含有一种细胞培养基的美容品或皮肤药用组合物的制作方法

含有一种细胞培养基的美容品或皮肤药用组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及含有一种细胞培养基的美容品或皮肤药用组合物，特别是一种含有一种调理细胞培养基或其提取物的美容品或皮肤药用组合物，所述的培养基能够通过与至少一种消化道细胞培养物和至少益生菌微生物接触获得。本发明也涉及调理细胞培养基改善皮肤动态平衡的用途。
【专利说明】含有一种细胞培养基的美容品或皮肤药用组合物
[0001]本申请是申请号为200810092072.8，申请日为2008年2月25日，发明名称为“含有一种细胞培养基的美容品或皮肤药用组合物”的中国专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及一种调理(conditioned)培养基和它的用途，特别是改善皮肤或粘膜动态平衡。本发明因此涉及在美容品或皮肤科学领域的用途，但本发明也涉及在重建皮肤、制备方法领域和其因此可以被根据本发明的调理培养基或其提取物改良的性质。
【背景技术】
[0003]人类皮肤由两层组成，称为表层，上皮层，和深层，真皮层。
[0004]表皮主要是由三种类型的细胞构成的，即角质化细胞(主要的)、黑色素细胞和郎格罕氏(Langerhans )细胞。这些细胞类型中的每一个借助它固有的功能在人体内皮肤位置起到重要的作用，特别是保护人体对抗外来攻击的作用。真皮为表皮提供牢固的支撑。它也是供养要素。它主要由成纤维细胞和细胞外基质组成，它本身主要是由胶原、弹性蛋白和基质构成。其中也可以找到白细胞、肥大细胞和组织巨噬细胞。最后，血管和神经纤维横贯真皮层。
[0005]皮肤构成了一个屏障对抗外来攻击，特别是:化学的、机械的和感染性的攻击，和在这方面，在这里发生的对抗环境因素(气候、紫外线、烟草、污染、传染等等)和/或生物体内异物因素(例如，某药剂)的若干防御反应。
[0006]因此，保持或重建它的多种功能的完整性和平衡是必要的，特别是细胞的更新和分化过程，或最佳湿度。一般性术语“皮肤动态平衡”指的是普通皮肤的功能和生理平衡的维持。
[0007]因此，需求一种维持这种皮肤动态平衡的具有新颖性的方法，特别是维持屏障功能，或对抗皮肤脱水或衰老的症状。
[0008]也需要一种改良的培养基，该培养基能够使制备单细胞、多细胞或单层模型或以重建组织形式的模型成为可能，且特别是从皮肤细胞以制备角化细胞培养物、成纤维细胞、角化细胞/黑素细胞共同培养物或重建皮肤。
[0009]这些目的和其他的一些目的都通过“细胞”培养基或其提取物(也称作调理培养基)的用途实现。
[0010]专利申请WO 02/098365 (高级组织科学)给出了调理培养基用于美容品或药物应用的用途。调理培养基是通过培养人皮肤细胞获得的，特别是成纤维细胞或角质化细胞。这些细胞被遗传性的修饰以增加它们生长因子或培养基中抗氧化剂的产量，其通常包含可溶性胶原。
[0011]US2005/0249691描述了美容品或皮肤用组合物，包括与凝胶基质结合，用于皮肤或角质层细胞的培养基；组合物必须包含胶原、壳聚糖和氨基多糖。
[0012]US2006/0182701还描述了美容品或皮肤用组合物，包括用于皮肤细胞的培养基。其目的的是为组合物的施用的皮肤细胞提供一个培养基，所述培养基将允许皮肤细胞按其在体外被获得的类似方式生长。
[0013]出人意料的，本发明发现，以完全不同于皮肤细胞的细胞调理的培养基可以被用于促进皮肤的或它的附属物保持完好状态，

【发明内容】

[0014]因此，本发明的目的是一种含有调理细胞培养基或其提取物的美容品或皮肤药用组合物，所述的培养基能够通过与至少一种消化道细胞培养物和至少益生菌微生物接触获得。
[0015]有益的，细胞培养基，根据本发明还可以称为调理培养基，可以通过接触外周血细胞,或源于外周血细胞的细胞来获得。这些细胞特别是白细胞，但也可以选自永生细胞株，来源于血细胞系，例如来自单核细胞；这些细胞非限定性的实施例是由LGCPromochem按照下列名称出售的那些:
[0016]SC(ATCC:CRL-9855)
[0017]AML-193(ATCC:CRL-9589)
[0018]THP-1(ATCC:TIB-202).[0019]这些外周血细胞或它的派生物，例如白细胞可以，例如，在消化道细胞的培养基的培养物中。
[0020]优选的，这些白细胞主要包含淋巴细胞，但还可以包含其他外周血细胞例如单核细胞，其被与培养基接触。
[0021]根据本发明一 个有益的实施例，消化道细胞培养物是三维培养物。
[0022]被用于实现本发明的消化道细胞可以来源于消化道的不同部分，例如食管、胃或肠。有益的，使用来源于肠道上皮的细胞；这种肠道上皮细胞是本领域技术员已知的。作为非限定性的实施例，肠来源的人细胞制备的称为CaC02、HT29或T84。
[0023]相应的株被保藏在ATCC的培养物保藏中心，编号如下:
[0024]Caco2:ATCCN0.HTB-37
[0025]HT29:ATCCN0.HTB-38
[0026]T84:ATCCN0.CCL-248
[0027]对于本发明的目的的，术语“益生菌微生物”是用来意指一个活的微生物，其被使用足够数量时，对它的宿主的健康具有积极的效果，“joint FA0/WH0 Expert Consultationon Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotic in FoodIncluding Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria (联合 FA0/WH0 专家鉴定食物中益生菌对健康的价值和营养性质，包括具有活乳酸菌的奶粉)，2001年10月6日”，并且其可以特别改善肠道的微生物平衡。
[0028]益生菌可以用活细胞混悬液的形式引入细胞培养基，其浓度可以由本领域技术人员根据混合物其他成分的量来调整。作为启示，可以使用包括大约IO4到109cfu/ml的接种物(cfu表示“集落形成单位”，即“能形成一个集落的单位”),优选至少105cfu/ml。益生菌接种物可以通常浓度为大约IO6到107cfu。
[0029]适合本发明的微生物可以特别选自子囊菌(ascomycetes)例如酵母(Saccharomyces)、耶罗威亚酵母(Yarrowia)、克卢费氏酵母属(Kluyveromyces)、有抱圆酵母属(Torulaspora)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、德巴利酵母属(Debaromyces )、假丝酵母(Candida)、毕赤氏酵母(Pichia)、曲霉(Aspergillus)和青霉菌(Penici 11 ium)，和如下属的细菌:双歧杆菌属(Bifidobacterium)、畸形菌体(Bacteroides)、梭菌属(Fusobacterium)、蜜蜂球菌属(Melissococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)λ 肠球菌(Enterococcus)、乳酸球菌属(Lactococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、消化链球菌属(Peptostrepococcus)、杆菌(Bacillus)、小球菌属(Pediococcus)、微球菌(Micrococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、魏斯氏菌属(Weissella)、气球菌属(Aerococcus)、乳球菌属(Oenococcus)或乳杆菌属(Lactobacil Ius )，和其混合物。
[0030]作为最适合于本发明的子囊菌(ascomycetes)，特别的提及耶罗威亚酵母(Yarrowialipolitica)和乳酸克鲁维斯酵母(Kluyveromyces Iactis)，以及有抱圆酵母属(Torulaspora)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、假丝酵母(Candida)和毕赤氏酵母(Pichia)，或者可替换的酵母，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或酵母菌(boulardii)。
[0031]关于益生菌微生物，通常使用下列细菌和酵母属:
[0032]—乳酸菌(lactic acid bacteria):其通过发酵糖产生乳酸。它们按照形态学被分为两个群:
[0033]?乳杆菌类(Lactobacillus species):嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus (LC1，NCFB 1748));乳酸杆菌(amylovorus)、干酪乳杆菌(casei (Shirota))、鼠李糖乳杆菌(rhamnosus (strainGG))、短乳杆菌(brevis)、卷曲乳杆菌(crispatus)、德氏乳杆菌(delbrueckii (保加利亚亚种subsp bulgaricus，lactis))、发酵乳杆菌(fermentum)、瑞士乳杆菌 (helveticus)、鸡乳杆菌(gal I inarum)、格氏乳酸杆菌(gasseri johnsonii)、副干酪乳杆菌(paracasei)、植物乳杆菌(plantarum)、罗伊氏乳杆菌(reuteri)、鼠李糖乳杆菌(rhamnosus)、唾液乳杆菌(salivarius))、消化乳杆菌(alimentarius)、弯曲乳杆菌(curvatus)、干酪乳杆菌干酪亚种(casei subsp.Casei)、清酒乳杆菌(sake)；
[0034]# Gocc1:肠球菌(Enterococcus)(粪肠球菌 faecalis、尿肠球菌 faecium)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis (subspp Iactis或cremoris))、肠膜明串珠菌葡聚糖亚种(Leuconstoc mesenteroides subsp dextranicum)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、嗜酸芽抱乳酸菌(Sporolactobacillus inulinus)、 Streptococcussalvarius subsp.Thermophilus、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)、木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)；
[0035]一双歧杆菌或双歧杆菌属类:青春双歧杆菌(adolescentis)、动物双岐杆菌(animal is)、两歧双歧杆菌(bifidum)、短双岐杆菌(breve)、乳双歧杆菌(lactis)、长双歧杆菌(longum)、婴儿双歧杆菌(infantis)、假小链双歧杆菌(pseudocatenulatum)；
[0036]一其他生成孢子的细菌:杆菌(Bacillus) (Toyo菌cereus var toyo或枯草芽孢杆菌subtil is)、凝结芽胞杆菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、Escherichia coli strain nissle、费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)。
[0037]特定的益生菌微生物实施例是青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescent is)、动物双岐杆菌(Bifidobacterium animal is)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus (LCI，NCFB1748));食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei (Shirota))、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus (GG菌株))、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii (保加利亚亚种 subsp bulgaricus, lactis))、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、鸡乳酸杆菌(Lactobacillus gal I inarum)、格氏乳酸杆菌(Lactobacillus gasseri )，Lactobacillusjohnsonii λ 副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)λ 罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri )、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)λ 唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、消化乳杆菌(Lactobacillusalimentarius)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus casei subsp.casei)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、肠球菌(Enterococcus (类肠球菌 faecalis、尿肠球菌 faecium))、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis (subspp lactis或cremoris))、肠膜明串珠菌葡聚糖亚种(Leuconstoc mesenteroides subsp dextranicum)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、嗜酸芽抱乳酸菌(Sporolactobacillus inulinus)、Streptococcussalvarius subsp.Thermophilus、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)、木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)、酵母(Saccharomyces (cerevisiae 或其他的 boulardii))、杆菌 Bacillus (Toyoi 菌 cereusvar toyo或枯草芽孢杆菌subtil is)、凝结芽胞杆菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、Escherichia coli strain nissle 和费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii),和它们的混合物。
[0038]有益的，至少一 个益生菌微生物是选自乳酸菌(lactic acid bacteria)、双歧杆菌(bifidobacteria)和酵母菌(Saccharomyces yeasts)的。
[0039]更特别的，它们是来源于乳酸菌群的益生菌微生物，例如尤其是乳杆菌属和/或双歧杆菌属，特别乳杆菌属。作为这些乳酸菌的例证，更特别的可提及Lactobacillusjohnsoni1、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)λ 副干酷乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、Lactobacillus casei 或两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、动物双岐杆菌(Bifidobacterium animalis)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)或假小链双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudocatenulatum)，和它们的混合物。
[0040]最适合的种类是Lactobacillus johnsoni1、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)> 青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)和乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactisNCC2818)(也标识为Bb12ATCC27536 );还可以特别提及下列菌株，按照布达佩斯条约保藏在culturecollection of the Institut Pasteur (28rue du Docteur Roux, F_75024Pariscedexl5)的 30/06/92、12/01/99、15/04/99、15/04/99 和 07/06/05 =Lactobacillusjohnsonii(CNCM1-1225)、Lactobacillus paracasei(CNCM1-2116)、Bifidobacteriumadolescentis(CNCM1-2168)和 Bifidobacterium 1ngum(CNCM1-2 170)和Bifidobacterium lactis(CNCM1-3446)、和属 Bifidobacterium longum(BB536)。Bifidobacterium IactisCNCM1-3446 株可以获自 Hansen(Chr.HansenA/
S,10_12BoegeAlle, P.0.Box407, DK-2970Hoersholm, Denmark)。
[0041]用于与细胞接触的细胞培养基是适合所使用的不同类型的细胞存活和/或培养的任何营养培养基。其通常包含碳和氮源、矿物质、维生素和/或痕量元素，例如氨基酸、糖、蛋白质和脂肪酸。
[0042]细胞可以在它们的来源组织之外培养。为此，它们将在接近于它们在组织中的自然条件的环境下培养。这些培养在它们的培养基中需要基本的因子。该环境应该具有确定的由矿物质和生物材料组成的组合物，被称为培养基。所述培养基通常由专业的供应商提供，并且根据细胞类型具有特定的特征。培养基通常还包含适当数量的水、碳和氮源、磷酸盐和硫酸盐、矿物质、生长因子和维生素。
[0043]在这种类型的培养基种培养的细胞通常需要添加血清。所述血清具有复杂的组分，并至少为细胞提供激素、粘附因子和氨基酸。该血清可以，例如，全部或部分被本发明的调理培养基的添加所替代。事实上，调理培养基也可以另外被添加到培养基中，如同增浓。
[0044]本领域技术人员能容易的确定合适的培养基。非限定性的，可提及的有RPMI1640培养基、Dulbecco' sModified Eagle’s 培养基(DMEM)，、最小基本培养基(MEM)、M199、RPMI1640 或 Iscove’ s M odified Dulbecco's 培养基(EDMEM)、Ham’ sF_12、Ham’ sF-10、NCTC109 和 NCTC135。
[0045]这些培养基可以以通常被用于细胞培养的任何添加剂补充，例如，非限定性的，磷脂前体、非必需氨基酸、核酸、维生素、抗生素、酶辅助因子、无机盐、胰岛素、转铁蛋白、三碘甲腺原氨酸、乙醇胺、O-磷酸乙醇胺或生长因子例如神经生长因子或神经营养因子_3。
[0046]通常被用来补充细胞培养基的各种添加剂的浓度可以被本领域技术人员特别地根据被培养的细胞的类型确定和调整。
[0047]其他的培养基描述于Ham 和 McKeehan, “MethodsinEnzymology”，58:44-93，1979中，或于 Bottenstein 等，“Methods in Enzymology ”，58:94-109，1979，其内容在此引入
作为参考。
[0048]此外，还可以使用不同培养基的混合物，特别是上述培养基的，例如DMEM/HAMF12的混合物。这些培养基可以由特定生长因子补充，或例如血清，不过后一组分也可以不补充。
[0049]根据一个实施例，没有胶原被添加到培养基中。
[0050]所述培养基可以是液体、半液体、凝胶或固体，优选至少部分是液体。
[0051]措词“调理培养基的提取物”是用来特别意指通过透渗析、分馏法、相分离、凝胶过滤层析、亲和色谱法、沉淀、浓缩、冻干法等方法得到的所述调理培养基的部份或亚化合物。
[0052]调理培养基可以从缺少血清和动物产品的培养基中产生。该调理培养基优选在存在人白细胞的情况下(并且特别是乳杆菌属或双歧杆菌属类的益生菌存在下)由消化道细胞的刺激之后得到，具有益生菌。
[0053]有益的，被用于本发明组合物的培养基(或它的提取物)是稳定了的培养基，即，它已经经受了用于保存其在选择的给定瞬间的状态的操作，通常是在制备过程的最后，同时已经保存了它的固有性状。特别的，该操作是用来使所述培养基变得无菌的，即，能够抑制微生物生长，同时保存了其具有的生物学性质。培养基的稳定可以通过本领域技术人员已知的任何方法获得，例如，灭菌过滤、高压蒸汽灭菌、超高温(UHT方法)、高压灭菌、Y -辐射或冷冻。根据本发明的条件培养基通常包含IL-10，其不存在于起始培养基的任何组分中。IL-10的量可以根据条件培养基的制备情况改变，但通常相应的在与不同细胞型接触之后回收的培养基中的浓度大于或等于20pg/ml。
[0054]预料不到的是该调理培养基具有对皮肤和/或体表(integument)有益的性质。
[0055]为此原因，本发明的目的也在于通过与如上所述的至少一种消化道细胞培养物和至少益生菌微生物接触获得的至少一种调理细胞培养基，或一种所述细胞培养基的提取物作为一种改善皮肤和/或体表动态平衡的制剂的美容品用途。
[0056]有益的是调理培养基可以通过进一步与外周血细胞或它的类似细胞特别是白细胞接触获得。
[0057]在本文的描述中，除非另作说明，术语“皮肤”是用来意指覆盖人体的全部外层部分，即，皮肤、粘膜和头皮。
[0058]术语“体表”指的是指甲、头发和体毛，例如睫毛。
[0059]特别地，本发明涉及一种培养基或它的提取物用作改善皮肤或头皮的屏障功能的制剂的用途。
[0060]根据本发明的另一方面，培养基或它的提取物是用作改善皮肤或头皮湿度的制剂。
[0061]该培养基可以因此被特别用于对抗皮肤干燥症状，特别是干燥和敏感皮肤。
[0062]通常，敏感皮肤是通过皮肤的特殊反应界定。
[0063]这种皮肤反应通常通过不适症状表现反映出来的，这些不适症状是对于接触到具有不同根源的触发因素的个体的反应。这可以是在敏感皮肤表面应用美容品、食物摄取、或暴露在温度急剧变化中、暴露在大气污染中和/或暴露在紫外线或红外线。相关因素诸如年龄和皮肤类型也存在。因此，敏感皮肤更通常是指基于美容品标准的皮肤分类的干性或油性皮肤。具有敏感皮肤的个体因此属于具有易刺激或过敏的皮肤，或具有耐受力低的皮肤。
[0064]这些不适症状的表现，记载在下述接触到具有不同根源的触发因素的个体的记录中的，是敏感皮肤的必要症状之一。它主要包括了触物感痛性触觉。术语“触物感痛性触觉”是指在一片皮肤上的感觉，如刺痛、痒、灼热感、紧绷感等。这些主观感受的症状大多通常缺少可见的化学性症状表现如发红或脱皮，并且无论如何也不会出现水肿。当今公知的是这些皮肤易刺激反应和耐受力低的反应都特别是与上皮和真皮的神经末稍释放的神经肽相关。[0065]在这些皮肤敏感的急性表现中，神经反应可能被触发。它的长期结果可以导致炎症反应和痛觉过敏反应持续，并因此导致该过程转成慢性化。
[0066]不象记载的过敏皮肤那样，敏感皮肤的反应表现并不是免疫反应过程的结果，SP，过敏反应的应答不仅发生在已经发生敏化的皮肤上。它的应答机制是术语“非特异性”。在这个方面，它是与皮肤病、湿疹和/或鱼鳞癣症的明显炎症和过敏反应区别开的。
[0067]在本发明的情况下，调理培养基具有阻断和/或治疗所述的敏感皮肤的作用，特别是当这种敏感皮肤与干性皮肤相关时。干性皮肤必然有紧绷和/或拉紧的感觉表现。它通常与皮肤湿度的下降和屏障功能的损伤相关，其通过微小的水分流失测量。
[0068]象上面特别指出的，敏感皮肤是不同于过敏皮肤的。它的反应表现不是免疫反应过程的结果，通常仅仅是触物感痛性触觉的反应，可能伴有发红，但是没有肿胀和水肿。
[0069]“敏感皮肤”可以特别使用工具评价皮肤的敏感反应来确定。第一个工具是基于他们的正确设计，基于干燥皮肤的必要特征性症状，即这些不适症状的存在是由典型的施用外物所导致。因此，乳酸“刺激试验”是第一个建议测试的项目。试验通过记录志愿者在鼻翼施用10%乳酸后的刺激反应来完成。个体中表现出中等或强刺激反应者称之“刺激者”，并被认为具有敏感皮肤。由于这种局部使用某种产品的皮肤的敏感性，这些个体被选用于测试“敏感皮肤”产品。更近以来，为了特定地刺激涉及不适症状和所谓的伤害感受器的外周神经末梢，最近的定义涉及敏感皮肤，最新的试验已经被建议为精确使用其他造成不适的刺激剂，如辣椒素，特别是在申请EPl 374 913中的。为了本发明的目的，术语“敏感皮肤”覆盖了易刺激和耐受力低的皮肤。
[0070]耐受力低的皮肤是那种对不同因素如美容品或皮肤药用产品或肥皂反应的皮肤，反应通过灼热感、紧绷感、刺痛感和/或发红表现。
[0071]易刺激皮肤是那种通过瘙痒或通过刺痛表现的对不同因素如环境、感情、饮食、风、摩擦、刮胡须、高钙成分 的硬化水，温度变化、湿度或羊毛制品反应的皮肤。
[0072]这两种类型的皮肤通常与皮肤的干燥相关联，与干屑相关或无关，或与表现出红斑的皮肤相关。然而，耐受力低的皮肤也可以是与痤疮皮肤相关，或者甚至是与表现红斑狼疮的皮肤相关，与干屑相关或无关。
[0073]如上所述，皮肤的干燥通常与皮肤湿度的下降相关，通过角质仪(corneometryHf价，还与屏障功能的损伤相关，通过微小的水分流失测量。
[0074]干性皮肤必然有紧绷和/或拉紧的感觉表现。所述皮肤也应该有触觉和表现出覆盖有皮屑。当皮肤轻微干燥时，这些皮屑数量丰富，但是肉眼不可见。
[0075]这种皮肤干燥的原因可以是体质类型原因或后天形成类型的原因。
[0076]在这种后天形成的干性皮肤中，涉及的外部因素是具有决定性的，如暴露在化学试剂中，暴露在恶劣的气候条件中，或者暴晒下，或者可替换的一定治疗剂的治疗(如类维生素A)。在这些外部影响下，皮肤随后可以变得暂时和局部干燥。这可以涉及任何类型的皮肤。
[0077]这种非病理性的干性皮肤体质的情况中，干燥状态的严重性取决于已经提到的外部因素。老年的皮肤(随着年龄增长皮肤的新陈代谢出现通常的衰退为特征)、脆弱的皮肤(对外部因素非常敏感，并通常以红斑和红斑狼疮为表现)和普通干燥病(很可能是遗传原因并主要表现在面部、手侧部和手背部)都属于这种皮肤类型范畴。可以理解的是干性皮肤状态是一种生理状态，它独立于任意的生理表现，符合正常皮肤标准，这种生理状态的舒适度与表现需要通过美容品手段得到改善。
[0078]本发明的组合物、方法和用途因此被证明对于阻止和/或治疗敏感的和/或干性皮肤是最为特别有效的，和更特别地对那些涉及的反应性、易刺激性和/或耐受性差、后天形成的干性皮肤和/或先天性干性皮肤。
[0079]本发明的目的也是调理培养基的用途或它的提取物的用途，为对抗衰老症状，不管是实际年龄上的衰老还是由光诱导的衰老。
[0080]随着时间的流逝，固有衰老的非常典型的不同症状表现在皮肤上，特别是反映在皮肤结构和功能上的改变。其他的成因都是外部的(Yaar和Gilchrest，J InvestDermatol, 1998)。事实上,衰老可以由于环境因而加速，例如皮肤反复暴露在日晒中，和特别是在紫外线A和B辐射，皮肤反复暴露在污染中，特别是在柴油颗粒中，和皮肤反复暴露在香烟环境中。
[0081]大气污染对皮肤结构(纤维、细胞、酶)的毒害作用，特别是油气污染如二氧化硫、臭氧和氧化氮，特别涉及它们的对自由基的初始活性，它们是导致生物细胞损伤的氧化环境的根源。这种损伤导致皮肤衰老的加速。
[0082]皮肤衰老的表现特别在于起皱纹和直纹、皮肤松弛或张力下降。
[0083]本发明的其中一个目的是调理培养基或其提取物用于或用在组合物的制备中的用途，调理培养基、其提取物和/或组合物用于改善皮肤动态平衡和/或皮肤的屏障功能和/或皮肤、头皮和/或皮肤体表的湿度。
[0084]本发明的目的也是改善皮肤动态平衡和/或屏障功能和/或皮肤湿度或头皮湿度的美容方法，特征是至少一种细胞培养基或至少一种培养基提取物或含有相同组分的组合物施用到皮肤或头皮上，所述培养基如上文记载的那样，能够通过与至少一种消化道细胞培养物和至少益生菌微生物接触获得。
[0085]根据另一方面，发明涉及了至少一种细胞培养基或至少一种培养基提取物用于制备治疗和/或阻断肌肤紧张症状表现的组合物的用途，所述培养基能够通过与至少一种消化道细胞培养物和至少益生菌微生物接触获得，如上文限定的那样。这样的组合物可以是一种美容品或制药用途的组合物，特别是一种皮科药用制剂组合物。
[0086]组合物中的本发明的调理培养基或其提取物的用量可以被本领域技术人员调整以便获得预期的效果。有效量可以因此通过常规技术手段确定，包括体外试验和体内测试，特别是取决于使用的提取物的类型和选定的配方的类型。
[0087]通过指定，调理培养基活性物质的浓度相对于组合物的总重量可以在0.001%至50重量％之间，特别是少于或等于10%，这些量可以在没有任何不利因素的前提下变化。
[0088]根据本发明的组合物还包含生理可接受的培养基，特别是一个美容品或药学可接受的培养基。
[0089]对于本发明的目的，术语“美容品组合物或产品”是用来特别意指任何用于与人体的各种表面部分(表皮、头发和体毛系统、指甲、口唇和外生殖器)、或牙齿或口腔粘膜接触的物质或制剂，用于专门的或主要的，来清洁它们、来芳香它们、改变它们的外观和/或矫正体味和/或保护他们或使它们维持在好的状态(Cosmetic Guideline (美容品指南)76/768/EEC 修正版)。[0090]这些组合物通常具有一种能用在人体皮肤上使人愉快的气味和外观。
[0091 ] 优选的，本发明的组合物是被应用到皮肤或粘膜上的。
[0092]根据考虑到的使用的方法，其可以是任何通常使用的植物制剂的形式。
[0093]为了局部施用到皮肤或粘膜，特别地，组合物的形式可以是洗液或血清类型的水或油溶液或分散体、通过在水相中分散油类(0/W)或反之亦然(W/0)获得的乳液类型的液体或半液体稠度的乳剂、或具有水或无水乳膏或凝胶类型的具有柔软状态的性质的混悬液或乳剂、或微囊或微粒、或离子的和/或非离子类型的泡状的分散体、或泡沫。它们的形式也可以是用于控制释放的微球或纳米球或脂囊泡或高分子微泡或高分子修补剂和水凝胶。
[0094]根据一个有益的实施方案，所述组合物是皮肤美容品组合物，包含根据本发明的至少一种调理培养基或一种提取物在美容品或药物可接受的载体中，比例按重量计为相对于组合物的总重量的至少0.001%，并优选从0.05%到3%。
[0095]这些组合物按照常用的方法制备。
[0096]根据本发明的组合物中各种组分的用量是按照本领域的常用量考虑使用的。其组分和用量优选不会影响调理培养基或它的提取物的活性，即降低所述活性。
[0097]在美容品领域，特别地，这些组合物组成用于脸、用于手、用于脚、用于大的组织皱裙或用于身体的清洁、保护、治疗或护理乳膏(例如，日霜、晚霜、卸妆霜、粉底霜、防晒霜)，粉底液、卸妆乳、护肤乳或护理液、防晒乳、皮肤护理洗液、凝胶或泡沫，例如清洁洗液、人工晒黑洗液、沐浴组合物、包含杀菌剂的除臭组合物、或须后凝胶或洗液。
[0098]根据本发明的组合物也可以制备成固体形式，制成肥皂或洁肤皂。
[0099]组合物还可以包装成气雾剂组合物的形式，也包括挤压输送的推进剂。
[0100]根据本发明的组合物还可以是头皮护理组合物，特别是洗发剂、头发定型水、治疗性洗液、定型胶或定型膏、生发洗液、防脱发洗液或凝胶、抗寄生虫洗发剂、去头屑洗发剂等
坐寸ο
[0101]组合物还可以用于口牙用途，例如牙膏。在这种情况下，组合物可以包含通常用于口腔用组合物的常规辅料和添加剂，特别地，和表面活性剂、增稠齐?、湿润齐?、磨光剂例如二氧化硅、各种活性成分例如氟化物、特别是氟化钠、和可选择的甜味剂例如糖精钠。
[0102]当组合物是乳剂时，油相的比例按重量计相对于组合物的总重量可以从大约5%到80重量％变化，和优选按重量计从大约5%到50%。用于乳剂形式的组合物的油、蜡、乳化剂和辅助乳化剂是选自美容品领域常规使用的种类。在组合物中，乳化剂和辅助乳化剂按重量计相对于组合物总重量以从0.3%到30%的比例存在，和优选按重量计从0.5%到20%。乳剂还可以包含脂囊泡。
[0103]当组合物是油性溶液或凝胶时，油相可以以超过组合物总重量90%的比例存在。
[0104]以已知的方式，美容品组合物还可以包含美容品领域常用的辅料，例如亲水的或亲脂性的胶凝剂、亲水的或亲脂性的添加剂、防腐剂、抗氧化剂、溶剂、芳香剂、填料、遮蔽剂、气味吸收剂和染料。这些各种辅料的用量是美容品领域的常用量，和，例如，范围是从组合物总重量的大约0.01%到10%。依赖于它们的自然特性，这些辅料可以被被引入油相、弓丨入水相和/或引入脂质小球中。
[0105]作为可以被用于本发明的油或蜡，可提及到矿物油(液体石蜡)、植物油(牛油树脂的液体部份、向日葵油)、动物油(全氢化角鲨烯)、合成油(普赛林)、硅油或蜡(环甲硅油)和氟代油(全氟聚醚)、蜂蜡、巴西棕榈蜡或石蜡。脂肪醇和脂肪酸(硬脂酸)也可以被添加到这些油中。作为可以用于本发明的乳化剂，提及到的乳化剂可以是，例如，硬脂酸甘油酯、聚山梨酸酯60和由Gattefosse公司以Tefose? 63出售的PEG-6/PEG-32/硬脂酸乙二醇酯的混合物。
[0106]作为可用于本发明的溶剂，提及到低级醇，特别是乙醇和异丙醇、和丙二醇。
[0107]作为可用于本发明的亲水胶凝剂，提及到羧基乙烯聚合物(Gaitemei.*)、丙烯酸
共聚物例如丙烯酸酯/丙烯酸烷基酯共聚物、聚丙烯酰胺、多糖例如羟丙纤维素、天然的胶质和粘土，和作为亲脂性的胶凝剂，提及到改良粘土例如有机皂土、金属脂肪酸盐例如硬脂酸铝、疏水性二氧化硅、乙基纤维素和聚乙烯。
[0108]在根据本发明的皮肤美容品组合物中，调理培养基提取物可以联合类视黄醇或皮
[0109]根据本发明的皮肤美容品组合物还可以包含惰性的或乃至药效或美容活性的添加剂或这些添加剂的组合，且特别是:润湿剂、脱色剂例如氢醌、壬二酸、咖啡酸或曲酸；软化剂；润湿剂例如甘油、PEG-400或尿素；抗衰老剂、抗皮脂溢剂或抗痤疮剂，例如S-羧甲基半胱氨酸、S-苯甲基巯基乙胺、它们的盐和它们的衍生物，或苯甲酰过氧化物；抗生素例如红霉素和其酯、新霉素、氯洁霉素和其酯、四环素；抗真菌剂例如酮康唑或4，5-聚亚甲基-3-异噻唑；促进毛发再生的药剂，例如米诺地尔(2，4- 二氨基-6-哌啶基嘧啶-3-氧化物)和其衍生物、二氮嗪(7-氯-3-甲基一 1，2，4-苯丙噻二嗪1，1- 二氧化物)和苯妥英(5，4-二苯基咪唑啉-2，4-二酮)；非甾体类抗炎剂、类胡萝卜素，和特别的β —胡萝卜素；牛皮癣治疗剂例如蒽林和 其衍生物，和，最后的二十碳-5，8，11，14-四烯酸和二十碳-5，8，11-trynoic酸、其酯和酰胺。
[0110]抗衰老剂特别指的是抗糖化剂、NO-合酶抑制剂、或刺激表皮或真皮高分子的合成或阻断它们的降解的制剂、或刺激成纤维细胞或角化细胞增殖和/或角化细胞分化的制剂。
[0111]术语“湿润剂”倾向于指的是:
[0112]一或者一种用以维持角质层的湿度的呈现屏障功能的化合物，或一种闭合化合物。提到的可以有神经酰胺、鞘氨醇碱基化合物、卵磷脂、鞘糖脂、磷脂、胆固醇和它的衍生物、植物留醇(豆留醇、β —谷留醇、菜油留醇)、必需脂肪酸、1，2-甘油二酯、苯并二氢吡喃-4-酮、五环三萜烯如熊果酸、凡士林油和羊毛脂；
[0113]一或直接增加角质层含水量的化合物，如海藻糖和它的衍生物、透明质酸和它的衍生物、甘油、戊二醇、Pidolate钠、丝氨酸、木糖醇、乳酸钠、聚甘油基丙烯酸酯、依克多因与其衍生物、壳聚糖、低聚糖和多糖、环状碳酸酯、N-月桂酰吡咯烷酮羧基酸和Ν-α -苯甲酰-L-精氨酸；
[0114]一或活化皮脂腺的化合物，如类固醇衍生物(包括DHEA)和维生素D与其衍生物。
[0115]这些化合物可以以本发明组合物总重量的0.001%到30%存在，并且优选是从
0.01% 到 20%ο
[0116]适用于本发明的NO-合酶抑制剂的例子包括，特别是葡萄属(Vitisvinifera)植物的提取物,特别是Euromed公司销售的名称为无色花青素葡萄干上等品
(Leucocyanidines de raisins extra),或是 Indena 公司销售的名称为 LeuCOSeleCt?
的，或，最后，是Hansen公司销售的名称为Extrait de marc de raisin的；橄榄(oleaeuropaea)植物的提取物，优选自橄榄树叶和特别是VINYALS公司销售的为干提取物形式的，或 Biologia & Technologia 公司销售的商品名为 Eurol BT ;和银杏(Ginkgo biloba)植物提取物，优选是Beaufour公司销售的该植物干燥的水提取物商品名为Ginkgo bilobaextrait standard。
[0117]在这些用于促进表皮高分子或阻断它们的降解的活性剂中，提及的那些作用为:
[0118]一或者胶原合成，例如积雪草的提取物；积雪草苷与其衍生物；抗坏血酸或维生素C及其衍生物,如维生素C醣苷(Hayashibara公司销售)；人工合成肽如iamin、Sederma公司销售的商品名为“Biop印tideCL”的棕榈酰三肽甘氨酸-组氨酸-赖氨酸；从植物中提取的肽类，如Coletic公司销售的商品名为Phytokine?的大豆水解产物；大豆纤维提取物，如Silab公司销售的名称为“Raffermine”的；植物类激素如生长素和木脂素；特别是Sederma公司销售的名称为“Matrixyl”的棕榈酰五肽赖氨酸-苏氨酸-苏氨酸-赖氨酸-丝氨酸；二甲基氨基乙醇；柴胡(Bupleurum chinense rhizome)提取物，如Sederma公司以名称“Pleurimincyl”和“Lipocare”销售的；特别是用棕榈酰基酰化的小麦蛋白水解物，如S印pic公司销售名称为“Lipacid PVB”的产品；辅酶QlO ;维生素A、二棕榈酰羟基脯氨酸，特别是S印pic公司销售名称为“SepiliftDPHP"的产品，和含有异黄酮的红三叶草(Trifolium Pratense)提取物。
[0119]—或者弹性蛋白合成,例如LSN公司销售的商品名为CytovitillA'的Saccharomyces
cerivisiae的提取物；和Secma公司销售的商品名为KtMp;KHicvD的alga Macrocystispyriferra的提取物；
[0120]一或者粘多糖合成，如牛奶通过变形乳杆菌(lactobacillus vulgaris)发酵得到的产品，为Brooks公司销售的商品名为的' yogourth?的;Alban MUller公司销售的商品名为 HSRV: 的褐色alga Padina pavonica ;以及 Saccharomyces cerivisiae 提取物特别从
Silab公司购得商品名为PjrmaIifIi*或从LSN公司购得商品名为Cytovithi%
[0121]—或者纤维粘连蛋白合成,如Seporga公司销售的浮游生物Salina的提取物,其商品名为GP4(T:可获得的酵母提取物可以特别地从Alban Muller公司购得，其商品名为
Drieline*: Sederma公司销售的棕榈酰五肽，其商品名为Matrkif5
[0122]一或者在表皮-真皮交界处存在的化合物合成(如胶原Vn和/或IV和/或昆布氨酸)，例如二棕榈酰羟基脯氨酸，特别S印Pic公司销售的商品名为“S印pilift DPHP”，或phytosteryl硫酸酯，如Vincience公司销售的商品名为“Phytocohesine” ；
[0123]一或金属蛋白酶抑制作用(基质金属蛋白酶或MMP)，例如更特别地是MMP1，2，3或9。可以提及的是:类维生素A及其衍生物、寡肽和脂肽、脂氨基酸、Coletica公司销
售的商品名为的CoHniilf的麦芽提取物；蓝莓或迷迭香提取物；番茄红素；异黄酮、它们的衍生物或含有它们的植物提取物，特别是指大豆提取物(IchimaruPharcos公司销售的商品名为Havosleronc SlTl的产品)红三叶草提取物(例如Saderma公司销售的商品名为wSterocaisftI的产品)、亚麻提取物、虎耳草或香紫苏提取物；姜黄素提取物;豨莶属植物提取物(例如Saderma公司销售的产品)；
[0124]一丝氨酸蛋白酶抑制作用，如白细胞弹性蛋白酶或组织蛋白酶G。可以提及的可以是:豆类种子的肽提取物(Pisum sativum)，购自LSN公司，商品名为Parcbstyf;类肝素；
和假二肽如{2-[乙酰基-(3-二氟甲基苯基)氨基]-3-甲基-丁酰氨}乙酸。
[0125]本发明组合物也可以含有防腐剂，如对羟基苯甲酸酯、稳定剂、湿润剂、乳化剂、UVA和UVB遮盖剂和抗氧化剂，如α -生育酚、丁基羟基苯甲醚或丁基羟基甲苯。
[0126]本发明涉及的另一方面，涉及了至少一种细胞培养基的用于制备一种细胞和/或组织培养基用途或至少一种细胞培养基提取物的用途，如上述限定的，所述培养基通过与至少一种消化道细胞培养物和至少益生菌微生物接触获得。本发明的调理培养基或其提取物可以因此在细胞培养系统中被用作辅助成分，特别是改善三维空间系统和获得最佳培养条件用于淹没系统或暴露系统中的培养。特别地，调理培养基和/或其提取物(和/或含有它们的组合物)可以被用于一种体外皮肤等同物的制备。
[0127]事实上，调理细胞培养基及其提取物可以优选被单独使用或与常规培养基混合使用，用于体外培养细胞，特别是皮肤细胞如角化细胞。
[0128]这样的培养系统已经特别被记载，例如在专利ΕΡ285471、ΕΡ789074或ΕΡ857971中，并包括在载体上的一个较多的或较少的分化的角质化细胞的三维培养物。培养物中也可以含有其他皮肤细胞类型，如黑素细胞、树枝状细胞或郎格罕氏细胞、成纤维细胞，但也含有神经细胞或内皮细胞。
[0129]载体可以由惰性载体组成，特别是多孔载体或半透性的载体。载体可以更特别地选自胶原基质、可选择的含有成纤维细胞和/或粘多糖、去表皮的真皮，真皮等同物、透明质酸和/或胶原和/或纤维粘连蛋白(fibronectin)和/或纤维膜，和一种惰性载体。
[0130]本发明的目的也是一种制备组合物的方法，特别是美容品或皮肤学组合物，特别的可以通过包括第一阶段的方法制备，在所述的第一阶段中制备调理培养基，可选择地制备所述调理培养基的提取物。
[0131 ] 这种方法至少包括下述步骤:
[0132]a)在第一营养培养基中的载体(特别是多孔载体)上培养来源于肠道上皮的细胞一段足够获得它们的分化的时间；
[0133]b)在覆盖有外周血细胞或其衍生物(例如白细胞)的毯状物的槽中制备第二细胞
培养基；
[0134]c)回收步骤a)结束时获得的在载体(特别是多孔载体)上的分化细胞培养物，并转移至步骤b)结束时获得的第二培养基；
[0135]d)把在第二培养基中来源于肠道上皮的所述的分化细胞的培养物与至少包括益生菌的微生物培养物相接触足够的时间，以使细胞之间产生交互作用，所述益生菌可以是，例如，乳杆菌属的(Lactobacillus species)和/或双歧杆菌属的(Bif idobacteriumspecies)；[0136]e)除去细胞培养物并回收第二细胞培养基，去除白细胞，以获得调理培养基；
[0137]f)将调理培养基，或其提取物，合并到美容品或皮肤药用组合物中。
[0138]优选的，步骤a)中的载体是多孔载体。
[0139]术语“多孔载体”是用来特别意指骨架上包括小孔的插入单元。
[0140]例如，孔径大小可以是从0.001到10 μ m，优选大于或等于0.3 μ m。
[0141]作为非限定性的例子，因此适用于本发明的多孔插入单元的骨架可以包含选择性地包括氨基多糖和/或成纤维细胞的多孔的胶原基质，透明质酸和/或胶原和/或粘连蛋白和/或纤维蛋白凝胶或薄膜、半渗透性的硝化纤维、尼龙、特氟隆、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯或聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜、半渗透性的 Anopore 无机膜、醋酸纤维薄膜、B1pore - CM?半透膜、半渗透性的聚酯薄膜和聚羟基乙酸薄膜。
[0142]在步骤a)中的接触时间可以由本领域技术人员调整，但通常在几小时和几天之间，特别是在I天和35天之间，例如从18到22天，优选大约21天。细胞初始被以单层的形式放置，因而在步骤a)结束时，得到一个具有若干层分化细胞的三维体系。有益的，培养基将被有规律地更新，例如每2天，以使来源于肠道上皮的细胞，例如Caco2细胞，获得最佳的分化。
[0143]在步骤b)中，外周血细胞或其衍生物，特别是白细胞形成了细胞的毯状物；即腔室的表面基本上均匀的覆盖了白细胞；它们可以是单层或多层的形式。
[0144]特别的，这些白细胞是收集自至少经过一个分离步骤(特别是离心分离)然后至少部分的去除单核细胞之后的血液样品。随后它们被悬浮在与它们的生存能力相适应的营养培养基中，特别是RPMI培养基。
[0145]通常，培养基可以由本领域技术人员根据他们的常识选择，特别是从上述培养基中选择。
[0146]举例来说，适合用于本发明的腔室，可提及培养平板的孔，例如通常用于细胞培养的6-、12-、24-、48_孔或96-孔细胞培养板。
[0147]有益的，在步骤c)中的转移之前，分化细胞培养物将要使用适合于白细胞生存能力的培养基洗。分化细胞和益生菌之间的接触，在白细胞参与的情况下，将要进行允许建立交互作用的时间，即在不同细胞类型之间的化学或生物学的交换。
[0148]对于本发明，措辞“细胞的化学交换”是用来表示由分子代表的所有信号，所述分子从细胞中释放并能够影响远处的另一个细胞的活性，所述的另一个细胞可以属于或不属于相同的细胞类型。非限定性的，所述分子可以，例如，是肽、蛋白质、脂质、糖、留类激素或儿茶酚胺。其可以通过分泌的形式释放。
[0149]应该理解，这种交互作用可以在没有直接物理性接触的不同细胞类型之间发生；特别的，通过安排第一、来源于肠道上皮的细胞和，第二、可以是或不是放置在单独腔室中的白细胞的细胞毯状物，依靠将它们培养在其中的培养基开始彼此交换，没有肠道细胞培养物的细胞能够与其他细胞毯状物的细胞直接接触，例如在细胞体之间或通过细胞延伸的方法接触。
[0150]有益的，益生菌微生物被在从顶端添加到肠道细胞培养物中。
[0151]适合建立这种交互作用的时段可以是几个小时到几天，通常至少6小时，优选至少10，特别的大于或等于16小时，但可以无限扩展。益生菌被，例如，与肠道细胞在包括白细胞的腔室中接触6到36小时。
[0152]随后，从所有细胞中分离回收出培养基，例如，在基底侧水平采集获得:这种培养基已经受到两种细胞类型和它们的相互关系的影响。
[0153]如同在前面表明的,这样回收的培养基，还称为“调理培养基”，包含浓度大于或相等 20pg/ml 的 IL-10，特别是从 50 到 200pg/ml。
[0154]在作为成分被引入组合物，特别是根据本发明的美容品或药学或皮肤美容品组合物之前，其随后可以经受本领域技术人员本身公知的浓缩、提取和/或分馏步骤。
[0155]美容美容
[0156]本发明组合物被特别用于正常皮肤和/或粘膜和/或受影响的皮肤和/或粘膜的治疗或预防治疗，它可以是表现皮肤、体表和/或头发疾病状态的，例如特别是:
[0157]—干性皮肤或头发，
[0158]一皮肤屏障功能的损伤，
[0159]—敏感皮肤或头发，
[0160]一细胞外基质中具有改变的皮肤，
[0161]一涉及用抗菌剂或抗真菌剂治疗的疾病，
[0162]一被激素干扰引起的 (油性皮肤)或涉及去头屑的疾病症状。
[0163]进一步，组合物可以阻止或治疗涉及年龄衰老的特定的损伤。
【具体实施方式】
[0164]本发明将在下述的实施例中更详细的说明。
[0165]在这些实施例中，参考附图，附图显示的是指标化合物渗透到不同条件下培养的重建皮肤中的条件。
[0166]实施例1:制各调理培养某
[0167]接近于人肠道上皮细胞的细胞，Caco2(在通道60和65之间)以2.5X105细胞/ml的浓度接种在25mm培养插入单元中(具有0.4 μ m的核孔，BectonDickinson, Basle, Switzerland)。这种插入单元被放置在培养皿(Nunc)中，并在37°C /10%C02 的 DMEM (包含谷氨酸胺和高浓度葡萄糖(Amimed, Allschwill, Switzerland))中培养18到22天，所述DMEM补充了非必需氨基酸(Gibco，BRL)、10mg/ml庆大霉素(GIBC0BRL)和 0.1% 的青霉素 / 链霉素(10000IU/ml 和 10000 μ g/ml) (GIBC0)。每 2 天更换一次培养基直到细胞完全分化(21天)。当Caco2细胞融合成一个单层时，使用多孔(multicell)-ERS电极(伏特计/欧姆计)不断的测量经上皮的电阻大小。
[0168]此外，通过淋巴细胞的离心，从无关的正常供血者的周围血液中分离来自于正常志愿者的血白细胞。细胞悬液(IO7细胞/ml)被放置在陪替氏培养皿中，在37°C培养I小时30分让单核细胞粘附。因此，包含在非粘附细胞群中的白细胞，主要是T淋巴细胞，用它们的在有绵羊红细胞存在的情况下形成玫瑰花形的性质被纯化。随后在存在NH4Cl (8.7mg/I)的情况下通过渗透性冲击去除绵羊红细胞。最终，白细胞悬液的存活力大于95%。
[0169]随后这些白细胞被稀释在包含20%去补体人AB血清(在56°C去补体30分钟，Sigma, StLouis, Missouri, USA)的 RPMI1640 中。[0170]随后可以制备Caco2/白细胞共培养模型。为此，Caco2细胞培养插入单元在RPMI1640培养基中洗两次，并转移到一个包含RPMI培养基的6 —孔培养平板中，其中孔已经提前涂有毯状物的新近纯化的白细胞(2X IO6细胞/ml)。因此，白细胞在基底层和Caco2细胞在顶端层。
[0171]根据如下所述的条件对具有益生菌的Caco2/白细胞(外周血白细胞)共培养物进行刺激:
[0172]如此，lX107cfu/ml的益生菌被从顶端加入。单独的培养基作为阴性对照。在共培养物刺激6到36小时(37°C，10%C02)后，从基底侧收集调理培养基。
[0173]Lactobacillusparacasei,特别是在 CNCM 以编号 N0.CNCM1-2116 保藏的菌株，被特别用作益生菌。
[0174]实施例2:屏障功能的效果
[0175]按照实施例1获得的调理培养基，但在用IO8Cfu副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)刺激16小时后,与EpiskirT重建皮肤接触6天,在该模型阶段,模型继续增殖。
皮肤的这种生成EpiskinK模型的屏障功能之后被研究。
[0176]草案
[0177]在D6接受Episkin试剂盒，然后根据五个条件在增殖阶段培养直到D13。
[0178]1、常规的均jiskin?条件(条件A):用Episkin?.分化培养基从D6到D13处理。
[0179]Episkin 分化培养基是 RoguetR、CohenC、DossouKG、RougierA 所记载的:Episkin,用于体外评定局部施用化合物刺激性的重建的人类表皮(Toxicol in vitrol993:8:283 — 291)。
[0180]2、阴性对照(条件B):用30 %阴性对照培养基从D6到D13处理(调理培养基源自Caco2 / PBMC 培养 16 小时)。
[0181]3、阳性对照(条件C):用30%调理培养基Caco2 / PBMC+益生菌(副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei) CNCM1-2116+ 乳双歧杆菌(Bifidobacterrium lactis)NCC2818 (也表示为 Bbl2ATCC27536))从 D6 到 D13 处理。
[0182]因此，试剂盒在D14被接收在培养基上。之后培养基用测试培养基替换(它的构成与分化培养基相同，仅用5% FCS替换10%胎牛血清(FCS))在培养箱中37°C下培养24小时。
[0183]之后，该测试培养基用1.5ml的PBS+0.25%(w/w)吐温80替换，并在使用前在32°C下稳定I小时。fEpiskinH式剂盒以它们的单位使用。
[0184]条件A、B、C对于每一个Episkin,批次都在6孔中测试研究。
[0185]化合物2-硝基-对-亚苯基-二胺(染料)的渗透作用在不同的处理后被研究。
[0186]实验条件
[0187]测试按照以下步骤执行:
[0188]i )配制剂:在含染料5mM (I部分)的配方和缓冲液，PH9.5 (I部分)间的混合物。
[0189]染料在配制剂中的最终浓度:lmM的初始原料。
[0190]
【权利要求】
1.用于改善皮肤或头皮的皮肤动态平衡和/或屏障功能和/或湿度的美容方法，其特征在于:至少一种细胞培养基或至少一种培养基提取物被用在皮肤或头皮上，所述培养基能够通过与至少一种消化道细胞培养物和至少益生菌微生物接触获得，其中所述消化道细胞为肠道上皮细胞，且所述至少一种益生菌微生物选自乳杆菌属和双歧杆菌属种。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的培养基可以通过另外与外周血细胞接触获得。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于:外周血细胞为白细胞。
4.前述权利要求中任意一项所述的方法，其特征在于:消化道细胞的培养物是三维培养物。
【文档编号】A61Q19/10GK103462876SQ201310412365
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2008年2月25日 优先权日:2007年2月26日
【发明者】A.古尼切 申请人:莱雅公司