. 75mmol，4-二甲氨基吡啶0. 75mmol和1-乙基-3 - (3-二甲基氨基丙基）-碳 化二亚胺〇. 75mmol溶于100mL二氯甲烷中，反应约72~96h。减压旋蒸除去有机溶剂，真空 干燥得氨基聚乙二醇胆固醇粗产品。称取叶酸lmmol、N-羟基琥珀酰亚胺2. 5mmol、l-乙 基-3 - (3-二甲基氨基丙基）-碳化二亚胺2. 5mmol和三乙胺IOmmol溶于50ml无水DMSO 中，加入约0. 5mmol氨基聚乙二醇胆固醇粗产品，25~30°C反应约72~96h，反应液转入透析 袋（MWC0=3500 Da)，分别以20% (v/v)DMS0和水为透析介质透析，透析7天后，转移透析样 品至丝口瓶中，冻干，即得叶酸-聚乙二醇-胆固醇或叶酸-聚乙二醇-磷脂（即叶酸修饰 脂质)。叶酸反应、纯化及冻干全程避光，产物避光保存于干燥器中。
[0036] 实施例11~16以双氨基聚乙二醇为间隔基制备叶酸修饰脂质 具体投料如下：
具体操作为：将脂质(胆固醇或磷脂）（10 mmol)，丁二酸酐（50mmol)，DMAP(5mmol) 溶于50 mL二氯甲烷中，45 °C剧烈回流，搅拌48 h，得丁二酰化脂质(胆固醇或磷脂)。取 丁二酰化脂质（4mmol)，1-乙基-3 - (3-二甲基氨基丙基）-碳化二亚胺（IOmmol )，N-羟基 琥拍酰亚胺（IOmmol)溶于少量二氯甲烧中，滴加至100mL的双氨基聚乙二醇（5mmol)二氯 甲烷溶液中，室温搅拌反应约72h~96h。反应液用60目~80目硅胶拌样，300目~400目硅 胶湿法装柱，干法上样。以二氯甲烷-甲醇体系为洗脱剂，比例从80:1，60:1，40:1到20:1 (体积比，v/v)，收集含有目标产物的洗脱液，合并浓缩除去有机溶剂，得氨基聚乙二醇-胆 固醇。将叶酸（0.42mmol)、NHS (0.5mmol)、EDCI (0.5mmol)和三乙胺（4mmol)溶于 5ml 无 水二甲亚砜中，滴加氨基聚乙二醇-胆固醇（0. 21mmol)的DMSO溶液。25°C~30°C反应约 120h~144h后，将反应液转入透析袋（MWCO=1000 Da),分别以20% (v/v) DMSO和水为透析介 质透析，透析14天后，转移透析样品至丝口瓶中，冻干，即得叶酸-聚乙二醇-胆固醇或叶 酸-聚乙二醇-磷脂(即叶酸修饰脂质)。叶酸反应、纯化及冻干全程避光，产物避光保存于 干燥器中。
[0037] 实施例17~22 Il丨?酸修饰的质粒脂质休纟I[介物制备
取叶酸修饰脂质，先用5%葡萄糖溶液溶解，制得lmg/ml的叶酸修饰脂质的胶束溶 液。再取20mg脂质材料，加入氯仿使溶解，37°C减压除去氯仿，时间为lh，然后于室温、高 真空条件下保持6h以上，葡萄糖溶液水化脱膜，水浴温度60°C，时间Ih ;脱膜后的混悬液 转入西林瓶中，趁热水浴超声，水浴温度60°C，超声15min，0. 22iim微孔滤膜过滤，滤液与 cas9-DNMTl按质量比混合，室温孵育30min，记为P-LP/cas9-DNMTl。取叶酸修饰脂质的胶 束溶液与P-LP/cas9-DNMTl按上表摩尔比混合，并置于37°C恒温空气浴振荡器中，IOOrpm 振摇Ih后，即得叶酸修饰的质粒/脂质体组合物，记为F-P-LP/cas9-DNMTl。
[0038] 实施例23~28叶酸修饰的质粒/脂质体组合物制备
取脂质材料于茄形烧瓶中，氯仿-甲醇混合溶剂溶解，37°C减压除去有机溶剂，时间为 lh，然后于室温、高真空条件下保持6h以上，葡萄糖溶液水化脱膜，水浴温度60°C，时间Ih ; 脱膜后的混悬液转入西林瓶中，趁热水浴超声，水浴温度60°C，超声Imin, 0. 22 iim微孔滤 膜过滤，制得叶酸靶向空白脂质体，记为F-P-LP。F-P-LP与cas9-DNMTl按上表质量比混合， 室温孵育30min，即制得叶酸修饰的质粒/脂质体组合物，记为F-P-LP/cas9-DNMTl。
[0039] 试验例1用人卵巢癌细胞SK0V3体外评价叶酸受体靶向的敲除DNMTl的药物组合 物对细胞增殖的抑制效果 将人卵巢癌细胞SK0V3接种于96孔板，接种密度约5 X 103个每孔，次日，加入非靶向 药物组合（P-LP/cas9-DNMTl :制备方法同实施例25,仅将其中的0. 25%的叶酸-聚乙二 醇-胆固醇用0. 25%的单甲氧基聚乙二醇胆固醇酯替代）和叶酸靶向药物组合（F-P-LP/ cas9-DNMTl :用的是实施例25的组合物)，第四天，开始逐日进行MTT法检测存活细胞的相 对数量。结果表明靶向敲除DNMTl药物组合对细胞增殖的抑制率达50%，显著优于非叶酸受 体靶向敲除DNMTl药物组合（30%)。
[0040] 试验例2用人卵巢癌腹腔瘤模型评价叶酸受体靶向的敲除DNMTl的药物组合物 治疗效果 将Balb/C雌性裸鼠饲养于无特定病原体（SPF)屏障环境中。4~6周龄健康小鼠腹腔接 种约I X IO7个SK0V-3细胞/只，接种3天后按照体重随机分组(每组8只)并给药，具体分 组为：对照组（Control)、非靶向组（P-LP/cas9-DNMTl :制备方法同实施例25,仅将其中的 0. 25%的叶酸-聚乙二醇-胆固醇用0. 25%的单甲氧基聚乙二醇胆固醇酯替代)和叶酸靶 向组（F-P-LP/cas9-DNMTl :用的是实施例25的组合物)。给药方式为腹腔注射，每三天注射 1次，给药剂量为每只小鼠5呢质粒/2001^1，连续给药10次。
[0041] 处死裸鼠，解剖后记录腹水体积、肿瘤结节的个数及肿瘤的重量，叶酸受体靶向的 敲除DNMTl的药物组合物（F-P-LP/CLDN3)组跟非靶向组相比，显著提高了 DNMTl的敲除效 率，达到了较为理想的抗肿瘤效果。与对照组比较，叶酸受体靶向的敲除DNMTl的药物组合 物抑瘤率达85%，显著优于非叶酸受体靶向的敲除DNMTl的药物组合物（60%) (p〈0. 001)。
【主权项】
1. 一种叶酸受体靶向的敲除DNMTl基因的药物组合物，其特征在于：含有叶酸受体靶 向成分和敲除DNMTl基因的cas9或Talen载体。2. 根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于所述的叶酸受体靶向成分包括：叶 酸受体的抗体、叶酸、叶酸衍生物、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤衍生物。3. 根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于所述的叶酸衍生物包括四氢叶酸、 5-甲基四氢叶酸、5, 10-亚甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸、10-甲酰四氢叶酸、5, 10-二脱 氮四氢叶酸。4. 根据权利要求1~3所述的药物组合物，其特征在于敲除DNMTl基因的Talen或 cas9载体可构建在包括质粒和病毒中。5. 根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于病毒包括腺病毒、腺相关病毒、慢病 毒、逆转录病毒、溶瘤病毒、牛痘病毒、改良安卡拉牛痘病毒、仙台病毒、单纯性疱疹病毒、麻 疫病毒、新城鸡癌病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、RNA病毒。6. 根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于细菌包括大肠杆菌、长双歧杆菌、 乳酸乳球菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、痢疾杆菌、变异链球菌、霍乱弧 菌。7. 根据权利要求1~6所述的药物组合物，其特征在于叶酸受体靶向成分可以直接与 Talen或cas9载体偶联，也可修饰在Talen或cas9载体的表面。8. 权利要求1飞任一项所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
【专利摘要】本发明属于生物制药领域。本发明所要解决的技术问题是提供一种叶酸受体靶向的敲除DNMT1的药物组合物及其制备方法和用途。本发明利用可靶向肿瘤细胞表面高表达的叶酸受体成分，将敲除DNMT1的Talen或cas9载体选择性投递到肿瘤部位，可提高DNMT1的敲除效率，且抑制癌细胞增长效果明显，为临床治疗癌症提供了一种新的选择。
【IPC分类】A61P35/00, A61K48/00, A61K47/48
【公开号】CN104971361
【申请号】CN201410132839
【发明人】姚少华, 宋相容, 何治尧, 魏于全
【申请人】四川大学
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2014年4月3日