX的根部，缝合心包，排气后逐层关胸。 4周后形成慢性缺血性心脏病动物模型。试验期间，心脏功能主要由以下方法测定评估：心 脏超声检测心功能，左室舒张末期容积（LVEDV)和左室收缩末期容积（LVESV)，并...