2] 参照文献（汪受传，王霖，陈超等，清肺口服液含药血清对病毒抑制作用的实验研 究，南京中医药大学学报，2008 ;24(1) :25~27)的方法，将样品按稀释顺序M)横向 接种于96板孔中的单层细胞上，每孔IOOuL每稀释度纵向重复4孔，微孔板的A、B、C行 加含100个TCI^。的病毒IOOuL作为试验组，D行补充等容量细胞维持液为不同浓度药物 对照，平行设F行作为病毒对照，E行的1~12作为细胞对照。37°C、5%C〇2培养，每日观 察CPE，连续观察4d。病毒对照出现90%W上C阳时，加1%中性红染色，用酶标仪在波长 540皿波长读取A值，各组A值去除病毒对照组A值，将各试验组与细胞对照组A值相比，获 得细胞存活率，用Reed-Muench方法计算半数抑毒浓度（ICJ，最终将TDw和IC5。相比获得 抑毒指数灯I)。 阳0创 妨结果：
[0044] ①样品TDs。的测定：对照组细胞显微镜下观察贴壁生长致密、形态良好。组合物、 化合物III和化合物IV的TDs庙肥K293分别为2 1'39、2 2'is、2 2'38。
[0045] ②抑毒实验：对照组细胞贴壁致密、形态良好。镜下观察发现，服V-1、服V-2病毒 对照组分别在第3d、3d出现90%W上的CPE，服V1和服V2在肥K293C阳则W肿胀、多细 胞融合化SV1致多个细胞融和成大泡，而HSV2致融合为小泡）、变圆、脱落为主要特征。
[0046] 而组合物抑毒试验各组细胞，按照组合物样品稀释梯度，梯度规律出现CPEWSV 1-HEK293在第10稀释度之前、HSV2-HEK293组在第9稀释度之前细胞完全被保护，之后出 现CPE，CPE随样品浓度减少逐渐加重。
[0047] 而化合物HI和化合物IV处理组在2 6浓度范围内才观察到抑制病毒的效应。 W48] 将上述实验板用1 %中性红染色、用酶标仪测450nmA值，各组A值减掉病毒对照 组A值后，各实验组A值与细胞对照组A值相比获得ICw,ICw与TDW相比获得组合物的TI:抑制服V-1、服V-2在肥K293细胞发生CPE，ICsd分别为2 11'35、2TI分别为996. 0、 1686. 7。化合物III的TI:对应的ICsc分别为2 4'73、2s'ls，TI分别为5. 9、8. 1。化合物IV 的TI:对应的ICw分别为2 "8、2 4'?，TI分别为3. 5、5. 3。
[0049] 结论：组合物具有显著的抗瘤疹科病毒（包括服V-I、肥V-2)的作用，而且安全性 高，因此组合物在治疗瘤疹病毒感染疾病中具有广泛的应用背景。化合物III和化合物IV 不具有显著的抗瘤疹科病毒（包括服V-1、肥V-2)的作用，而且安全性极低，因此化合物III 和化合物IV在治疗瘤疹病毒感染疾病中没有应用背景。
[0050](二）实验例：组合物对呼吸道合胞病毒巧SV)的作用研究
[0051] (1)组合物、化合物HI和化合物IV的配置：将药物溶于细胞维持液（含2%新生 牛血清的MEM，GIBICO公司产品）中备用。
[0052] (2)细胞株与病毒株：
[0053] 人胚肾细胞（肥K293，RSV病毒敏感细胞）购自美国Clontech公司；呼吸道合胞病 毒巧SV)Long株引自中国CDC病毒病研究所。
[0054] (3)细胞毒性测定：
[00对参照文献（汪受传，王霖，陈超等，清肺日服液含药血清对呼吸道合胞病毒抑制作 用的实验研究，南京中医药大学学报，2008 ;24(1) :25~27)的方法，将样品W2倍比做系 列稀释（2°一 5)，然后按稀释顺序横向接种于96板孔中的肥K293上，每孔100祉，每稀释度 纵向重复3孔（A、B、C行），平行设微孔板D的1~6孔为细胞对照，7~12孔不接种细胞 为空白对照，显微镜下每日观察CPE，连续观察7山中性红染色，在540nm波长测定OD值，将 实验组与细胞对照组OD值相比计算细胞存活率，用Reed-Muench方法计算药物半数细胞中 毒浓度灯05。）。
[0056] (4)抑毒试验：
[0057] 参照文献（汪受传，王霖，陈超等，清肺口服液含药血清对呼吸道合胞病毒抑制作 用的实验研究，南京中医药大学学报，2008 ;24(1) :25~27)的方法，将样品按稀释顺序 (2 2^ 横向接种于96板孔中的单层细胞上，每孔IOOuL每稀释度纵向重复4孔，微孔板 的A、B、C行加含100个TCIDw的病毒IOOuL作为试验组，D行补充等容量细胞维持液为不 同浓度药物对照，平行设F行作为病毒对照，E行的1~12作为细胞对照。37°C、5%C〇2培 养，每日观察CPE，连续观察4d。病毒对照出现90%W上C阳时，加1%中性红染色，用酶标 仪在波长540皿波长读取A值，各组A值去除病毒对照组A值，将各试验组与细胞对照组A 值相比，获得细胞存活率，用Reed-Muench方法计算半数抑毒浓度（ICJ，最终将TDw和IC5。 相比获得抑毒指数（TI)。 阳05引 妨结果：
[0059] ①样品TDs。的测定：对照组细胞显微镜下观察贴壁生长致密、形态良好。组合物、 化合物III和化合物IV对肥K293的TDsn分别为2 2'°7、22'3I、2 2'28。
[0060] ②抑毒实验：对照组细胞贴壁致密、形态良好。镜下观察发现，RSV病毒对照组在 第2d出现90%W上的CPE，RSV在肥K293CPEW折光性增强、变圆、脱落、破碎为主要特征。
[0061] 而组合物抑毒试验各组细胞，按照样品稀释梯度，梯度规律出现CPE:
[0062]RSV-HEK293试验组细胞在第9稀释度之前，细胞完全被保护，之后出现CPE，C阳随 样品浓度减少逐渐加重。
[0063] 而化合物HI和化合物IV处理组在2 6浓度范围内才观察到抑制病毒的效应。
[0064] 将上述实验板用1 %中性红染色、用酶标仪测450nmA值，各组A值减掉病毒对照 组A值后，各实验组A值与细胞对照组A值相比获得ICw,ICw与TDW相比获得TI:组合物 抑制RSV在肥K293细胞发生CPE，ICs。为2 11'"，TI为548. 7;化合物III的ICs。为2 4'32， TI为4. 0 ;化合物IV的ICw为2 5'11，TI为7. 1。结论：组合物具有显著的抗副粘科病毒呼 吸道合胞病毒RSV的作用，可W用来制备抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV药物。化合物 III和化合物IV无显著的抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV的作用，不可W用来制备抗副 粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV药物。 W65] (S)实验例：组合物对甲型流感病毒的作用研究：
[0066] (1)细胞株与病毒株：狗肾细胞（MDCK，流感病毒敏感细胞）引自中国CDC病毒病 研究所；流感病毒甲型（FluA) 1995.AII:32094地方株引自中国CDC病毒病研究所。
[0067] 似细胞毒性测定： W側参照文献（汪受传，王霖，陈超等，清肺日服液含药血清对病毒抑制作用的实验研 究，南京中医药大学学报，2008 ;24(1) :25~27)的方法，将各样品W2倍比做系列稀释 (2 1 一 5)，然后按稀释顺序横向接种于96板孔中的MDCK上，每孔100祉，每稀释度纵向重复 3孔（A、B、C行），平行设微孔板D的1~6孔为细胞对照，7~12孔不接种细胞为空白对 照，显微镜下每日观察CPE，连续观察7山中性红染色，在540nm波长测定OD值，将实验组 与细胞对照组OD值相比计算细胞存活率，用Reed-Muench方法计算药物半数细胞中毒浓度 (TDso)O W例 做抑毒试验：
[0070] 参照文献（汪受传，王霖，陈超等，清肺日服液含药血清对病毒抑制作用的实验研 究，南京中医药大学学报，2008:24(1) :25~27)的方法，将样品按稀释顺序横向接种于96 板孔中的单层细胞上，每孔IOOuL每稀释度纵向重复4孔，微孔板的A、B、C行加含100个 TCIDw的病毒IOOuL作为试验组，D行补充等容量细胞维持液为不同浓度药物对照，平行设 F行作为病毒对照，E行的1~12作为细胞对照。37°C、5%C〇2培养，每日观察CPE，连续观 察4d。病毒对照出现90%W上C阳时，加1 %中性红染色，用酶标仪在波长540皿波长读取 A值，各组A值去除病毒对照组A值，将各试验组与细胞对照组A值相比，获得细胞存活率， 用Reed-Muench方法计算半数抑毒浓度（ICJ，最终将TDw和IC5。相比获得抑毒指数灯I)。 阳〇7U (4)结果：
[0072] ①样品TDs。的测定：对照组细胞显微镜下观察贴壁生长致密、形态良好。组合物、 化合物III和化合物IV对的TDs庙MDCK分别为2 2'Si、2 2'27、2 2'96。
[0073] ②抑毒实验：对照组细胞贴壁致密、形态良好。镜下观察发现，FluA在MDCKCPE W折光性增强、坏死、破碎为主要特征。
[0074] 而组合物抑毒试验各组细胞，按照样品稀释梯度，梯度规律出现CPE=FIuA-MDCK 组细胞在第8稀释度之前细胞完全被保护，之后出现CPE，CPE随样品浓度减少逐渐加重。 阳07引而化合物m和化合物IV处理组在2 4~6浓度范围内才观察到抑制病毒的效应。
[0076] 将上述实验板用1 %中性红染色、用酶标仪测450nm的A值，各组A值减掉病毒对 照组A值后，各实验组A值与细胞对照组A值相比获得ICw,ICw与TDW相比获得TI:组合 物抑制FluA在MDCK细胞发生CPE，IC5。为2ll'll，TI为 362.0;化合物III的IC5。为24'35， TI为 4. 2 ;化合物IV的ICs。为 2 3'28,TI为 1. 2。
[0077] 结论：组合物对甲型流感病毒具有很强的抑制作用，而且安全，因此组合物在治疗 甲型流感病毒感染疾病中具有广泛的应用背景。化合物III和化合物IV对甲型流感病毒 没有显著的抑制作用，而且安全性极低，因此化合物III和化合物IV在治疗甲型流感病毒 感染疾病中没有应用背景。
[007引实施例6本发明所设及组合物片剂的制备
[0079] 取2克组合物，加入制备片剂的常规辅料18克，混匀，常规压片机制成100片。
[0080] 实施例7本发明所设及组合物胶囊的制备
[0081] 取2克组合物，加入制备胶囊剂的常规辅料如淀粉18克，混匀，装胶囊制成100 粒。
【主权项】
1. 一种组合物，其特征为该组合物由化合物III和化合物IV组成，该组合物中化合物 III和化合物IV的质量百分数分别为45%和55%，2. 如权利要求1所述的组合物的制备方法，其特征为：将化合物III的粉末和化合物 IV的粉末按照质量百分数分别为45 %和55 %充分混合。3. -种如权利要求1所述的组合物在抗病毒药物中的应用。4. 如权利要求3所述的组合物在抗病毒药物中的应用，其特征在于：所述病毒为甲型 流感病毒。5. 如权利要求3所述的组合物在抗病毒药物中的应用，其特征在于：所述病毒为单纯 疱疹病毒。6. 如权利要求3所述的组合物在抗病毒药物中的应用，其特征在于：所述病毒为呼吸 道合胞病毒。7. 如权利要求5所述的组合物在抗病毒药物中的应用，其特征在于：所述单纯疱疹病 毒为单纯疱疹病毒1型或者单纯疱症病毒2型。8. 如权利要求7所述的组合物在抗病毒药物中的应用，其特征在于：所述单纯疱疹病 毒1型为单纯痕疼病毒1型的Sm44株。9. 如权利要求7所述的组合物在抗病毒药物中的应用，其特征在于：所述单纯疱疹病 毒2型为单纯疱症病毒2型333株。
【专利摘要】本发明涉及有机合成和药物化学领域，具体涉及组合物及其在制备抗病毒药物上的用途。公开了一种组合物及其制备方法。药理学实验表明，本发明的组合物具有抗病毒作用，具有开发抗病毒药物的价值。
【IPC分类】A61P31/22, A61K31/4025, C07D313/06, A61P31/16, A61K31/5377
【公开号】CN105343106
【申请号】CN201510752212
【发明人】朱磊磊
【申请人】苏州贺澳德生物医药科技有限公司
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月6日