专利名称：：一种结核分枝杆菌全基因组orf克隆文库的构建方法及应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于微生物基因工程
技术领域：
。具体涉及一种构建结核分枝杆菌全基因组ORF克隆文库的方法及应用。
背景技术：
：结核病是由结核分枝杆菌引起的一种世界性的传染病，也是单一致病菌感染导致死亡率最高的疾病，目前全世界每年新增结核病患者8001000万，每年死亡人数约200万(WorldHealthOrganization(2008)WHOR印ort2008GlobalTuberculosisControl.)，它是全球重点控制的传染病之一。蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用，结核分支杆菌也不例外。所以，系统地研究结核分支杆菌的蛋白质与蛋白质之间的相互作用不仅可以为全面了解结核分枝杆菌蛋白质之间的生理活动的关系提供依据；更重要的是，为揭示结核病的致病机理，寻找药物靶标及抗结核药物的研发提供理论基础。研究蛋白质间相互作用的方法已有很多，如线晶体衍射、表面等离子共振、免疫共沉淀、交联技术、蛋白质探针、噬菌体展示、双杂交技术等。细菌双杂交技术(Dove,S丄.，andHochschild,A.(2004)Abacterialtwo-hybridsystembasedontranscriptionactivation.A/ef/zoc/sA/b/261:231-246.)是一禾中用于体内研究蛋白质之间相互作用的分子生物学的有力工具。细菌双杂交的原理是在大肠杆菌中，如果相互作用的蛋白一个通过DNA结合域与DNA结合，另外一个与细菌RNA聚合酶(RNAP)的亚单位结合，那么只要其相互作用具有足够的强度便能够激活转录。因此，如果把"诱饵(Bait)"与序列特异性的DNA结合蛋白融合，而把"靶(prey)"与细菌RNAP的一个亚单位融合，那么"诱饵"与"靶"的相互作用便可以在启动子处征募RNAP并稳固其结合，激活报告基因的转录(Dove,S.L.，等，(1997)Activationofprokaryotictranscriptionthrougharbitraryprotein-proteincontacts.Atowe386:627-630.)。在该系统中，DNA结合蛋白通常为入噬菌体抑制剂(入cl)，而RNAP亚单位一般为a亚棊，报告基因可以是编码e内酰氨酶的bla和e半乳糖苷酶lacZ基因，也可以是参与组氨酸生物合成途径的HIS3基因和链霉素抗性基因aadA，但是后者具有筛选更大文库的能力(108以上)和更低的假阳性率(3乂10-8)。近年来，细菌双杂交技术已应用于病原微生物基因产物功能和致病机制研究(Malek，丄A""a/,(2004)Proteininteractionmappingonafunctionalshotgunsequenceof及;c;b他z'a'6/ric<2.A^c/eZc爿cz'必32:1059-1064.)。目前，已有文献报导通过细菌双杂交筛选的方法发现了结核分枝杆菌中一些蛋白质与蛋白质之间的相互作用(Baulard,A.R.等，(2003)InvivointeractionbetweenthepolyprenolphosphatemannosesynthasePpmlandtheintegralmembraneproteinPpm2fromMycobacteriumsmegmatisrevealedbyabacterialtwo-hybridsystem.J"CAeOT278:2242-2248.,Kruh，N.A.等'(2008)AnovelinteractionlinkingtheFAS-IIandphthioceroldimycocerosate(PDIM)biosyntheticpathways.J5z'o/C/e附283:31719-31725.，；Klepp,L.I.,等，(2009)IdentificationoftwoproteinsthatinteractwiththeErpvirulencefactorfromMycobacteriumtuberculosisbyusingthebacterialtwo-hybridsystem.5MCMo/历o/10:3.)。在他们研究中所用到的细菌双杂交克隆文库是由随机打断的结核分枝杆菌H37Rv的基因片段构成的，其缺陷是不能保证所克隆基因的完整和正确表达，随机性高，给筛选工作带来了极大的不便，特别是一些重要的蛋白质与蛋白质之间的相互作用可能被疏漏。
发明内容本发明的目的是构建一种结核分枝杆菌H37Rv全基因组0RF的细菌双杂交克隆文库，利用该文库进行细菌双杂交筛选，用于研究结核分枝杆菌蛋白质之间的相互作用，为揭示结核病的致病机理，寻找药物耙标及抗结核药物的研发提供实验依据和方法。本发明的技术方案如下为了实现本发明，申请人改造了一个适用于构建结核分枝杆菌H37Rv全基因组0RF的细菌双杂交克隆载体pTRG-MCMA，利用PCR方法扩增结核分枝杆菌H37Rv全部编码基因，并将全部编码基因克隆到细菌双杂交克隆载体pTRG-MCMA,转化到大肠杆菌DH10B宿主细胞中，最终构建得到完整的结核分枝杆菌H37Rv的细菌双杂交克隆文库。利用该文库进行了初步的细菌双杂交筛选，筛选结果证明了该文库可以有效地用于研究结核分枝杆菌H37Rv蛋白质与蛋白质之间的相互作用。本发明的步骤是1)结核分枝杆菌H37Rv全部编码基因的扩增根据GenBank提供的结核分枝杆菌H37Rv基因组序列(GenBank登录号AL123456),对全部编码基因内部的酶切位点进行分析，选择所有编码基因内部没有的酶切位点作为引物设计时的酶切位点。在设计引物时将所有基因分为六类，前五类基因分别在上游引物和下游引物中引入五coRI和;ftal、Wofl禾口jaal、五coRI和；^01、M^I禾口^zo1、5awHI和J^01，第六类采用连接头的方法在接头内引入feoRI酶切位点，在下游引物内引入J力al酶切位点，利用聚合酶链式反应(PCR)对全部编码基因进行扩增。利用这种方法就可以扩增结核分枝杆菌H37Rv全部编码基因。2)构建细菌双杂交克隆载体pTRG-MCMA将购于invitrogen公司的细菌双杂交载体pTRG(登录号GI:13958039)上211位的JSaI酶切位点消除，而保留1076位的Jaal酶切位点，获得一个中间载体pTRG-ZkilA。在多克隆位点引入极端嗜热古菌S.so/々ton'citf微型染色体维持基因MCM基因(登录号GI:1589"7676)基因片段，其长度为2061bp。我们将童组质粒命名为pTRG-MCM。由于在MCM基因内部存在两个5amHI限制性内切酶识别位点，它们影响了载体的应用，所以把pTRG-MCM质粒用5amHI充分酶切'形成缺失844个碱基的线性片段，随后将该片段经进一步削平处理后自连环化形成pTRG-MCMA'其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示。3)结核分枝杆菌H37Rv细菌双杂交文库构建将步骤1)获得的结核分枝杆菌H37Rv全部编码基因精确克隆到步骤2)细菌双杂交载体pTRG-MCMA中，转化大肠杆菌DH10B，获得结核分枝杆菌H37Rv全基因组ORF的细菌双杂交克隆文库。更详细的技术方案及其应用参见《具体实施方式》所述。序列表SEQIDNO:1是本发明制备的细菌双杂交载体pTRG-MCMA的核苷酸序列；图l本发明的技术流程图2细菌双杂交载体pTRG-MCMA的构建流程图；'图3细菌双杂交载体pTRG-MCMA的载体图谱；图4部分编码基因PCR扩增后的电泳图；图5分组混合纯化的PCR产物电泳图；图6分组混合重组质粒电泳图。具体实施例方式在本发明的实施例中所用到的生物材料和试剂来自下列描述1、菌株和质粒灭活的结核分枝杆菌H37Rv菌株由武汉结核分枝杆菌研究所(湖北省武汉市)周金海教授惠赠，大肠杆菌DH10B购于invitrogen公司，细菌双杂交报告菌株(BacterioMatclAltwo-hybridreporterstrain)及细菌双杂交载体pBT、pTRG购于stratagene公司。2、主要试剂'限制性内切酶、T4DNA连接酶、EXTaq聚合酶、Klenow片段、MungBeanNuclease购于宝生物工程(大连)有限公司，dNTTP购于promega公司。引物及测序由上海英俊公司完成。DNA回收试剂盒购于BioFlux公司。实施例l:细菌双杂交pTRG载体的改造将购于invitrogen公司的细菌双杂交载体pTRG(登录号GI:13958039)上211位的JSal酶切位点消除，保留1076位的J^al酶切位点，获得一个中间载体pTRG-^&alA。在多克隆位点引入极端嗜热古菌S.TO//aton'CW5微型染色体维持基因MCM基因(登录号GI:15897676)基因片段，长度为2061bp。将重组质粒命名为pTRG-MCM。由于在MCM内部存在两个及wnHI限制性内切酶识别位点，它们影响了该载体在构建克隆文库时的应用，所以把pTRG-MCM质粒用5awHI充分酶切，形成缺失844个碱基的线性片段，随后该片段经进一步削平处理后自.连环化形成pTRG-MCMA，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:l所示。具体还包括下列具体步骤1)pTRG载体用力al部分酶切；反应体系载体30ul;观:2u1;10倍bufferH:5u1;0.1%BSA:5"1;ddH20:8ul。37。C孵育3h。2)琼脂糖凝胶回收4.4kb酶切片段；3)用Klenow片段37。C孵育20min;反应体系载体41ul;d(CTP+TTP+ATP):2u1;Klenowfragment:2y1;Buffer:5ul。4)用上述的DNA回收试剂盒回收载体；5)用MungBeanNuclease37。C孵育10min;载体43U1;MungBeanNuclease:2u1;Buffer:5u1。6)用上述的DNA回收试剂盒回收载体；7)载体自连；载体6ul;T4DNAligase:lu1;Buffer:lpl;ddH20:2ul。反应条件16°C过夜。获得中间载体pTRG-力alA。8)pTRG-J^alA载体用￡coRI和Wol双酶切；反应体系载体30ul;五coRI:1.5ul;為l:1.5yl;10XMBuffer:5u1;0.1%BSA:5ul;ddH20:7ttl。反应条件37°C3h9)琼脂糖凝胶回收载体；10)PCR扩增MCM基因片段；反应体系lOxExBuffer5.0nl;2.5mMdNTP4.0(il;正向引物2.0nl;反向引物2.0ul;S.so总DNA1.0u1;ExTaq聚合酶0,3u1;补ddH20至50.0u1。反应程序94°C3min;94°C1min，52°C1min，72°C2min，30个循环；72°C8min。扩增MCM的引物为正向引物GAGCGAATTCGTTGGAMTTCCTAGTAAAC(划线部分为￡boM酶切位点)，反向引物GGATGGCTCGAGTCTAGACTAGACTTTTTTGTMCAT(划线部分为酶切位点)11)MCM基因片段用五coRI和J^ol双酶切；反应体系MCM:30lU;五coRI:1.5pi;扁I:1.5ul;10XMBuffer:5ul;0.1o/oBSA:5u1;ddH20:7yl。反应条件37°C3h12)双酶切后的中间载体pTRG-JKalA与MCM连接；反应体系pTRG:3vil;MCM:3y1;T4DNAligase:lu1;Buffer:lul;ddH20:2ul。反应条件16°C连接过夜。得到中间载体pTRG-MCM。13)中间载体pTRG-MCM用5"wHI充分酶切；14)用5鹏HI充分酶切的中间载体pTRG-MCM末端削平并自连，获得细菌双杂交载体pTRG-MCM△,其大小为5592bp。细菌双杂交载体pTRG-MCMA的构建流程图见图2,pTRG-MCMA的载体图谱见图3，pTRG-MCMA载体序列见序列表SEQIDNO:1。实施例2:结核分枝杆菌H37Rv全基因组0RF的扩增根据GenBank提供的结核分枝杆菌H37Rv基因组序列(GenBank登录号AL123456)，对全部编码基因内部的酶切位点进行分析，选择所有编码基因内部没有的酶切位点作为引物设计时的酶切位点。在设计引物时将所有基因分为六类，前五类基因分别在上游引物和下游引物中引入&oRI和Jftal、A^I禾B;aal、feoRI和Wo1、TVort禾口WoI、SawHI和Wo.I酶切位点，第六类采用连接头的方法在接头内引入5boRI酶切位点，在下游引物内引入酶切位点。利用这种引物的设计方法就可以扩增结核分枝杆菌H37Rv全部编码基因。举例如下依据NCBI公布的Rv0001序列(登录号GI:15607143)设计引物Rv0001fATAAGCGGCCGCATTGACCGATGACCCCGGTTC(划线部分为Wotl酶切位点)Rv0001rCGACGTCTAGAGGCTAGCGCTTG6AGCGCTGAC(划线部分为幼al酶切位点)依据NCBI公布的Rv0002序列(登录号GI:15607144)设计引物Rv0002fATAAGAATTCGGATGGACGCGGCTACGACAAG(划线部分为EcoRI酶切位点)Rv0002rATAATCTAGAATTCAGCCCGGCAACCGAACCG(划线部分为Xbal酶切位点)依据NCBI公布的Rv0221序列(登录号GI:1871594)设计引物Rv0221fATAAGGATCCGAGTGAAACGGCTCAGCGGCTG(划线部分为SamHI酶切位点)Rv0221rATAACTCGAGAATCATGCCTGCGCCATCGCGG(划线部分为Xhol酶切位点)依据NCBI公布的Rv0104序列(登录号GI:15607246)设计引物Rv0104fATAAGAATTCAAGTGACGCCCGTCACAACGTT(划线部分为EcoRI酶切位点)Rv0104rATAACTCGAGGGTTACACCATCAAGGACTCGG(划线部分为Xhol酶切位点)依据NCBI公布的Rv0469序列(登录号GI:57116735)设计引物Rv0469fACAAGCGGCCGCAGATGACTGAGTTAAGGCTT(划线部分为Wotl酶切位点)Rv0469rATAACTCGAGAACTACTTGGTCAGTGTGAACT(划线部分为Xhol酶切位点)以MTBH37Rv基因组DNA为模板，PCR反应条件为96。C5min;恥。Clmin;60°Clmin;72°C3min，30个循环;72°C7min。反应体系为，2xGCBufferI25pl;2.5mMdNTP8)J;上游引物下游引物lpl;模板2pl;ExTaq0.6^1;加dcP2O补至50nl。部分编码基因PCR扩增后的电泳图见图4，混合纯化的基因产物电泳图见图5。实施例3:结核分枝杆菌H37Rv全基因组ORF细菌双杂交克隆文库的构建将实施例2所述的分为六类的基因扩增产物混合分别与相对应的酶切组合制备的pTRG-MCMA载体连接，16"C连接过夜。将连接产物脱盐后电转化到大肠杆菌DH10B电转化感受态中(转化条件1800V，4-6mS)，获得大于12,000个重组克隆，即基因覆盖率达到3倍以上。将含有重组克隆的菌株(大肠杆菌DH10B)混合培养，按照常规报道的方法抽提质粒，将得到的甘油菌和质粒保存于-2(TC。分组混合重组质粒的电泳图参见图6。实施例4:结核分枝杆菌H37Rv全基因组0RF细菌双杂交克隆文库的应用用实例3中获得的克隆文库的混合质粒转化细菌双杂交报告菌株(BacterioMatchIITwo-Hybridr印orterstrain)，制备电转化感受态。选择感兴趣的诱饵基因，现以结核分枝杆菌H37Rv基因Rv3874(登录号GI:15611010)为例说明发明的步骤。具体步骤如下将Rv3874克隆到双杂交pBT载体上，重组质粒命名为pBT-Rv3874。按照常规电转化的方法(转化条件1800V,4-6mS)用重组质粒pBT-Rv3874转化克隆文库感受态，添加800nlS0B培养基复苏45分钟，涂于细菌双杂交筛选平板(筛选培养基成分组成见BacterioMatchIItwo-hybridsystemlibraryconstructionkit)将平板倒置于30。C培养箱培养3-4天，可在平板上看见6个单菌落。将单菌落接种于LB液体培养基中(添加终浓度为30ng/ml卡那霉素、34pg/ml氯霉素、12.5pg/ml四环素)，37'C培养16h后收集菌液测序。测序结果经序列比对分析鉴定为Rv3875、Rv3871两个基因。〈110〉华中农业大学〈120〉一种结核分枝杆菌全基因组ORF克隆文库的构建方法及应用<130><141>2009-03-11<160>1<170〉Patentlnversion3.1<210>1<211>5592<212>DNA〈213>大肠杆菌(Escherichiacoli)<220><221〉gene<222〉(1)..(5592)<223><400>1g犯ttgagcgataagtgccttcccatc犯acaacataaaa60aactttgtgttatacttgt8acgctacatgg8gattaactcaatcteigct'卿gaggctt120tacactttatgcttccggctcgtataatgtgtgg组tgtg3gCgg6t她caatttcaca180c^igg肌acagctatgaccatg"tacggattcactggaactctaaccaaagag3gg3C3C240tctgtgacagagtttct犯aaccgcgcctggttgatatcgagcaagtgeig300ttcgacgcacgcc鄉gtgscccttgagccttt卿gcgtggctttggccatactctggg360t朋cgcactgcgccgtattctgctctcatcgstgccgggttgcgcggtga>ccgaggttga420g3ttg3tggtgtoctacatgagtacagcacc犯ag肌ggcgttc鄉卿atatcctgga480aatcctgctcaacctgaaagggctggcggtg卿gttC3gggc犯卿tgaagttattct540taccttgaataaatctggcgittggccctgtgactgcagccgatatcaccc3Cg3Cggtg3600tgtcgaaatcgtc肌gccgcagcacgtgatCtgCCELCCtgELCCg3tgag3acgcgtctat660t柳3tgCgtatca^3gttcagcgcggtcgtggttatgtgccggcttcta.cccgagttca720ttCgg6L8g犯gatgagcgccc犯tcggccgtctgctggtcgacgcatgctacagccctgt780gg卿gt8ttgcctacaatgUgaagcagcgCgtgt卿3cagcgtaccgacctggacaa840gctggtcatcccaacggcacaatcgatcctg卿3ggCg3ttcgtcgtgc900ggcaaccattctggctgaaca^ctgg^gctttcgttgacttacgtgatgtacgtcagcc960tgaagtgaaac,ggcggccggatccgcggccgcaag肌ttcatttgga1020aattcctagtcgtatttatagagtttctgacaactttcaa1080gggtaac犯taatcaaaacaaatatatcgag8gctagtsgcgt3tagg331140aaaaagtctttttctgatgtactttcgttctggcttatga1200aataccaaaattattctaccaattctggaaggtgcattgt1260cttgc犯ttgcacagctgcaggttt犯cagctgctgtagtaagaga肌agggaactggag1320agtattactt卿鄉tggtgcgttagtacttgctgatggtgg犯tagc3gtteittga^tg1380gatg娜gatg3卿t卿gtagaccattc3tg3ggC犯tggaacaacag1440tggaatagtagctaaatteLaacgctagggctgcagtteto1500gctgcagggacggg卿tecgaccagtgtc1560aacctacctccaacaatcttgtcMgatttgacctaatatggatcaacca1620ggtga,agtgcga^ttoc1680aaaaatattacatatgcaagg￡L￡LgLtSLCgtt1740ttactagtgaggctaag33tctg^ttacagatttcttcgt1800犯ga^犯gctC3g3犯CgLCCtgatagcccsatattgataactcca^gac3attagaggct函tt肌t犯gaatttcagaagcctatgccaagatggctctta鄉ctgaagtC3ctag3gaa1920gatgcagaaacttttcctag卿gtgt3ggELgttg3lt6Ltg1980g咖gtggaaatgactggta犯ccta幼ag2040agtttagctg:taagttctgagtgcgc犯朋2100gt加gg8C3agctcaacaagtaggcattg2160ttacttacaggagtggtataat3tatg犯gatgttaca犯2220aaagtctagctcgagtaatttgaactagtgagatcctctaagtcgacctg2280caggcatgca3gCttggC3gtttatggcgggcgacgaatcaggtggcacttttcgggg犯2340atgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattc犯atatgtatccgctca2400tgaccaaaatcccttaacgtgsgUUcgttccactgagcgtcagacccc2460tc犯8gg^tcttcttgagatcctttttttctgcgcgt犯tctgctgcttg2520aaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatc朋gagctaccaactctttttccga2580aggtaactggcttcagcagagCgC3g3t3Cc朋atactgtccttctagtgtagccgtagt2640taggccaccacttcaag肌ctctgt兆caccgcctacatacctcgctctgctaatcctgt2700taccagtggctgctgccagtcgtgtcttaccgggUggsctc肌gacgeit27603gtt3CCgg3恤ggcgcagcggtcgggctg肌cggggggttcgtgcacacagcccagct2820tggagcg3ax;gacctacaccg犯ctga^t3cctacagcgtga^gcteitgaga犯gcgcca2880cgcttcccgagcggac鄉tatccggtaagcggcagggtcggaacsggag2940柳gC3Cg3gggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttc3000gccacctctgax:ttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtc鄉ggggcggagcctatgga3060aa^3cgcc3gcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcaca3120tgttctttcctgcgttetcccctgattctgtggataaccgtattaccgccUtgagtgag3180ctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcgLgtgagcgagg卿cgg3240aagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatat3300ggtgcactctcagtac犯tctgctctgatgccgceitagttaagccagtatacactccgct3360atcgctacgtg3CtgggtC3tggctgcgccccgacacccgcca^cacccgctgacgcgcc3420ctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggag3480ctgcatgtg"tcagaggttttCELCCgtCatCgcg鄉c柳"tgcggta卿3540ctcatcagcgtggtcgtgaiagcgattcaceigatgtctgcctgttcatccgcgtccagctc3600gttgagtttctccagaagcgttsa/tgtctggcttctgata卿CgggCC3tgtteagggc3660ggttttttcctgtttggtcactgatgcctccgtg恤gggggatttctgttC3tgggggt3720aatgataccgatg犯acgag卿gg3tgctcacgatacgggtt8Ctg3tgatg犯catgc3780ccgg"ttactgg咖gttgtgagggta犯caactggcggtatggatgcggc'gggaccagag3840gccagcgcttgatgteggtgttccacaggg3900t8gCC8gC3gC3tcctgcgatgcagatccggtgc鄉gcgctgacttccg3960cgtttccagactttacgaaacacgga肌cccatgttgttgctcaggtcgc4020卿cgttttgcagcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgcta4080c犯ccccgccagcctagccgggtcctceiacCg8tC8tgCg4140cacccgtggcC8Lgg￡LCCC￡L￡LCgCtgCCCg2Lgatgcgccgcgtgcggctgctgg卿tggc4200ggacgcgatggatatgttctgccaagggttggtttgcgcattcacagttctccgcaagaa4260ttgattggctcc犯ttcttggsgtggtg犯tccgttagcgaggtgccgccggcttccatt4320C鄉tCg8ggtggcccggctccatgcaccgcgacgcaacgCgggg8ggC3gacaaggtat4380郷gcggcgcctacaatccatgccaacccgttccatgtgctcgccgaggc'ggc3ta犯tc4440gccgtgacgatcagcggtcc犯tg3tCg犯gtt郷ctggt犯gsgccgcgeigcgatcct4500t卿gctgtccctgatggtcgtcatctacctgcctggacagcatggcctgcaacgcgggc4560atcccgatgccgccgg卿cgsgaag犯tc3t犯tgggg3aggccatccagcctcgcgtc4620gcg犯cgccagc犯gacgtagcccsgcgcgtcggccgccatgccggcgataatggcctgc4680ttctcgccgaaacgtttggtggCggg腦3gtg8Cg卿gcttgagcgagggcgtgc犯g4740attccg33taCCgC33gCg3C3ggCCg3tC3tcgtcgcgc'gcggtcctcg4800CCC8LgELgCgCtgCCggC3CCtgtcctacgag"ttgcatgataaag￡L￡Lg￡LC￡L4860gtcataagtgcggcgacgatagtcatgccccgcgcccaccgg卿gagctgactgggttg492011<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>权利要求1.一种用于构建结核分枝杆菌H37Rv全基因组ORF克隆文库的细菌双杂交载体pTRG-MCMΔ，其特征在于，它是通过以下步骤获得的1)将购于invitrogen公司的细菌双杂交载体pTRG上211位点的XbaI酶切位点消除，获得一个中间载体pTRG-XbaIΔ；2)将步骤1)获得的中间载体pTRG-XbaIΔ用限制性内切酶EcoRI和XhoI进行消化；3)利用极端嗜热古菌S.solfataricus的微型染色体维持基因MCM作为一个媒介基因，通过PCR的方法获得两末端分别含有EcoRI和XhoI酶切位点的MCM媒介基因；4)将步骤3)获得的MCM媒介基因用限制性内切酶EcoRI和XhoI进行消化；5)将步骤2)获得的中间载体pTRG-XbaIΔ和步骤4)获得的MCM媒介基因在16℃的条件下连接过夜，得到中间载体pTRG-MCM；6)将步骤5)获得的中间载体pTRG-MCM用限制性内切酶BamHI充分酶切；7)将步骤6)酶切后的中间载体pTRG-MCM末端削平并自连接，获得改造的细菌双杂交载体pTRG-MCMΔ，其大小为5592bp，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所示。其中，步骤3)利用PCR扩增的MCM基因的引物对的序列如下所示正向引物GAGCGAATTCGTTGGAAATTCCTAGTAAAC；反向引物GGATGGCTCGAGTCTAGACTAGACTTTTTTGTAACAT。2.根据权利要求1所述的细菌双杂交载体pTRG-MCMA,其特征在于，它包含一个适合于克隆结核分枝杆菌H37Rv所有编码基因的多克li位点。3.—种构建结核分枝杆菌H37Rv全基因组ORF克隆文库的方法，其特征在于获得克隆文库的步骤如下1)利用PCR方法获得结核分枝杆菌H37Rv的全部编码基因；2)将步骤1)获得的结核分枝杆菌H37Rv全部编码基因精确克隆到权利要求1的细菌双杂交载体pTRG-MCMA中，转化大肠杆菌DH10B,获得结核分枝杆菌H37Rv全基因组ORF的细菌双杂交克隆文库。全文摘要本发明属于微生物基因工程
技术领域：
，具体涉及一种结核分枝杆菌H37Rv全基因组ORF细菌双杂交克隆文库的构建方法及应用。本发明的特征是，制备了一个适用于构建结核分枝杆菌H37Rv全基因组ORF克隆文库的细菌双杂交载体pTRG-MCMΔ，利用PCR反应获得结核分枝杆菌H37Rv的全部编码基因，通过将结核分枝杆菌H37Rv的全部编码基因精确克隆到本发明构建的细菌双杂交载体pTRG-MCMΔ中，转化大肠杆菌DH10B，得到结核分枝杆菌H37Rv全基因组ORF细菌双杂交克隆文库。文档编号C40B50/06GK101538581SQ20091006106公开日2009年9月23日申请日期2009年3月11日优先权日2009年3月11日发明者何正国,毅王申请人:华中农业大学