配制剂适合作为可吸入 给药用的抗流行性感冒活性物质。
[0042] 实施例3:在细胞培养体系中，LG-乙酷水杨酸盐对高致病性禽流感病毒的影响。
[0043] MDCKII 细胞在 MEM-介质（MEM;Gibco( Invitrogen)德国21430-079,批次 32034)中 通过添加10%的热灭活的胎牛血清(FCS，PAA Laboratories/A04305-0346)，盘尼西林(Grii nenthal/616G03)和链霉素 (Sanavi ta/03056440111)进行培养。为了进行感染，将所述细胞 播洒在24孔板(8x IO4细胞/孔;Greiner,德国，No. 662160,批次05210151)中和在37°C解育 过夜。在感染之前，所述细胞用PBS洗涂，将相应的病毒(FPV，SNl ,MBl)在PBS/BA(补充有 0.6%BA的PBS(MP Biomedicals),ImM MgCl2,0.9mM 化C12,盘尼西林（G;riinenthal/616G03) 和链霉素)稀释，并在细胞菌苔山611 lawn)上用0.001的MOI滴定。在于37°C解育30分钟后， 去除病毒接种物，向所述细胞添加 Iml MEM介质或者含有5mM LG-乙酷水杨酸盐的MEM介质。 在感染8、24、32和48小时后，取出各个上清液。在"隧菌斑测定"中验证到感染病毒颗粒的存 在。
[0044]对于"隧菌斑测定"而言，将MDCKII细胞播撒到96孔板中，使得细胞菌苔在第二天 融合。所述细胞用PBS洗涂并用上清液的稀释液感染(于37°C将所述上清液的稀释液布置在 PBS/BA中达60分钟）。在解育后，所述细胞用Avicel介质混合物（Avicel RC-58UFMC/ B624C))涂覆。为此，将2.5%的Avicel溶液与相同量的2x MEM-介质混合。在20小时的解育 时间后，去除Avicel介质混合物，所述细胞用在PBS中的4%.民她愈-Histof ix(Roth/ 32789170)溶液在4°C固定30分钟，随后用PBS进行洗涂。对于染色所必需的后续加工步骤在 室溫实施。通过用在PBS中的0.3 % Tri ton-X-100 (Serva/30043)进行解育，对所述细胞进行 透化。病毒感染的细胞用免疫组织学方法染色。为此，将细胞用单克隆抗体（Serotec/ 250107)(其为针对流行性感冒A病毒核蛋白特异性的）解育1小时。经感染的细胞的检测通 过用过氧化物酶结合的抗小鼠抗体(DIAN0VA/75790)的另一次解育（30分钟）和添加化Ue Blue?过氧化物酶底物化化/070490)进行。所述抗体的稀释在含10%FCS和0.1 %Tween-20 (Serva/16211)的PBS中实施。在用第一和第二抗体解育后，所述细胞用PBS/0.1%Tween-20 洗涂5分钟达=次。为了终止反应，所述板用自来水洗涂并经干燥。经干燥的板经扫描并借 助Core 1 DRAW 9.0软件评估。为了测定上清液的病毒滴度，经感染的细胞(病灶)在96孔板 的每个孔中的累积经计数。计数的病灶的数目与各自的稀释因子相乘。从所计算出的值，测 定对于每个样品的平均值。病毒滴度作为平均值的IoglO值记录。
[004引所述结果在图4中示出。可W看出，在用LG-乙酷水杨酸盐处理后，H7N1病毒(FPV) 和册Nl病毒(MBl)的复制在细胞培养体系中有时降低了超过99%。
[0046] 实施例4:LG-乙酷水杨酸盐的抗病毒活性所基于的分子作用机制研究。
[0047] 此外，研究了 LG-乙酷水杨酸盐的分子作用曲线是否能和纯乙酷水杨酸物质相比 较。LG-乙酷水杨酸盐应当充当NF-KB抑制剂和相应地不具有任何在其它病毒诱导信号通路 上的副作用。重要的信号介体类型(其在流行性感冒病毒感染后也被活化)是人们所说的丝 裂原(mitogen)激活的蛋白质激酶(MAPK)。其包括激酶JNK、p38和E服。对于纯物质乙酷水杨 酸而言，已经示出运些激酶的病毒诱导活化不受乙酷水杨酸的抑制。如图5所示，在LG-乙酷 水杨酸盐的情况下也是如此:JNK、p38和ERK(图5,径迹5)的病毒诱导活性(其可W借助憐光 体特异性抗体对抗运些激酶在免疫印迹(Western blot)中的活性形式进行检测）没有通过 添加5mM(径迹7)或者7mM乙酷水杨酸(径迹9)而阻断。乙酷水杨酸W通过抑制促调亡因子表 达的抗病毒方式起作用，其最终将导致在细胞中降低的半脫天冬酶活性。基于免疫印迹，图 6针对LG-乙酷水杨酸盐也显示了运一点，通过半脫天冬酶底物聚-ADP-核糖聚合酶(PARP) 的裂解显示了半脫天冬酶活性。在30小时后清楚可见的裂解PARP带(径迹6)在用LG-乙酷水 杨酸盐处理的样品(径迹7)中有效降低。
[0048] 在病毒复制中NF-KB依赖性的步骤是病毒核糖核蛋白络合物(RNP)的半脫天冬酶 依赖性输出到细胞质中，其可W随后在细胞膜中在新的病毒颗粒中形成。乙酷水杨酸特异 性地阻断运一步骤，而不对增殖周期更早的阶段中的病毒蛋白质积累起作用。对于LG-乙酷 水杨酸盐而言，相同的作用机制适用：图7在免疫印迹中示出了病毒蛋白质M1、NP、NS1和PBl 的积累没有受LG-乙酷水杨酸盐的抑制。但是，与在前文中针对纯物质乙酷水杨酸已经描述 的相同，已经发现病毒RNP络合物的有效保留，正如将在图8中由免疫巧光分析中变得清楚 的那样。
[0049] 由此能够得出结论:LG-乙酷水杨酸具有和乙酷水杨酸一样的抗病毒潜力，并W在 病毒增殖上的抑制方式中相同的分子机制起作用。
[0050] 实施例5:在LG-乙酷水杨酸盐处理之后，IPlO和干扰素-丫 m-RNA表达水平的降低。
[0051] 已知过度的细胞因子产生(所谓的细胞因子风暴)是H5N1流行性感冒病毒感染的 重要致病性因素。因为运些细胞因子中的大部分WNF-KB依赖性的方式调节，证实了 LG-ASA 是否能够抑制病毒诱导的细胞因子的表达和因此是否能够额外间接影响运些病毒的致病 性。从我们的准备工作中，已知在小鼠肺部被册Nl(MBl)感染后，IPlO和IFN-丫被调节为高。 运些趋化因子或者细胞因子的表达由转录因子NF-KB诱导。基于更早的发现，能够表明阿司 匹林充当NF-KB抑制剂。
[0052] 本实验的目标在于发现LG-乙酷水杨酸盐是否在H5N1感染后在小鼠肺部中充当 NF-KB抑制剂。为此，研究了在MBI感染之前或者期间用LG-乙酷水杨酸盐处理小鼠是否在两 种趋化因子或细胞因子的表达率上有影响。对于该实验，在感染(感染剂量：lxl0 3pfu/50y iH.v.aO化1)和i.P.(200iil))前一小时，五只Ba化/c小鼠均用50mM LG-乙酷水杨酸盐处 理。进一步的处理在感染后17、24和42小时实施。在48小时p.i.后，取出肺部并分离出RNA。 将用LG-乙酷水杨酸盐处理的小鼠的小鼠肺部中的IPlO和IFN- 丫表达与对比动物的比较借 助定量的RT-PCR验证。数据示出在图9中。
[0053] 未处理小鼠的IPlO和IFN-丫的表达被设定为100%，W能够更清楚地进行比较。在 经静脉和腹膜内处理途径用LG-乙酷水杨酸盐处理4次后，对于趋化因子和细胞因子两者均 能检测到m-RNA表达的下降。静脉内处理途径显示出62 %的IP10下降和68 %的IFN- 丫下降， 其效果高于腹膜内处理途径中26%的IPlO下降和50%的IFN- 丫下降。
[0054] 所述结果表明册Nl病毒诱导的NF-KB依赖性基因表达在用LG-乙酷水杨酸盐处理 的感染小鼠肺部中强烈下降。运是重要的，因为在H5N1病毒感染后观察到细胞因子的过度 产生（"细胞因子风暴"），该细胞因子在很大程度上WNF-KB依赖性的方式调节，非常有助于 运些病毒的致病性。因此，LG-ASA不仅能直接影响病毒复制，而且还能通过降低过度的细胞 因子产生W积极方式间接影响疾病过程。
[005引实施例6:相容性研究。
[0056] 在下面实验中，测试了在气溶胶处理小鼠后LG-乙酷水杨酸盐的相容性。为了尽可 能精确地监测处理的影响，所述实验借助小鼠监测系统进行。运允许实时测量溫度。每5分 钟测定和绘制一个溫度值（图10A-F)。此外，所述动物每天称重。在处理结束后，杀死小鼠， 并测定肝脏和脾脏的器官重量。在肝毒性的第一迹象中，已经导致肝脏的尺寸增大。另一方 面，脾脏的尺寸增大是发炎过程的迹象。
[0057] 对于相容性研究，在处理前3天，将小鼠监测发射机植入总共12只雌性Ba化/c小鼠 中。在3天内监测到成功的介入。然后，6只小鼠各通过化ri喷雾器每天用2ml的50mM LG-乙 酷水杨酸盐溶液处理S次。6只小鼠充当对照，其用