专利名称：一组具有抗神经细胞凋亡功效的化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一组具有抗神经细胞凋亡功效的化合物，具体地说是从远志植物中提取、分离的酚酮及皂苷类化合物。
背景技术：
远志为常见中药材，始载于《神农本草经》，列为上品，被视为养命之要药。《中国药典》(2000版)收载了2种基源植物远志Polygala tenuifolia和卵叶远志P.sibirica，其药用部位为根。本品味苦、辛、温，归心、肾、脾经，具有安神益智、祛痰、消肿等功效(国家药典委员会编，中华人民共和国药典一部，2000123)。
据报道，远志中主要含有酮类、糖酯类、皂苷类及生物碱等成分(姜勇等.中草药，32(8)759，2001；Phytochemistry，2002，60(8)813；中草药，2002，33(10)874)。但是关于其活性成分的研究报道却很少。
发明内容
本发明的目的在于通过多种提取、分离手段，进一步从远志植物中提取、分离出新的具有益智和抗老年痴呆作用的活性单体化合物。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的利用多种提取、分离手段，包括溶剂提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、正反硅胶柱层析、sephadex LH-20柱层析和制备HPLC等方法，系统研究了远志的化学成分。从中分离得到了50多个化合物，其中新化合物19个，具有活性的单体5个，分别为远志酚酮类化合物C，具有结构式I所示结构 结构式(I)
远志酚酮类化合物D，具有结构式II所示结构 结构式(II)远志皂苷类化合物L，具有结构式III所示结构 结构式(III)其中，R1＝ 或
远志皂苷类化合物J，具有结构式IV所示结构 结构式(IV)其中，R2＝ 或
远志皂苷类化合物K，具有结构式V所示结构 结构式(V)其中，R3＝ 或 上述5种化合物是由如下的方法制备的将远志根皮粉碎后用95％ EtOH回流提取，减压回收溶剂，得到固体浸膏。将此固体浸膏悬浮于水中，依次用石油醚、氯仿和正丁醇萃取。
将氯仿萃取物经硅胶柱层析，使用CHCl3-MeOH作为洗脱液，收集在石油醚-丙酮(7∶1)中展开，Rf位于0.2左右，且斑点在UV灯下呈现桔红色的流份，将此流份浓缩后依次经羟丙基葡聚糖凝胶(sephadex LH-20)纯化(用甲醇洗脱)和硅胶柱层析(用石油醚-丙酮洗脱)，收集在石油醚-丙酮(7∶1)中展开，Rf位于0.23的流份，经丙酮重结晶得到化合物远志酚酮D(tenuiphenone D)；收集在石油醚-丙酮(7∶1)中展开，Rf位于0.21的流份，经丙酮重结晶得到化合物远志酚酮C(tenuiphenoneC)。
将正丁醇萃取物溶解于水中，上大孔树脂D101，分别用H2O、20％ EtOH、50％ EtOH及70％ EtOH进行洗脱，得到的各洗脱液分别浓缩、冻干。取50％ EtOH洗脱物，经硅胶柱层析，CHCl3-MeOH-H2O洗脱，收集对硫酸显紫红色的皂苷斑点的流份；然后经ODS柱(C18烷基反相硅胶)分离，使用MeOH-H2O洗脱，收集在n-BuOH∶HCOOH∶H2O(60∶3∶37上层)中展开，Rf在0.30-0.58之间的流份；然后再经减压硅胶柱层析分离，使用n-BuOH-EtOAc-H2O(4∶1∶2)的上层为洗脱液进行洗脱，收集在n-BuOH∶HCOOH∶H2O(60∶3∶37上层中展开，Rf在0.30，0.37和0.55的流份；最后各流份经HPLC纯化，MeOH∶H2O(61∶39，H2O中含0.05％ TFA)为流动相，流速3ml/min，分别收集保留时间为30min，48min及60min的流份，得到的各流份经减压回收溶剂，冷冻干燥即得各个化合物，经IR、NMR及MS测定为远志皂苷类化合物L(onjisaponin L)，远志皂苷类化合物J(onjisaponin J)和远志皂苷类化合物K(onjisaponin K)。
本发明提供的5个化合物，经活性测定实验表明，具有抗神经细胞凋亡的功效，可以用于制备益智和抗老年痴呆作用的药物。
具体实施例方式
实施例1、化合物的制备将远志根皮11kg粉碎后用95％ EtOH 70L回流提取3h，共提取3次。减压回收溶剂，得到固体浸膏4.91kg。取2kg浸膏悬浮于水中，依次用石油醚、氯仿和正丁醇萃取。
将氯仿萃取物经硅胶柱层析，使用CHCl3-MeOH(体积比为500∶1到60∶40)作为洗脱液梯度淋洗，其中CHCl3-MeOH体积比90∶10时洗脱的流份在石油醚-丙酮(7∶1)中展开，Rf位于0.2左右，且斑点在UV灯下呈现桔红色，收集此流份，将此流份浓缩后依次经羟丙基葡聚糖凝胶(sephadex LH-20)纯化(用甲醇洗脱)和硅胶柱层析(用石油醚-丙酮洗脱)，收集在石油醚-丙酮(7∶1)中展开，Rf位于0.23的流份，得到远志酚酮类化合物D(tenuiphenone D)24.1mg；收集在石油醚-丙酮(7∶1)中展开，Rf位于0.21的流份，得到远志酚酮类化合物C(tenuiphenone C)15.3mg。
远志酚酮C，类白色固体(丙酮)，mp 197-200℃。HR SI-MS(positive)m/z559.4724(C36H63O4[M+H]+，requires 559.4721，581.4540[M+Na]+。IR νmaxKBrcm-13281(-OH)，2918，2850(-CH2，-CH3)，1657(共轭-C＝O)，1602，1525，1469(芳环)，720(-(CH2)n，n≥4)。EI-MS(m/e)43[C3H7]+，57[C4H9]+，71[C5H11]+，97[C5H11-CH＝CH-]+，111[C5H11-CH＝CH-CH2]+...，153[C7H5O4]+，168[C8H7O4+H]+，181[C9H9O4]+...。1HNMR(丙酮)δ11.81(2，6-OH)，9.14(4-OH)，5.90(2H，s，H-3，5)，5.33(2H，t，J＝4.8Hz，H-24)，3.05(2H，t，J＝7.5Hz，-COCH2-)，2.04(m，-CH2CH＝)，1.65(2H，m，-COCH2CH2-)，1.27(brs，-CH2-)，0.87(3H，t，J＝6.9Hz，CH3)。13C NMR(丙酮)δ206.33(-CO-，overlapped)，164.27，165.40(C-2’，5’，4’，信号之间可以互换)，95.69(C-3’，5’)，130.44(C-24，25)，44.39(-CH2CO)，32.53，30.57-29.03，27.69，25.44，23.23(-CH2-)，14.31(-CH3)。
远志酚酮D，类白色固体(丙酮)，mp 197-200℃。HR SI-MS(positive)m/z587.5057(C38H67O4[M+H]+，requires 587.5034)，609.4823[M+Na]+。IR νmaxKBrcm-13285(-OH)，2918，2850(-CH2，-CH3)，1659(共轭-C＝O)，1603，1525，1472(芳环)，720(-(CH2)n，n≥4)。EI-MS(m/e)43[C3H7]+，57[C4H9]+，71[C5H11]+，97[C5H11-CH＝CH-]+，111[C5H11-CH＝CH-CH2]+...，153[C7H5O4]+，168[C8H7O4+H]+，181[C9H9O4]+...。1HNMR(丙酮)δ11.70(2，6-OH)，9.14(4-OH)，5.91(2H，s，H-3，5)，5.35(2H，t，J＝4.8Hz，H-26)，3.05(2H，t，J＝7.5Hz，-COCH2-)，2.04(m，-CH2CH＝)，1.65(2H，m，-COCH2CH2-)，1.29(brs，-CH2-)，0.87(3H，t，J＝6.9Hz，CH3)。13C NMR(丙酮)δ206.33(-CO-，overlapped)，164.96，164.92(C-2’，5’，4’，信号之间可以互换)，95.60(C-3’，5’)，130.44(C-26，27)，44.36(-CH2CO)，32.53，30.78-29.00，27.67，25.49，23.28(-CH2-)，14.32(-CH3)。
将正丁醇萃取物溶解于水中，上大孔树脂D101，分别用H2O、20％ EtOH、50％ EtOH及70％ EtOH进行洗脱，得到的各洗脱液分别浓缩、冻干。取50％ EtOH洗脱物，经硅胶柱层析，CHCl3-MeOH-H2O洗脱，收集对硫酸显紫红色的皂苷斑点的流份；然后经ODS柱(C18烷基反相硅胶)分离，使用MeOH-H2O洗脱，收集在n-BuOH∶HCOOH∶H2O(60∶3∶37上层)中展开，Rf在0.30-0.58之间的流份；然后再经减压硅胶柱层析分离，使用n-BuOH-EtOAc-H2O(4∶1∶2)的上层为洗脱液进行洗脱，收集在n-BuOH∶HCOOH∶H2O(60∶3∶37上层中展开，Rf在0.30，0.37和0.55的流份；最后各流份经HPLC纯化，MeOH∶H2O(61∶39，H2O中含0.05％ TFA)为流动相，流速3ml/min，分别收集保留时间为30min，48min及60min的流份，得到的各流份经减压回收溶剂，冷冻干燥即得各个化合物，经IR、NMR及MS测定为远志皂苷类化合物L(onjisaponin L)，J(onjisaponin J)和K(onjisaponin K)。
远志皂苷L，白色无定型粉末，Liebermann-Burchard和Molish反应阳性。TOF-MS(m/e)1866[M+NH4]+。1H NMR(C5D5N)δ7.91(1H，d，J＝16.0Hz，H-β ofE-cinnamoyl)，6.50(1H，d，J＝15.5Hz，H-αof E-cinnamoyl)/6.87(1H，d，J＝12.5Hz，H-β ofZ-cinnamoyl)，5.95(1H，d，J＝13.0Hz，H-αof Z-cinnamoyl)；7.36(1H，d，J＝8.5Hz，H-2，6of E-cinnamoyl)，6.95(1H，d，J＝8.5Hz，H-3，5 of E-cinnamoyl)/7.97(1H，d，J＝9.0Hz，H-2，6 of Z-cinnamoyl)，7.01(1H，d，J＝8.5Hz，H-3，5 of Z-cinnamoyl)，3.65(3H，s，OCH3ofE-cinnamoyl)/3.60(3H，s，OCH3of Z-cinnamoyl)，4.90(1H，d，J＝8.0Hz，Gal-1)，5.01(1H，d，J＝8.0Hz，Glc-1)，5.18(1H，d，J＝8.0Hz，Xyl-1)，5.52(1H，brs，Rha-1′)，5.79(1H，brs，Rha-1)，6.08(1H，overlapped，Api-1)，6.07(1H，overlapped，Fuc-1)。13C NMR数据见表1。
远志皂苷J，白色无定型粉末，Liebermann-Burchard和Molish反应阳性。TOF-MS(m/e)1836[M+NH4]+。1H NMR(C5D5N)δ7.93(1H，d，J＝15.9Hz，H-β ofE-cinnamoyl)，6.50(1H，d，J＝15.9Hz，H-αof E-cinnamoyl)/6.90(1H，d，J＝12.9Hz，H-β ofZ-cinnamoyl)，6.00(1H，d，J＝12.9Hz，H-α of Z-cinnamoyl)；7.38(1H，d，J＝8.4Hz，H-2，6of E-cinnamoyl)，6.97(1H，d，J＝8.7Hz，H-3，5 of E-cinnamoyl)/8.00(1H，d，J＝8.4Hz，H-2，6 of Z-cinnamoyl)，7.03(1H，d，J＝9.0Hz，H-3，5 of Z-cinnamoyl)，3.66(3H，s，OCH3ofE-cinnamoyl)/3.62(3H，s，OCH3of Z-cinnamoyl)，5.03(1H，d，J＝7.6Hz，Glc-1)，5.16(1H，d，J＝6.9Hz，Ara-1)，5.25(1H，d，J＝7.5Hz，Xyl-1)，5.54(1H，brs，Rha-1′)，5.78(1H，brs，Rha-1)，6.04(1H，overlapped，Api-1)，6.07(1H，d，J＝7.7Hz，Fuc-1)。13C NMR数据见表1。
远志皂苷K，白色无定型粉末，Liebermann-Burchard和Molish反应阳性。TOF-MS(m/e)1623.6[M+Na]+。1H NMR(C5D5N)δ7.93(1H，d，J＝16.0Hz，H-β ofE-cinnamoyl)，6.58(1H，d，J＝15.5Hz，H-α of E-cinnamoyl)/6.85(1H，d，J＝13.0Hz，H-βof Z-cinnamoyl)，5.99(1H，d，J＝12.5Hz，H-α of Z-cinnamoyl)，6.81(2H，s，H-2，6 ofE-cinnamoyl)/7.37(2H，s，H-2，6 of Z-cinnamoyl)，3.85(3H，s，OCH3of E-cinnamoyl)/3.83(3H，s，OCH3of Z-cinnamoyl)，3.78(6H，s，OCH3of E-cinnamoyl)/3.75(6H，s，OCH3of Z-cinnamoyl)，5.04(1H，d，J＝7.5Hz，Glc-1)，5.31(1H，d，J＝7.5Hz，Xyl-1)，6.03(1H，d，J＝4.0Hz，Api-1)，6.13(1H，d，J＝8.5Hz，Fuc-1)，6.25(1H，brs，Rha-1)。13C NMR数据见表1。
表1 远志皂苷L的13C NMR数据(溶剂为C5D5N)L J K L J K1 44.0 44.144.0 C-3sugar2 69.9 70.270.6 Glc-1105.1 105.2 105.03 85.7 85.985.7 275.0 75.1 75.04 52.6 52.852.7 378.1 78.2 78.15 52.3 52.452.4 471.2 71.5 71.56 21.0 21.221.0 578.1 78.2 78.17 33.7 33.833.5 662.4 62.6 62.48 41.0 41.241.8 C-28sugar9 49.1 49.249.0 Fuc-194.8 94.8 94.210 36.8 37.036.8 276.4 76.8 75.811 23.3 23.523.9 380.1 79.7 74.312 127.5 127.7 127.6 473.2 73.2 74.713 138.8 138.9 138.7 570.7 70.9 70.614 46.8 46.946.7 616.9 16.8 16.415 24.3 24.524.2 Rha-1(F-2) 101.9 102.1 102.0/102.116 23.9 24.123.9 271.5 71.7 71.517 47.7 47.947.6 382.3 82.2 81.918 41.9 42.141.8 478.1 78.0 78.319 45.3 45.545.1 568.7 68.7 68.320 30.6 30.830.6 618.6 18.6 18.621 33.7 33.833.5 Rha-1(F-3) 104.8 104.722 32.0 32.232.1 272.1 72.123 180.8 180.9 180.9 373.2 72.724 14.0 14.114.1 472.4 73.625 17.4 17.617.2 570.8 70.726 18.9 19.118.9 618.7 18.627 64.3 64.464.4 Xyl-l104.7 104.7 105.128 176.4 176.4 176.6 275.0 74.2 75.429 32.9 33.132.8 376.3 86.2 78.330 23.9 24.123.9 478.0 69.3 71.3Cinn.564.6 66.4 67.01 127.2/127.5127.4/127.6 130.5 Api-1111.3 111.5 111.2/130.22 130.3/133.1130.4/133.2 106.1 277.3 78.0 77.6/108.93 114.6/113.9114.8/114.1 140.8 378.1 78.4 78.1/139.94 161.8/160.9162.0/161.1 153.9 474.3 74.4 74.7/153.15 114.6/113.9114.8/114.1 140.8 566.4 66.6 66.6/139.96 130.3/133.1130.4/133.2 106.1 Gal-1104.3/108.97 145.5/144.6145.6/144.7 145.8 271.7/144.28 115.5/116.2115.7/116.3 117.5 374.9/118.59 167.0/166.2167.1/166.3 167.4 470.0/166.4OMe55.2/55.0 55.4/55.1 56.1 577.3/55.9 662.256.1
/55.960.5/60.3HMG-1171.5 171.5 171.4 Ara-1105.4246.2 46.3 46.1 272.4369.9 70.0 69.9 374.5446.3 46.9 46.1 469.25174.7 174.9 174.4 567.0OMe 28.2 28.2 28.0实施例2、活性测定一、实验方法取大鼠小脑颗粒细胞，以1×106个细胞/cm3接种于预先用10mg/L的多聚赖氨酸覆盖的96孔板中，200μL/孔，置于37℃含5％(体积分数)CO2的培养箱中培养。24h后更换为含10μmol/L阿糖胞苷的培养液，以抑制非神经细胞的增殖。实验分为空白对照组、模型组和药物高、低两个剂量组，每组设6个孔。于培养第四天，药物组分别加入终浓度为40μg/L、20μg/L的药物；加药24h后，模型组和药物组分别加入终浓度为100μmol/L的MPP+，空白对照组加入等体积的培养基；37℃含5％CO2的培养箱中继续培养24h后，取出96孔板，向每孔中加入20μL 5mg/mL的MTT(终浓度为0.5mg/mL)，反应4h后，吸去培养液，向每孔中加入200μl的DMSO，轻轻吹打，使蓝色颗粒溶解，用全自动酶标仪在波长570nm处测其光密度值(OD值)。实验重复三次，光密度值高表明细胞存活数高。
二、统计学分析每组设6个复孔，结果以均值±标准差(X±SD)表示；差异显著性用配对t检验。
三、实验结果由表2数据可以看出，化合物Onjisaponin L、Onjisaponin J、Onjisaponin K、Tenuiphenone C及Tenuiphenone D对神经细胞凋亡的影响与模型组比较有显著性差异，提示这些化合物对神经细胞具有保护作用。而据现代的药理学研究表明神经细胞凋亡是导致老年性痴呆的诱因之一，由此提示这些化合物在防治和治疗老年性痴呆方面具有很好的前景。
表2 化合物对神经细胞凋亡的影响(40μg/mL，X±SD)药物名称 OD值 细胞存活率(％)空白组1.224±0.082 100模型 0.846±0.053###69.12Onjisaponin L 1.018±0.061*** 83.17Onjisaponin J 0.987 ±0.054** 80.64Onjisaponin K 0.984 ±0.082** 80.39Tenuiphenone C1.000±0.049*** 81.70Tenuiphenone D1.006±0.049*** 82.19配对t检验与空白组比较，###P＜0.001；与模型组比较，**P＜0.01，***P＜0.001本发明利用多种分离手段，包括正反相硅胶柱层析、大孔吸附树脂柱层析、羟丙基葡聚糖凝胶柱层析和制备高效液相色谱法等，从远志的植物中分离得到了5个新的化合物，包括酚酮及皂苷类化合物。这些新化合物的发现为今后进一步的药理活性筛选及临床研究，开发出疗效确切、毒副作用小的新型防治和治疗老年性痴呆药物奠定了物质基础。
权利要求
1.一种酚酮类化合物，具有结构式I所示结构 结构式(I)
2.一种权利要求1所述酚酮类化合物在制备益智和抗老年痴呆药物中的用途。
3.一种酚酮类化合物，具有结构式II所示结构 结构式(II)
4.一种权利要求3所述酚酮类化合物在制备益智和抗老年痴呆药物中的用途。
5.一种皂苷类化合物，具有结构式III所示结构 结构式(III)其中， 或
6.一种权利要求5所述皂苷类化合物在制备益智和抗老年痴呆药物中的用途。
7.一种皂苷类化合物，具有结构式IV所示结构 结构式(IV)其中， 或
8.一种权利要求7所述皂苷类化合物在制备益智和抗老年痴呆药物中的用途。
9.一种皂苷类化合物，具有结构式V所示结构 结构式(V)其中， 或
10.一种权利要求9所述皂苷类化合物在制备益智和抗老年痴呆药物中的用途。
全文摘要
本发明利用多种分离手段，包括正反相硅胶柱层析、大孔吸附树脂柱层析、sephadex LH－20柱层析和制备高效液相色谱法等，从远志的植物中分离得到了5个新的化合物，包括酚酮及皂苷类化合物。这5个化合物，经活性测定实验表明，具有抗神经细胞凋亡的功效，可以用于制备预防和治疗抗老年性痴呆作用的药物。
文档编号C07J63/00GK1631865SQ20031012241
公开日2005年6月29日 申请日期2003年12月23日 优先权日2003年12月23日
发明者姜勇, 屠鹏飞 申请人:北京大学